Article de méthode

Multiplexage et transfection d'ADN à haut débit à l'aide de la technologie de nanodispensation acoustique

DOI :

10.3791/59570

⸱

8 août 2019

 ,  ,  , 
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit la transfection plasmique à haut débit des cellules de mammifères dans une plaque de 384 puits utilisant la technologie acoustique d'éjection de gouttelettes. La distribution et le multiplexage d'ADN, longs et sujets aux erreurs, mais aussi la distribution de réactifs transfection, sont pilotés par un logiciel et exécutés par un dispositif de nanodistributeur. Les cellules sont ensuite ensecées dans ces puits préremplis.

Résumé

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La transfection cellulaire, indispensable pour de nombreuses études biologiques, nécessite le contrôle de nombreux paramètres pour une réalisation précise et réussie. Le plus souvent effectué à faible débit, il est d'ailleurs long et sujet aux erreurs, d'autant plus lorsque le multiplexage de plusieurs plasmides. Nous avons développé une méthode facile, rapide et précise pour effectuer la transfection cellulaire dans une mise en page de plaque de 384 puits en utilisant la technologie acoustique d'éjection de gouttelettes (ADE). Le dispositif nanodistributeur utilisé dans cette étude est basé sur cette technologie et permet une livraison précise de nanovolume à grande vitesse à partir d'une plaque de puits source à une plaque de destination. Il peut distribuer et multiplex ADN et réactif de transfection selon une feuille de calcul préconçue. Ici, nous présentons un protocole optimal pour effectuer la transfection plasmide à haut débit à base d'ADE qui permet d'atteindre une efficacité allant jusqu'à 90% et une cotransfection de près de 100% dans les expériences de cotransfection. Nous étendons le travail initial en proposant une macro basée sur une feuille de calcul conviviale, capable de gérer jusqu'à quatre plasmides/puits à partir d'une bibliothèque contenant jusqu'à 1 536 plasmides différents, et une application de guide de pipetage à base de tablettes. La macro conçoit le modèle (s) nécessaire de la plaque source et génère les fichiers prêts à l'emploi pour l'application nanodispenser et tablette. Le protocole de transfection en quatre étapes implique i) un diluant se passer d'un manipulateur liquide classique, ii) la distribution plasmide et le multiplexage, iii) un réactif de transfection distribué par le nanodispenser, et iv) le placage cellulaire sur les puits préremplis. Le contrôle logiciel décrit du multiplexage et de la transfection du plasmide ADE permet même aux non-spécialistes sur le terrain d'effectuer une transfection cellulaire fiable d'une manière rapide et sûre. Cette méthode permet d'identifier rapidement les paramètres optimaux pour un type de cellule donné et peut être transposée à des approches manuelles et à échelle supérieure. Le protocole facilite les applications, telles que la protéine ORFeome humaine (ensemble de cadres de lecture ouverts [ORFs] dans un génome) expression ou CRISPR-Cas9-basé validation de la fonction génique, dans les stratégies de dépistage non pooled.

Introduction

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La méthode présentée ici décrit en détail comment effectuer le multiplexage et la transfection du plasmide de l'ADN dans les cellules de mammifères à haut débit à l'aide d'un nanodistributeur liquide à base acoustique dans une plaque de 384 puits, même pour les non-spécialistes dans le domaine. Cette méthode1 récemment publiée permet d'exécuter jusqu'à 384 multiplesx d'ADN plasmide indépendants et des conditions de transfection dans une expérience, en moins de 1 h. Les expériences simples ou de cotransfection ont été couronnées de succès, atteignant près de 100 % cotransfection au sein de la population de cellules transfectées. Ce protocole fac....

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Protocole

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1. Préparations préalables

  1. Préparation des programmes de manutention de liquides péristaltiques
    REMARQUE : Pour les étapes de diluant et de distribution cellulaire du protocole, un programme dédié doit être préparé, en tenant compte de la hauteur de la tête distributrice à la plaque utilisée et de l'intention d'étape.
    1. Pour l'étape de distribution de diluant de 1 l,l, montez une cassette de 1 L et préparez un programme avec les paramètres décrits dans les étapes 1.1.1.1 et 1.1.1.2.
      1. Ajustez le paramètre de débit à Haut pour le meilleur débit car aucun dommage matériel biologique n'est prévu dans cette étape.....

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Résultats

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fAfin de déterminer si la technologie ADE pourrait être utilisée pour un protocole automatisé de transfection inverse, nous avons surveillé l'efficacité de la transfection cellulaire par microscopie fluorescence, à l'aide d'un tdTomato fluorescent rouge exprimant plasmide. D'abord visant à déterminer les meilleurs paramètres de transfection, différents volumes de diluants et quantités totales d'ADN ont été testés. Le volume diluant a été utilisé pour permettre aux gouttelettes d'ADN, une .......

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Discussion

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L'établissement et l'optimisation d'une méthode précise de transfection à haut débit pour une lignée cellulaire donnée exigent des scientifiques qu'ils suivent certains paramètres clés décrits dans cette section. Nous encourageons fortement en commençant par les valeurs recommandées tout au long du protocole que ces paramètres optimisés pour les cellules HeLa s'est également avéré efficace pour les cellules HEK. Cependant, comme les meilleurs paramètres peuvent dépendre des lignées cellulaires et des réactifs de transfec.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Les auteurs ont révélé un reçu du soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Inserm, Université de Lille, Institut Pasteur de Lille, Conseil Régional du Nord, et PRIM-HCV1 et 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) et la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB n ' 260901). Les auteurs tiennent à remercier le Dr S. Moureu, le Dr B. Villemagne, le Dr R. Ferru-Clément et le Dr H. Groult pour leur examen critique et les corrections du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
384LDV MicroplaqueLabcyteLP-0200
Microplaque à 384 puits &mu ; Clear BlackGreiner781906
AmpicilinSigmaA9393-5GSélection antibiotique pour les bactéries transformées avec le vecteur exprimant l’ampiciline
Tablette Android SamsungGalaxy Note 8utilisée pour guider l’utilisateur tandis que la plaque source dispense manuellement
Aniospray Surf 29Anios2421073désinfectant pour nettoyer la tête MicroFlo
Columbus logicielLogiciel d’analyse d’imagesPerkin Elmer
Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, taux de glucose élevé, supplément GlutaMAX, pyruvateThermo Fisher Scientific10566032milieu de culture cellulaire
Echo Cherry Pick 1.5.3 logicielLabcyteLogiciel permettant des distributions basées sur ADE par le dispositif Echo550 à partir d’un fichier *.csv ; logiciel nanodistributeur
Echo550LabcyteDistributeur à base d’ADE
Sérum de veau fœtalThermo Fisher Scientific16000044à ajouter dans le milieu de culture cellulaire
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Sigma-AldrichHT501128-4Lpour fixer les
cellules HeLaATCCHeLa (ATCC® ; CCL-2&commerce ;)
Hoechst 33342, Trichlorhydrate, trihydrateThermo Fisher ScientificH357010 mg/mL Solution dans l’eau
Analyseur INCell 6000GE Healthcare29043323plate-forme d’imagerie confocale automatisée basée sur laser
LB mediumThermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)® ;, poudre		12780052milieu de culture pour la croissance
des bactériesTampon de lyse (A2)  ;Macherey-Nagel740912.1Tampon du kit de plasmide NucleoSpin utilisé pour préparer le plasmide à partir de la culture bactérienne
MicroFlo 10µ ; L cassetteBiotek Instruments Inc7170013à utiliser avec le distributeur Microflo
MicroFlo 1&mu ; Cassette LBiotek Instruments Inc7170012à utiliser avec le distributeur Microflo
Distributeur MicroFloBiotek Instruments Inc7171000dispositif de manipulation de liquide péristaltique à pompe
Spectrophotomètre microvolume SpectrophotomètreDenovixDS-11Mesurer la concentration d’ADN des échantillons
plasmidemVenusL’ADNc mVenus a été cloné par restriction enzymatique, digestion et ligature dans les sites Age1/BsrG1 du plasmide tdTomato-N1 Type devecteur : Expression de mammifère, Fusion Protéine : Tampon
Macherey-Nagel740913.1Tampon à partir du NucleoSpin Kit de plasmide utilisé pour préparer le plasmide à partir de culture bactérienne
Kit de plasmide NucleoSpinMacherey-Nagel740588.50utilisé pour préparer le plasmide à partir d’une culture bactérienne
Milieu Eagle modifié optimal (Opti-MEM) MilieuThermo Fisher Scientific31985070
facultatif Tampon de lavage (A4)Macherey-Nagel740914.1Tampon du kit de plasmide NucleoSpin utilisé pour préparer un plasmide à partir d’un
agitateur orbitalagitateur incubé de grande capacité444-7084Utilisé pour cultiver des bactéries sous une agitation douce et 37° ; C
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific1514012210 000 U/mL
Saline tamponnée au phosphateThermo Fisher Scientific10010001
Mini-colonnes de plasmidesMacherey-Nagel740499.250Mini-colonne à membrane de silice pour préparer le plasmide à partir de culture bactérienne
Tampon de remise en suspension (A1)  ;Macherey-Nagel740911.1Tampon du kit de plasmide NucleoSpin utilisé pour préparer le plasmide à partir de l’ARNase de culture bactérienne
Uneenzyme de Macherey-Nagel740505du kit de plasmide NucleoSpin utilisé pour préparer le plasmide à partir d’une culture bactérienne
Plasmide tdTomato-N1AddgenePlasmide #54642Type de vecteur : Expression de mammifère, Fusion Protéine : tdTomato  ;
TransIT-X2 Dynamic Delivery SystemMirus BioMIR 6000
Wash Buffer (AW)Macherey-Nagel740916.1Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
imprimante 3DCrealityCR10Sused to print the plate
adapter Blender Software  ;  ; https://www.blender.org/
Logiciel libre sous licence publique générale GNU (GPL).		Version 2.79butilisée pour concevoir l’adaptateur de plaque
Milieu cellules de neutralisation mVenus (A3)  ; de culture bactérienne

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific.

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Mots-clés

Transfection haut d bittechnologie ADEplaque de 384 puitsmacro de feuille de calculprotocole de nanodistributeurtransfection cellulairedistribution de plasmidesr actif de transfection

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