Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.
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Article de méthode
Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage
Dans cet article
Résumé
Résumé
La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.
La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.
Introduction
Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit pl....
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Protocole
1. Précautions de sécurité
REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé.
- Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire.
- Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc.
- Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II.
- Considérez tout matériau en contact avec les échantillons (réactifs, solutions de lavage, etc.) comme matière infectieuse.
- Traiter le matériau contaminé en immergeant dans la solution d’eau ....
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Résultats
Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la normeinternationale (IS) d.......
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Discussion
L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI-1112
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Enceinte de sécurité biologique de classe II | ThermoFisher Scientific | 10445753 | en cas de titrage du virus vivant |
| Transparent Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 & micro ; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | bon pour la liaison à l’anticorps chargé |
| Equip Labo Hotte de laboratoire en polypropylène | ThermoFisher Scientific | 12576606 | pour la préparation de l’acide sulfurique Plaque d’immunologie |
| Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 | Dutscher | 55303 | bon pour la liaison à l’anticorps chargé |
| Étanchéité des microplaques Bande(100 feuilles) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Lecteur monomode Sunrise | TECAN | ||
| Agitateur-incubateur de microplaques | Dutscher | 441504 | |
| Laveur de microplaques Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Pipette multicanaux (30-300 µ ; L) Pipettes monocanal 12 canaux | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &mu ; L micro, 2-20 &mu ; L, 20-200 &mu ; L & 100-1000 &mu ; L) | ThermoFisher | Scientific 4700880 |
Références
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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Réimpressions et autorisations
