Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.
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Article de méthode
Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration
Dans cet article
Résumé
Résumé
La cicatrisation des plaies cutanées est une préoccupation majeure pour les patients souffrant de diabète et pour les personnes âgées, et il est nécessaire d'un traitement efficace. Des approches in vitro et in vivo appropriées sont essentielles pour l'identification de nouvelles molécules cibles pour les traitements médicamenteux afin d'améliorer le processus de guérison des plaies cutanées. Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à rayons de tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies dans deux essais indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Fibroblastes embryonnaires primaires de souris (MEFs) aiguement isolés des souris sauvages (WT) et Cav 3-déficientes (Cav3KO) ou fibroblastes aiguement isolés des souris de WT traitées avec siRNA pour réguler vers le bas l'expression du gène de Cacnb3 , l'encodage Cav3,ont été utilisés. Une égratignure a été appliquée sur une monocouche de cellules confluentes et la fermeture d'écart a été suivie en prenant des images microscopiques aux points de temps définis jusqu'à repeupler complètement l'écart par les cellules migrantes. Ces images ont été analysées, et le taux de migration cellulaire a été déterminé pour chaque condition. Dans un analyse in vivo, nous avons implanté une chambre de pli de peau dorsal sur des souris WT et Cav3 KO, appliqué une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre, couvert la plaie avec un couvercle en verre pour la protéger contre les infections et la dessiccation, et surveillé la fermeture macroscopique de la plaie au fil du temps. La fermeture des plaies était significativement plus rapide chez les souris cicnb3-gène-déficientes. Étant donné que les résultats des essais in vivo et in vitro sont bien corrélés, l'analyse in vitro peut être utile pour le dépistage à haut débit avant de valider les coups in vitro par le modèle de guérison des plaies in vivo. Ce que nous avons montré icipour les souris ou les cellules de type sauvage et cav3-déficients pourrait également être applicable pour des molécules spécifiques autres que Cav3.
Introduction
La cicatrisation des plaies cutanées commence immédiatement après la blessure cutanée afin de restaurer l'intégrité de la peau et de protéger l'organisme contre les infections. Le processus de cicatrisation des plaies passe par quatre phases qui se chevauchent; coagulation, inflammation, nouvelle formation de tissu, et tissu transformant1. La migration cellulaire est cruciale pendant ces phases. Les cellules inflammatoires, les cellules immunitaires, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont activés à différents moments et envahissent la zone de la plaie2. Les méthodes d'enquête sur la cicatr....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées et exécutées conformément aux règlements d'éthique et aux comités de protection des animaux de la Sarre et de l'Université de la Sarre.
1 Culture cellulaire primaire et transfection de siRNA
REMARQUE : Dans la méthode décrite, des fibroblastes primaires sont utilisés. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. Dans cette expérience, le gène Cacnb3, codant la sous-unité Cav3 des canaux calciques à haute tension12 a été régulé vers le bas, montrant a....
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Résultats
L'égratignure a été réalisée sur un monocouche de cellules confluentes de type sauvage et de MEF déficients(figure 1c). Après avoir effectué le « scratch » à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l, les cellules des deux génotypes migrent dans la zone de rayures et comblent l'écart. Les images ont été prises après 6, 10 et 30 h (Figure 1a). La migration cellulaire a été quantifiée en pourcentage (%) de la zone de rayurere repeup.......
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons un analyse de guérison in vitro et in vivo de blessure et corrélons les résultats obtenus. Pour l'analyse in vitro, nous avons utilisé les fibroblastes primaires de souris4,14,15 qui jouent un rôle important dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. D'autres types de cellules adhérentes qui poussent sous forme de monocouches (p. ex. cellules épithéli.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions la Dre Petra Weissgerber et l'Unité Transgène de l'établissement animalier SPF (projet P2 de la SFB 894) de la Faculté de médecine et l'établissement animalier de l'Institut de chirurgie clinique et expérimentale de la Faculté de médecine de l'Université de Sarre, à Hombourg. Nous remercions le Dr Andreas Beck pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projet A3 à A.B. et V.F.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,9 % NaCl | |||
| 1 ml seringues | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 puits plaque | Corning | 3516 | |
| Poinçon de biopsie | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 siRNA de souris Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Crème | toute épilation crème | ||
| Dexpanthénol 5 % (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Chlorhydrate de dihydroxylidinothiazine (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2 % | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco par life technologies | 41966-029 | |
| Sérum de veau fœtal | Gibco par life technologies | 10270-106 | |
| Hexagone full nut | |||
| Chlorhydrate de kétamine | Zoetis | KETASET | |
| Microscope optique | Keyence, Osaka, Japon | BZ-8000 Des | microscopes similaires pourraient être utilisés |
| Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-pinces | |||
| Micro-ciseaux | |||
| Souris de contention | Maison | ||
| Ciseaux | |||
| Objectif | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Sutures | |||
| Peau de tournevis | |||
| désinfectant (octeniderm) | Schü ; lke & Mayr GmbH | 118212 | |
| tête cylindrique fendue | |||
| Anneau | |||
| Pince | |||
| à anneau élastique Microscope chirurgical avec caméra | Leica | Leica M651 | |
| Cadres en titane pour la chambre de pliage cutané | IROLA | 160001 | Halteblech |
| M Pieux |
Références
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M.
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Réimpressions et autorisations
