Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

Résumé

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Résumé

Nous présentons une approche cytométrique de flux pour analyser le ROS mitochondrial dans diverses populations vivantes de cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM) provenant de souris en bonne santé ainsi que de souris atteintes de LAM entraînées par MLL-AF9. Plus précisément, nous décrivons un processus de coloration cellulaire en deux étapes, par lequel les cellules saines ou la leucémie BM sont d'abord tachées d'un colorant fluorogénique qui détecte les superoxydes mitochondriaux, suivie de coloration avec des anticorps monoclonaux fluorochrome-liés qui sont utilisés pour distinguer diverses populations hématopoïétiques saines et malignes. Nous fournissons également une stratégie pour l'acquisition et l'analyse des échantillons par cytométrie de flux. L'ensemble du protocole peut être réalisé dans un délai aussi court que 3-4 h. Nous soulignons également les variables clés à considérer ainsi que les avantages et les limites de la surveillance de la production de ROS dans le compartiment mitochondrial des sous-populations vivantes de tige sémino-tige et de leucémie et progénitrice utilisant des colorants fluorogènes par cytométrie de flux . En outre, nous présentons des données que l'abondance mitochondriale de ROS varie parmi les sous-populations saines distinctes de HSPC et les progéniteurs de leucémie et discutons des applications possibles de cette technique dans la recherche hématique.

Introduction

Les espèces réactives d'oxygène (ROS) sont des molécules fortement réactives dérivées de l'oxygène moléculaire. L'emplacement cellulaire le plus bien défini de la production de ROS est les mitochondries, où les électrons qui passent par la chaîne de transport d'électrons (ETC) pendant la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont absorbés par l'oxygène moléculaire menant à la formation d'un spécifique type de ROS appelé superoxydes¹. Grâce aux actions d'une série d'enzymes, appelées dismutases de superoxyde ou SODs, les superoxydes sont convertis en peroxydes d'hydrogène, qui sont ensuite neutralisés en eau par des enzymes telles que la catalase o....

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Fox Chase Cancer Center.

REMARQUE: Le flux de travail du protocole est divisé en 4 parties telles qu'elles sont présentées à la figure 1 et les réactifs requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement de moelle osseuse (BM)

REMARQUE: Des souris de leucémie de MLL-AF9 ont été produites comme décrit précédemment^11.

Résultats

Présenté est une méthode pour analyser ROS dans les mitochondries de multiples populations saines et MLL-AF9-exprimant l'ancêtre de leucémie. La figure 1 affiche une vue schématique du flux de travail du protocole, qui se compose de 4 étapes principales : 1) l'isolement de BM des souris ; 2) Tacher les cellules BM avec un colorant fluorogénique qui reconnaît le ROS mitochondrial, en particulier les superoxydes; 3) coloration d'anticorps de marqueur de surface pour délimiter diverses populati.......

Discussion

Les colorants fluorogéniques qui ont été développés pour la détection de ROS sont fréquemment évalués dans les cellules fixes par microscopie ou dans les cellules vivantes par cytométrie de flux²². L'évaluation cytométrique de flux du ROS mitochondrial dans les cellules de BM utilisant les colorants fluorogenic mitochondriaux de ROS a deux avantages principaux : 1) C'est une technique rapide et simple qui convient à l'analyse de cellules vivantes et 2) elle permet de distinguer et d'analyser rare .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Milieu
Pénicilline Streptomycine	Corning	30-002-CI	Média
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Tampon
15 mL tube conique	BD falcon	352096	Fournitures de culture tissulaire
50 mL Tube conique	BD falcon	352098	Tissu Fournitures de culture
40 &mu ; Passoires à cellules m	Fisher Scientific	22-363-547	Fournitures de culture tissulaire
Tampon de lyse RBC	Fisher Scientific	50-112-9751	Fournitures de culture tissulaire
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxydant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxydant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	anticorps
CD4 Clone PE-Cy5 RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Anticorps
CD8 Clone PE-Cy5 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Anticorps
CD19 Clone PE-Cy5 6D5	Biolegend	115510	Anticorps
B220 Clone PE-Cy5 RA3-6B2	Biolegend	103210	Anticorps
Gr1 Clone PE-Cy5 RB6-8C5	Biolegend	108410	Anticorps
Ter119 Clone PE-Cy5 Ter-119	Biolegend	116210	Anticorps
CD48 Clone PE-Cy5 HM48-1	Biolegend	103420	Anticorps
CD117  ; Clone APC-Cy7 2B8	Biolegend	105825
Anticorps Sca1 peacific Clone Blue D7	Biolegend	108120	Anticorps
CD150 Clone APC TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Anticorps
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Anticorps
CD45.2 Clone APC 104	Biolegend	1098313	Anticorps
MitoSOX Rouge	ThermoFisher Scientific	M36008	Colorant
Mitotracker Vert	ThermoFisher Scientific	M7514	Colorant
Colorant Jaune vif/mort Colorant ThermoFisher	Scientific	L34967	Colorant