Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Résumé

Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .

Résumé

De nombreuses études ont été limitées à l'utilisation d'essais cellulaires in vitro et de tissus entiers ou l'isolating de types cellulaires spécifiques d'animaux pour l'analyse in vitro du transcriptome et l'expression des gènes par qPCR et le séquençage de l'ARN. L'analyse complète de transcriptome et d'expression génique de types cellulaires spécifiques dans des tissus et organes complexes sera essentielle pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les gènes sont réglementés et leur association avec l'homéostasie tissulaire et l'organe Fonctions. Dans cet article, nous démontrons la méthodologie pour l'isolement de l'ARN ribosome-lié directement in vivo dans l'endothélia vasculaire des poumons animaux comme exemple. Les matériaux et procédures spécifiques pour le traitement des tissus et la purification de l'ARN seront décrits, y compris l'évaluation de la qualité et du rendement de l'ARN ainsi que qPCR en temps réel pour les essais de gènes artériogènes. Cette approche, connue sous le nom de technique de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP), peut être employée pour la caractérisation de l'expression de gène et de l'analyse de transcriptome de certains types de cellules directement in vivo dans n'importe quel type spécifique dans les tissus complexes.

Introduction

Dans les tissus complexes tels que le cerveau, le cœur et le poumon des mammifères, les niveaux élevés d'hétérogénéité cellulaire compliquent l'analyse des données d'expression génique dérivées d'échantillons de tissus entiers. Pour observer les profils d'expression génique dans un type de cellule particulier in vivo, une nouvelle méthodologie a été développée récemment, qui permet l'interrogation de l'ensemble de l'ARNm traduit de tout type de cellule génétiquement défini. Cette méthodologie est connue sous le nom de traduction ribosome affinity purification (TRAP) technique^1,2. C'est un outil utile pour étudier la biologie cellulaire endothéliale et l'angiogenèse lorsqu'il est combiné avec la manipulation génétique d'autres gènes associés à l'angiogenèse chez les animaux.

Nous avons montré que la signalisation angiogénique PKD-1 et la transcription du gène angiogénique CD36 sont critiques pour la différenciation des cellules endothéliales (EC) et l'angiogenèse fonctionnelle^3,4,5,6. Pour déterminer les mécanismes moléculaires de la signalisation angiogénique et métabolique dans la transcription génique et la transdifférenciation EC, nous avons créé des souris TRAP génétiquement modifiées avec des gènes angiogéniques spécifiquement supprimés sur la base de la technique TRAP^{1 , 2}. En outre, chez nos animaux TRAP, non seulement ils ont une déficience génétique pkd-1 ou cd36 dans l'endothélia vasculaire ou la suppression globale du gène cd36, mais une protéine de fluorescence verte améliorée (EGFP) est également génétiquement étiquetée sur EC traduise des ribosomes. TRAP permet la purification d'affinité de l'ARNm lié au ribosome directement à partir de l'endothelia vasculaire des tissus ciblés, permettant l'analyse de l'expression génique et l'identification de nouveaux transcriptomes qui sont associés à la différenciation des CE et angiogenèse directement dans des conditions in vivo. Nous avons réussi à isoler l'ARN lié au ribosome de l'endothélie chez ces animaux génétiquement modifiés. L'ARN purifié peut être utilisé pour la caractérisation des gènes angiogéniques ou artériogéniques dans la régulation de la différenciation et des fonctions eC. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour mettre en œuvre l'approche TRAP pour l'isolement de l'ARNm dans les EC directement in vivo.

Protocole

Pour les expériences animales, toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Medical College of Wisconsin.

1. Préparer des réactifs

1. Préparer un tampon de lyse à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 100 mg/mL cycloheximide, inhibiteurs de la protéase, et inhibiteurs recombinants RNase aux concentrations telles que décrites ci-dessous.
   1. Ajouter les réactifs suivants à 500 ml d'eau déionisée sans RNase : 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl₂, 35 mg de TNT, 0,5 mL de cycloheximide, et NaOH au besoin jusqu'à pH 7,4, inhibiteurs de la protéase sans EDTA (un mini comprimé par 10 ml) et inhibiteur de la RNase (1 0 l/mL).
   2. Conserver dans un réfrigérateur à 4 oC jusqu'à 1 mois.
2. Préparer un tampon de lavage polysome à haute teneur en sel à des concentrations de 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1% vol/vol CA-630, 0,5 mM DTT, et 100 mg/mL cycloheximide.
   1. Ajouter les réactifs suivants à 500 ml d'eau déionisée sans RNase : 1,19 g de HEPES, 13,05 g de KCl, 0,24 g de MgCl_2, 5 ml de détergent nonionique et non dénaturant, 5 tubes de 7,7 mg de TNT, et 0,5 mL de cycloheximide, et NaOH au besoin jusqu'à pH 7,4.
   2. Conserver dans un réfrigérateur de 4 oC jusqu'à 1 mois.
3. Lier l'anticorps anti-GFP aux perles magnétiques de protéine G avant de commencer l'expérience.
   1. Ajouter 10 mg d'anticorps anti-GFP dilués dans 200 ml de PBS aux perles de protéines G.
   2. Incuber avec une rotation de bout sur extrémité pendant 10 minutes à température ambiante.
   3. Placer les perles sur un support magnétique et retirer le supernatant.
   4. Suspendre les perles dans 200 ml de PBS et les conserver dans un réfrigérateur de 4 oC jusqu'à 1 semaine.
4. Préparer le PBS glacé avec 100 mg/mL de cycloheximide.
   1. Ajouter 1 volume de solution cycloheximide (100 mg/mL) à 99 volumes de PBS glacé.

2. Isoler et lyser les tissus désirés

1. Euthanasier les souris par injection IP de kétamine (500 mg/kg/poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg/poids corporel) et isoler les tissus désirés (c.-à-d. le cœur, les poumons). Passez immédiatement à l'étape suivante.
2. Placer les tissus désirés dans 500 ml de PBS glacé avec 100 mg/mL de cycloheximide.
3. Émincer le tissu dans une suspension cellulaire avec un homogénéisateur motorisé ou un homogénéisateur en verre à petit dégagement. Si vous utilisez un homogénéisateur à moteur, limitez l'homogénéisation à moins d'une minute à basse fréquence (15 000 Hz) pour éviter la dénaturation de l'ARN.
4. Suspendre les granulés de cellules dans 200 ml de tampon de lyse en pipetting et redessinant le tampon plusieurs fois. Homogénéiser davantage la suspension cellulaire avec 10 coups dans un homogénéisateur en verre à petit dégagement ou pendant 15 secondes à basse fréquence (15 000 Hz) dans un homogénéisateur motorisé.
5. Centrifugeuse homogénéise pendant 10 min à 2 000 x g à 4 oC pour granuler les noyaux et les gros débris cellulaires, et garder le supernatant.
6. Ajouter le détergent nonionic et non dénaturant à 1% vol/vol et DHPC à 30 mM au supernatant. Incuber sur glace pendant 5 min.
7. Centrifugeuse lysate pendant 10 min à 16 000 x g pour granuler les matières insolubles. Transférer et garder 15% de lysate clair comme entrée pour les étapes futures.

3. Isoler les complexes ribosome/ARNm

1. Ajouter 50 ml de perles liées aux anticorps pour le mélange de supernatant sysate cellulaire et incuber le mélange à 4 oC avec rotation de bout en bout pendant 30 min. C'est là que les anticorps anti-GFP lieront les ribosomes marqués GFP, nous permettant d'isoler davantage l'ARN de ces ribosomes.
2. Recueillir les perles sur un support magnétique et laver 5 fois avec un tampon de lavage polysome à haute teneur en sel.
   1. Dessiner et jeter le liquide une fois que les perles se sont accumulées sur le côté du tube. Ensuite, pipette et redessiner jusqu'à 200 ml de tampon de lavage polysome à haute teneur en sel à plusieurs reprises. Répétez cette étape 5 fois et jetez tout le tampon après la répétition finale. Passez immédiatement à l'étape suivante.

4. Isoler l'ARNm

1. Placer les perles dans le tampon RLT. Les étapes suivantes sont prises directement à partir du protocole de mini kit RNeasy et n'ont pas été élargis en aucune façon.
   CAUTION: RLT tampon contient des sels de guanidine; ne PAS mélanger avec de l'eau de Javel.
2. Centrifugeuse lysate pendant 3 min à pleine vitesse 13 000 tr/min ou 16 000 g à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant de 350 ml par pipetting et transférez-le dans un nouveau tube de microfuge. Utilisez uniquement ce supernatant (lysate) dansles étapes suivantes.
3. Ajouter un volume égal de 70 % d'éthanol dans le tube de microfuge.
4. Transférer jusqu'à 700 ml de l'échantillon, y compris tout précipité qui aurait pu se former, sur une colonne de spin placée dans un tube de collecte de 2 ml. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers.
5. Ajouter 350 ml de tampon RW1 à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers et réutiliser le tube de collecte à l'étape suivante.
   CAUTION: Buffer RW1 contient des sels de guanidine; ne PAS mélanger avec de l'eau de Javel.
6. Ajouter 350 ml de tampon RW1 à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g. Jetez le flux à travers.
7. Ajouter 500 ml de RPE tampon à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 15 s à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers.
8. Ajouter 500 ml de RPE tampon à la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 2 min à 8 000 x g pour laver la membrane de la colonne de spin. Ensuite, retirez soigneusement la colonne de spin du tube de collecte, en veillant à ce que la colonne ne touche pas le flux à travers.
9. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et jetez l'ancien tube avec le flux à travers. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 min pour enlever le tampon résiduel.
10. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 1,5 ml. Ajouter 30-50 ml d'eau sans RNase directement à la membrane de la colonne de spin. Fermer le couvercle doucement et la centrifugeuse pendant 1 min à 8 000 x g pour élifier l'ARN.
11. Si le rendement prévu de l'ARN est de 30 mg, répétez l'étape 4.10 avec un autre 30-50 ml d'eau sans NNase, ou en utilisant l'elute de l'étape 4.10 (si haut [ARN] est nécessaire). Réutiliser le tube de collecte de l'étape 4.10.
12. Utilisez l'ARN purifié pour l'analyse en aval, y compris le séquençage de l'ARN ou le PCR quantitatif en temps réel ou stockez l'ARN dissous dans H₂O sans RNase à -80 oC pendant un an.

Résultats

Nos études précédentes^4,7 suggèrent que CD36 peut fonctionner comme un commutateur pour la différenciation artériolaire et l'artérielisation capillaire par l'intermédiaire de la voie de signalisation De LPA/PKD-1. Pour étudier si l'axe de signalisation LPA/PKD-1-CD36 est essentiel pour l'artériogenèse in vivo, nous avons établi les nouvelles lignes TRAP qui non seulement ont une carence mondiale en cd36 ou endothélial-spécifique-cd36- ou pkd-1-déficience, mais pe...

Discussion

L'angiogenèse est un processus complexe en plusieurs étapes, dans lequel la transcription et l'expression de gènes angiogéniques spécifiques aux CE jouent un rôle essentiel dans la différenciation et la reprogrammation angiogénique^3,4. Pour surmonter les barrières de la diversité cellulaire et de la complexité architecturale pour mieux comprendre la fonction du système vasculaire des mammifères au niveau moléculaire in vivo, nous avons créé des souris TRAP spécif...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2100 Bioanalyseur d’électrophorèse avec nanopuces et picopuces	Agilent	G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Racleurs cellulaires	Sarstedt	83.1832
Homogénéisateurs	Fisher Scientific	K8855100020
Magnet (Dynamag-2)	Invitrogen	123-21D	Dépendra de l’échelle de purification ; les échantillons dans des tubes de 1,5 mL peuvent être concentrés sur une minicentrifugeuse DynaMag-2
	Fisher Scientific	05-090-100
NanoDrop 2000C spectrophotomètre	Thermo Scientific  ;	ND-2000C
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5430R	avec rotor pour tubes de microcentrifugation de 1,5 mL
Tubes de microcentrifugation sans RNase de 1,5 mL	Applied Biosystems  ;
tubes coniques de 50 mL sans rnase	Applied Biosystems  ;
sans RNase 1000-&mu ; l filtres	Rainin	RT-1000F
Sans RNase 200-&mu ; l filtres Rainin	;	RT-200FSans
RNASE 20-&mu ; l filtres Rainin	;	RT-20F
Rotor pour homogénéisateurs	Yamato  ;	LT-400D
Rotateur de tubes, marque Labquake Thermo	Fisher	13-687-12Q