Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Résumé

Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .

Résumé

De nombreuses études ont été limitées à l'utilisation d'essais cellulaires in vitro et de tissus entiers ou l'isolating de types cellulaires spécifiques d'animaux pour l'analyse in vitro du transcriptome et l'expression des gènes par qPCR et le séquençage de l'ARN. L'analyse complète de transcriptome et d'expression génique de types cellulaires spécifiques dans des tissus et organes complexes sera essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les gènes sont réglementés et leur association avec l'homéostasie tissulaire et l'organe Fonctions. Dans cet article, nous démontrons la méthodologie pour l'isolement de l'ARN ribosome-lié directement in vivo dans l'endothélia vasculaire des poumons animaux comme exemple. Les matériaux et procédures spécifiques pour le traitement des tissus et la purification de l'ARN seront décrits, y compris l'évaluation de la qualité et du rendement de l'ARN ainsi que qPCR en temps réel pour les essais de gènes artériogènes. Cette approche, connue sous le nom de technique de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP), peut être employée pour la caractérisation de l'expression de gène et de l'analyse de transcriptome de certains types de cellules directement in vivo dans n'importe quel type spécifique dans les tissus complexes.

Introduction

Dans les tissus complexes tels que le cerveau, le cœur et le poumon des mammifères, les niveaux élevés d'hétérogénéité cellulaire compliquent l'analyse des données d'expression génique dérivées d'échantillons de tissus entiers. Pour observer les profils d'expression génique dans un type de cellule particulier in vivo, une nouvelle méthodologie a été développée récemment, qui permet l'interrogation de l'ensemble de l'ARNm traduit de tout type de cellule génétiquement défini. Cette méthodologie est connue sous le nom de traduction ribosome affinity purification (TRAP) technique^1,2. C'est un outil utile pour étud....

Protocole

Pour les expériences animales, toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Medical College of Wisconsin.

1. Préparer des réactifs

1. Préparer un tampon de lyse à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cycloheximide, inhibiteurs de la protéase, et inhibiteurs recombinants RNase aux concentrations telles que décrites ci-dessous.
   1. Ajouter les réactifs suivants à 500 ml d'eau déionisée sans RNase : 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl₂, 35 mg de TNT, 0,5 mL de cycloheximide....

Résultats

Nos études précédentes^4,7 suggèrent que CD36 peut fonctionner comme un commutateur pour la différenciation artériolaire et l'artérielisation capillaire par l'intermédiaire de la voie de signalisation De LPA/PKD-1. Pour étudier si l'axe de signalisation LPA/PKD-1-CD36 est essentiel pour l'artériogenèse in vivo, nous avons établi les nouvelles lignes TRAP qui non seulement ont une carence mondiale en cd36 ou endothélial-spécifique-cd36- ou pkd-1-déficience, mais pe.......

Discussion

L'angiogenèse est un processus complexe en plusieurs étapes, dans lequel la transcription et l'expression de gènes angiogéniques spécifiques aux CE jouent un rôle essentiel dans la différenciation et la reprogrammation angiogénique^3,4. Pour surmonter les barrières de la diversité cellulaire et de la complexité architecturale pour mieux comprendre la fonction du système vasculaire des mammifères au niveau moléculaire in vivo, nous avons créé des souris TRAP spécif.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2100 Bioanalyseur d’électrophorèse avec nanopuces et picopuces	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Racleurs cellulaires	Sarstedt	83.1832
Homogénéisateurs	Fisher Scientific	K8855100020
Magnet (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	Dépendra de l’échelle de purification ; les échantillons dans des tubes de 1,5 mL peuvent être concentrés sur une minicentrifugeuse DynaMag-2
	Fisher Scientific	05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotomètre	Thermo Scientific  ;	ND-2000C
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5430R	avec rotor pour tubes de microcentrifugation de 1,5 mL
Tubes de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL	Applied Biosystems  ;
tubes coniques de 50 mL sans rnase	Applied Biosystems  ;
sans RNase 1000-&mu ; l filtres	Rainin	RT-1000F
Sans RNase 200-&mu ; l filtres Rainin	;	RT-200FSans
RNASE 20-&mu ; l filtres Rainin	;	RT-20F
Rotor pour homogénéisateurs	Yamato  ;	LT-400D
Rotateur de tubes, marque Labquake Thermo	Fisher	13-687-12Q

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