Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman

Summary

Dans ce manuscrit, la mise en œuvre d'un microscope à diffusion Raman (SRS) stimulé, obtenue par l'intégration d'un sER expérimental avec un microscope à balayage laser, est décrite. Le microscope SRS est basé sur deux sources laser femtoseconde (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) et un oscillateur paramétrique optique synchronisé (OPO).

Abstract

La microscopie de diffusion Raman stimulée (SRS) utilise la lumière d'excitation proche infrarouge; par conséquent, il partage de nombreuses propriétés d'imagerie microscopique multiphoton. La modalité d'imagerie SRS peut être obtenue à l'aide de microscopes à balayage laser commerciaux en équipant d'un détecteur avant non descanné avec des filtres de bande passet appropriés et un système de détection des amplificateurs de verrouillage (LIA). Une disposition schématique d'un microscope SRS typique comprend ce qui suit : deux faisceaux laser pulsés (c.-à-d., la pompe et la sonde dirigées dans un microscope à balayage), qui doivent être superposés dans l'espace et le temps au plan d'image, puis concentrés par un objectif de microscope dans l'échantillon à travers deux miroirs de balayage (SM), qui ratins la tache focale à travers un plan x-y. Après interaction avec l'échantillon, les impulsions de sortie transmises sont recueillies par un objectif supérieur et mesurées par un système de détection vers l'avant inséré dans un microscope inversé. Les impulsions de pompe sont enlevées par une pile de filtres optiques, tandis que les impulsions de sonde qui sont le résultat du processus de SRS se produisant dans le volume focal du spécimen sont mesurées par un photodiode (PD). La lecture de la DP est démoduée par la LIA pour extraire la profondeur de modulation. Une image bidimensionnelle (2D) est obtenue en synchronisant l'unité de détection avant avec l'unité de balayage au microscope. Dans cet article, la mise en œuvre d'un microscope SRS est décrite et démontrée avec succès, ainsi que la déclaration d'images sans étiquette de perles de polystyrène d'un diamètre de 3 m. Il est à noter que les microscopes SRS ne sont pas disponibles dans le commerce, donc afin de profiter de ces caractéristiques, la construction maison est la seule option. Étant donné que la microscopie SRS est de plus en plus populaire dans de nombreux domaines, on croit que cette description minutieuse de la mise en œuvre du microscope SRS peut être très utile pour la communauté scientifique.

Introduction

Dans les applications des sciences de la vie, la microscopie SRS est devenue un outil puissant pour l'imagerie sans étiquette. L'idée de base de la microscopie SRS est de combiner la force du contraste vibratoire et sa capacité à acquérir des images en quelques secondes.

SRS est un processus dans lequel la différence de fréquence entre deux fréquences de faisceaux laser (signal de pompe et signaux de stokes à différentes fréquences) correspond à la vibration moléculaire d'un échantillon étudié, provoquant une diffusion raman stimulée et une augmentation du signal Stokes. Contrairement à la spectroscopie linéaire de Raman, SRS présente une d....

Protocol

1. Démarrage du système laser

1. Vérifiez si la température des refroidisseurs est maintenue à 20 oC ou en dessous.
2. Vérifiez si l'unité de contrôle de l'humidité fonctionne correctement et si l'humidité est maintenue à une valeur d'environ 40 %.
3. Allumez le laser Ti:Sa, en suivant strictement les instructions dans le manuel.
4. Définir la longueur d'onde à 810 nm.
5. Allumez l'OPO et le mini-ordinateur connecté. Exécutez l'application qui contrôle le laser OPO.
6. Sélectionnez la dérivale si 100 % de la sortie laser Ti:Sa est nécessaire à la sortie de la boîte OPO.
7. Désélectionnez le cont....

Results

Un exemple de mesure du SRS (c.-à-d. mesure Du SRS dans un seul point de l'échantillon) est rapporté à la figure 7. Lorsque les faisceaux ne se chevauchent pas dans le temps ou l'espace, le résultat obtenu est rapporté à la figure 8a. En hors résonance, l'amplitude du signal mesurée par LIA est nulle, tandis que la phase de signal mesurée par LIA saute entre les valeurs négatives et positives. Considérant que, lorsque les faisceaux se chevauchent dans l'e.......

Discussion

La microscopie SRS a porté l'imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier dans les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l'architecture cellulaire. Les lipides sont impliqués dans de multiples voies physiologiques telles que la production de membranes biologiques, et ils servent de précurseurs biosynthétiques et de transducteurs de signaux¹⁰. Les lipides sont emballés dans des organites intracellulaires spéci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Outil d’acquisition	Nikon	Nikon C2Tool	Outil pris en charge
par acquisition Logiciel de contrôle de liaison d’impulsion	APE-APE	Logiciel de contrôle de liaison d’impulsions	Logiciel de contrôle Logiciel de contrôle
Autocorrélateur	APE	APE PulseCheck USB 50
Détecteur	d’autocorrélation Thorlabs	Thorlabs DET10A	de photodiode
	Thorlabs	Détecteur IR	Thorlabs VRC
Miroir dichroïque	Semrock	Semrock FF875-Di01-25X36	Miroir dichroïque
Miroir dichroïque	Semrock	FF875-Di01-25x36	Miroir dichroïque
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Cellule de Pockels
Détecteur rapide	Thorlabs	Thorlabs DET025AL/M	Photodiode
Unité de balayage à miroir rapide	Nikon	C2	Tête de balayage Microscpe
Laser femtoseconde Ti :SA	Cohérent	Chameleon Ultra II	Chameleon Ultra II
Générateur de fonctions	TTi	TG5011 AIM &ndash ; TTi	Générateur de fonctions
Microscope optique inversé	Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon	Eclipse TE-2000-E, Amplificateur
verrouillage Nikon Standford	Research System	SR844-200 MHz biphasé	A Amplificateur à verrouillage de Stanford Research Systems Filtre coupe-bande
,	Semrock	NF03-808E-25	Filtre à encliquetage
Ligne à retard optique	Newport	Newport M-ILS200CC	Ligne à retard optique accordable
Oscillateur paramétrique optique	Cohérent	Cohérent Compact OPO	Cohérent Compact OPO
Oscilloscope	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Oscilloscope numérique
Carte nationale	Instrument national	NI PCIe 6363	Carte d’acquisition de données
Capteurs de position Détecteurs	Newport	Newport Conex PSD9	Capteur de détecteur de position
Tête de wattmètre	Coherent	PowerMax PM10,Détecteur	de puissance laser
Étages de traduction	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Platine de traduction mécanique avec micromètre standard