Method Article

Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous rapportons l'électroporation d'ARN messager (ARNm) comme méthode qui permet l'expression rapide et efficace des protéines multiples dans le système de modèle d'embryon de caille. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules fluorescentes et enregistrer leurs mouvements in vivo par microscopie en accéléré peu de temps après l'électroporation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous rapportons que l'électroporation d'ARNm permet aux protéines fluorescentes d'étiqueter les cellules dans les embryons vivants de caille plus rapidement et plus largement que l'électroporation d'ADN. L'efficacité de transfection élevée permet à au moins 4 ARNm distincts d'être co-transfectés avec une efficacité de 87 %. La plupart des ARNm électroporated sont dégradés au cours des 2 premiers heures post-électroporation, ce qui permet d'effectuer des expériences sensibles au temps dans l'embryon en développement. Enfin, nous décrivons comment imager dynamiquement les embryons vivants électroporated avec des ARNM qui codent diverses protéines fluorescentes ciblées sous-cellulaires.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'électroporation est une méthode de transfection physique qui utilise une impulsion électrique pour créer des pores transitoires dans la membrane plasmatique, permettant à des substances comme les acides nucléiques ou les produits chimiques de passer dans le cytosol. L'électroporation est largement utilisée pour délivrer de l'ADN dans les bactéries, les levures, les plantes et les cellules de mammifères1,2,3. Il est couramment utilisé pour introduire des charges utiles génétiques dans les cellules cibles et les tissus dans l'embryon aviaire en développement pour étudier le contrôle génétique du développement ou l'étiquetage des populations migrantes de cellules4,5,6, 7. Cependant, plusieurs limitations expérimentales existentégalement avec l'électroporation d'ADN 8. Par exemple, l'électroporation de l'ADN introduit souvent des nombres très variables de vecteurs d'expression par cellule, puis les ARNm et les protéines qu'ils codent. Cette variabilité peut conduire à une hétérogénéité cellulaire considérable qui complique à la fois l'analyse d'image et l'interprétation des données9,10. De plus, les protéines issues de l'électroporation de l'ADN commencent seulement à exprimer 3 h après l'électroporation et n'atteignent pas l'efficacité maximale du nombre cellulaire et de l'intensité de fluorescence jusqu'à 12 h, probablement en raison du temps nécessaire pour le transfert dans le noyau et compléter transcription et traduction in vivo11.

En revanche, la transfection d'ARNm a été effectivement utilisée dans une variété de systèmes modèles, y compris les ovocytes Xenopus laevis par microinjection12,13, reprogrammant les cellules souches humaines par transfection de lipofectamine d'ARNm14 , et électroporating cellules souches neurales récalcitrantes chez les souris adultes15. Nous avons testé la capacité de l'électroporation de l'ARNm à étiqueter efficacement les cellules au cours du développement embryonnaire aviaire précoce à l'aide de mARN synthétisés in vitro qui codent des protéines fluorescentes distinctes (F). Pour nos études, nous avons utilisé le vecteur pCS2MD, un vecteur d'expression polyvalent couramment utilisé pour exprimer des protéines dans les embryons de Xenopus et de poisson zèbre. Les promoteurs de la polymérase d'ARN SP6 et T7 dans le pCS2MD permettent la synthèse de l'ARNm et des protéines de tout gène cloné lorsqu'ils sont utilisés dans un système de transcription/traduction in vitro.

Ici, nous démontrons que l'électroporation d'ARNm permet l'expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (FPs) dans les embryons de caille gastrulating. Nous avons conçu et généré de nombreux vecteurs d'expression utilisés dans ces études. Par exemple, nous avons sous-cloné le gène LifeAct-eGFP16 dans le vecteur pCS2MD17 pour l'exprimer du promoteur CMV et du promoteur SP6. Le gène inséré se trouve en aval du promoteur SP6 et en amont de la queue SV40 poly(A)18. Dans les embryons co-électroporated avec l'ARNm et l'ADN, les F codés des ARNm transcrits in vitro ont été détectés pour la première fois dans les 20 minutes de l'électroporation, tandis que les PF des vecteurs d'expression d'ADN n'ont été détectés qu'après 3 h. Plusieurs ARNm codant pour le nucléaire, Golgi, et Les protéines membranaires peuvent être électroporated dans un embryon simultanément, ayant pour résultat l'expression rapide et efficace des protéines multiples dans les cellules individuelles. Enfin, à l'aide d'un rétablissement in vivo de fluorescence après l'essai de photoblanchiment (FRAP), nous montrons qu'une majorité des ARNm électroporated se désintègrent dans les 2 h. Ainsi, la production initiale rapide de protéine combinée avec la nouvelle traduction limitée de protéine fait l'électroporation d'ARNm une technique valable quand le contrôle temporel de l'expression est nécessaire.

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Protocol

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Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l'Hôpital pour enfants de Los Angeles et les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie du Sud.

1. Vecteurs d'expression à base de pCS2 de génération

  1. Pour cloner pCS2.Lifeact-eGFP, préparez l'épine dorsale vectorielle en digérant 2 g de pCS2.CycB1-GFP (une construction contenant un insert différent) avec BamHI (10 U) et BsrGI (10 U) dans un tampon de digestion approprié (voir Tableau des matériaux) dilué à 1x en réaction totale volume de 50 oL pour 1 h à 37 oC (voir la figure 1 pour le schéma de la procédure de clonage).
    1. Déphosphoryez les extrémités 3'OH libres de l'épine dorsale vectorielle de la réaction enzymatique de restriction en ajoutant la crevette Alkaline Phosphatase (1 U). Incuber pendant 30 min à 37 oC.
    2. Exécuter le mélange entier dans un gel d'agarose de 1% /1x Tris Acetate EDTA (TAE) tampon à 90 V pour 50 min, puis tacher le gel dans une solution de 0,5 g/mL de bromure d'éhidium dans 1x tampon TAE pendant 15 min avec bascule douce. Assurez-vous également de charger des marqueurs de poids moléculaires dans une voie libre pour aider à déterminer la taille de l'ADN.
    3. À l'aide d'un transilluminateur UV sans danger pour l'ADN afin d'éviter de piquer les ADN, découpez rapidement l'épine dorsale vectorielle (taille prévue de la bande de 4 kb) du gel d'agarose et isole zions le fragment d'ADN de la pièce de gel à l'aide d'un kit de purification du gel en utilisant les instructions du fabricant.
  2. Simultanément à l'étape 1.1, préparer l'insert en digérant 2 g de pEGFP-N1-Lifeact avec BglII (10 U) et BsrGI (10 U) dans un tampon de digestion approprié dilué à 1x dans un volume de réaction total de 50 oL pour 1 h à 37 oC. Exécuter l'ensemble du mélange dans un gel d'agarose 1% pour isoler la bande de 800 bp comme expliqué précédemment à l'étape 1.1.2-1.1.3.
  3. Après que le vecteur et l'insert soient purifiés et quantifiés sur le spectrophotomètre, combinez 50 ng du vecteur et 38 ng de l'insert (rapport molaire de 1:3 de vecteur à insérer) dans le tampon de ligase d'ADN T4 avant d'ajouter la ligase d'ADN T4 pour catalyser la réaction de ligature. En outre, mettre en place un contrôle sans ADN, un contrôle vectoriel seulement, et un insert seulement de contrôle. Incuber toutes les réactions à température ambiante pendant 30 min.
    1. Transformer 1 L du mélange de ligature (s) en E. coli DH10 compétent. En outre, transformer l'eau seulement contrôle négatif et 20 pg de pUC19 contrôle positif. Étendre les bactéries sur les plaques d'agar Luria Broth (LB) contenant une ampicilline de 50 g/mL et incuber pendant la nuit à 37 oC.
    2. Le lendemain matin, comptez les colonies dans chaque assiette.
      REMARQUE: Idéalement, il ne devrait pas y avoir de colonies sur les plaques de contrôle négatives, de colonies sur les plaques de ligation vectorielles, et moins de colonies sur la plaque vectorielle seulement.
    3. Choisissez au moins 8 colonies bactériennes de la plaque d'agar transformées avec le mélange de ligature vectorielle et inoculez-les à l'aide de cure-dents stériles ou de pointes de pipet dans 2 ml de bouillon LB liquide contenant 50 g/mL d'ampicilline.
    4. Extraire l'ADN de chacun des clones à l'aide de kits de miniprep plasmiques commerciaux.
    5. Exécuter un digest de restriction diagnostique à l'aide de 500 ng d'ADN de chaque clone à l'aide de NotI (10 U) et BamHI (10 U) dans le tampon de digestion approprié dilué à 1x pour 1 h à 37 oC et exécuter l'ADN digéré sur un gel agarose 1% dans 1x tampon TAE. Les tailles de bande attendues pour les clones positifs pCS2.Lifeact-eGFP sont de 3,9 kb et 978 pb.
    6. Transformez 1 pg-100 ng d'ADN du clone positif en E. coli DH10 compétent, et préparez 3-4 réactions miniprep comme détaillé dans les étapes précédentes pour obtenir une quantité suffisante d'ADN pour la réaction de transcription in vitro (10 'g minimum).

2. Préparation de l'ARNm par In Vitro Transcription

  1. Linéarisez 10 g de pCS2.LifeAct-eGFP à l'extrémité 3' de l'insert avec NotI (10 U) dans un tampon de digestion approprié dilué à 1x dans un volume de réaction total de 50 oL à 37 oC pendant la nuit.
    REMARQUE: Pour prévenir la contamination par la RNase et réduire la dégradation de l'ARNm, portez des gants tout en manipulant des échantillons d'ARNm.
  2. Purifier l'ADN à l'aide d'un mélange de phénol: chloroforme: isoamyl alcool (25:24:1, v/v).
    1. Ajouter 150 l'eau sans RNase pour rendre le volume total de la réaction de digestion égal à 200 l. Ensuite, ajoutez 200 l de phénol: chloroforme: isoamyl alcool et vortex le mélange pour 20 s.
    2. Centrifugeuse dans un microfuge à vitesse maximale (18 400 x g) pendant 2 min. Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure qui contient l'ADN linéaire. Répétez cette étape pour éliminer les impuretés supplémentaires et veillez à ne pas perturber le précipité blanc qui peut se former entre les phases inférieures et supérieures liquides.
  3. Précipitez l'ADN linéaire en ajoutant 1/10 volume 3M d'acétate de sodium (sans RNase) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Laisser le mélange à -20 oC pendant 30 min, puis pelleter l'ADN en centrifuge antlayant à vitesse maximale (18 400 x g).
    1. Laver le granule d'ADN avec 70% d'éthanol, puis sécher à l'air le granule pour 'gt'5 min.
    2. Dissoudre la pastille d'ADN dans 5 l'eau sans RNase. Quantifier l'ADN par spectrophotomètre.
      REMARQUE: La concentration d'ADN prévue est de 0,5 à 1 g/L avec un rapport A260/A280 entre 1,7 et 2,0.
  4. Utilisez 1 g de l'ADN pCS2.LifeAct-eGFP linéaire pour la transcription in vitro (IVT). Suivez les instructions du fabricant dans le kit commercial (voir Tableau des matériaux) pour inclure 10 L d'analogique de bouchon (concentration finale de 0,8 mM) et de NTP (concentration finale 1 mM pour L'ATP, CTP et TTP; 0,2 mM pour GTP), 2 oL de mémoire tampon de réaction 10x (concentration finale 1x), 2 L de polymérase d'ARN SP6, et eau sans RNase jusqu'à 20 l.
    1. Incuber le mélange IVT pendant environ 2 h ou plus, selon la taille de la transcription.
      REMARQUE : L'incubation de 2 h fonctionne bien pour une transcription de 3 kb, mais l'incubation de nuit fonctionne mieux pour des transcriptions qui sont plus grandes que 5 kb.
    2. Pour enlever les nucléotides libres de la réaction de transcription, ajouter 30 l de la solution de précipitation d'ARN De LiCl (7,5 M de chlorure de lithium, 50 mM EDTA) pour précipiter l'ARNm. Vortex le mélange brièvement et stocker à -20 oC pendant 30 min. Faire tourner l'ARNm vers le bas pendant 15 min dans un microfuge à vitesse maximale (18 400 x g) et rincer à 70 % d'éthanol (sans RNase).
  5. Dissoudre l'ARNm synthétisé dans 15 'L d'eau sans RNase. Distribuer l'ARNm synthétisé à 5 l/tube (3 tubes au total) et le placer à -80 oC pour un stockage à long terme. Quantitate l'ARNm à l'''insévitrice à l'égard d'un spectrophotomètre.
    REMARQUE: Le rendement prévu est de 15 à 20 g d'ARNm (1 g/L). 1 oL (1 g/L) est suffisant pour une expérience avec 10 embryons, en supposant que l'ARNm est dilué de 1 g/L à 500 ng/L et que chaque embryon est injecté avec 200 nL. Chaque tube doit donc contenir suffisamment d'ARNm pour les expériences de 5.
  6. Exécuter 300 ng d'ARNm sur un gel d'agarose de 1 % dans un tampon 1x TAE après avoir nettoyé tout l'équipement de gel avec la solution de décontamination RNase (p. ex., RNase Away) et s'assurer que l'ARNM apparaît sous forme d'une seule bande (plusieurs bandes peuvent être présentes si des structures secondaires se forment) et qu'aucune frottis ppears dans la voie de gel, qui indique la dégradation de l'ARN.

3. Préparation du mélange d'électroporation d'ARNm

  1. Décongeler et diluer l'ARNm à la concentration désirée (250-500 ng/L dans l'eau sans RNase fonctionne bien pour tous les ARNm testés dans ce travail). Ajouter 1/10 volume de colorant coloré (voir Tableau des matériaux, concentration finale sans RNAse, 0,1%) pour aider à visualiser le site d'injection d'ARNm et à placer correctement les électrodes.
    REMARQUE :     Si l'ADN et l'ARN sont combinés pour effectuer une co-électroporation, assurez-vous que l'ADN est exempt de contamination des RNases en utilisant l'extraction de phénol-chloroforme et la précipitation d'éthanol avant l'ARNm et le mélange d'ADN.
    1. Assurez-vous de préparer un contrôle négatif à l'aide d'une solution d'électroporation simulée (sans AJOUT d'ARN). Si possible, préparez un contrôle positif à l'aide de l'ARNm prévalidé (ARNm qui a été démontré pour produire FP avec succès dans les expériences précédentes).
      REMARQUE: Le contrôle négatif est essentiel pour toutes les expériences d'imagerie afin d'établir des niveaux de fluorescence de fond pour la normalisation des données. Le contrôle positif est particulièrement important lorsque vous travaillez avec l'ARNm nouvellement transcrit en aidant à confirmer que les paramètres d'électroporation ont fonctionné.
  2. Conserver la solution d'électroporation de l'ARNm sur une boue de glace pour éviter la dégradation jusqu'à ce qu'elle soit prête à procéder à l'électroporation.

4. Les ARM electroporate dans les embryons de caille vivante

  1. Recueillir les œufs de caille fécondés fraîchement pondus tous les jours et les conserver à 13 oC dans un réfrigérateur humidifié pendant au plus 1 semaine. Incuber les œufs de caille à 38 oC jusqu'aux stades de développement embryonnaires souhaités19,20,21.
    REMARQUE: HH3 à HH5 ont été utilisés dans cette étude pour la formation image statique et dynamique. Pour les embryons HH3, laisser les œufs à température ambiante pendant 2 h avant la récolte rend le processus d'isolement beaucoup plus facile car les embryons sont généralement plus résistants aux manipulations physiques lorsqu'ils sont refroidis.
  2. Isoler et préparer les embryons selon le système de culture de la CE22. Recueillir au moins 5 embryons par condition, dont au moins un pour servir de contrôle négatif (non électroporated).
    1. Casser délicatement et verser l'œuf dans un plat Petri de 10 cm. Retirer la majorité de l'albumine épaisse avec une pipette de transfert et retirer l'albumine épaisse restante autour de l'embryon en essuyant doucement la surface du jaune avec une lingette de tissu pour s'assurer que l'embryon colle étroitement à l'anneau de papier.
    2. Poser du papier filtre prédécoupé (voir Tableau des matériaux) sur l'embryon et utiliser des ciseaux pour couper en douceur autour du périmètre de l'embryon.
    3. Utilisez une pipette Pasteur pour sous-tendre l'embryon avec PBS, en utilisant des ruisseaux doux pour évacuer tout jaune collant à l'embryon.
      REMARQUE: Cette étape est essentielle lorsqu'on travaille avec des embryons plus jeunes (lt;HH3) parce que ces embryons ont tendance à coller plus au jaune et se détachent souvent de la membrane vitelline lors des étapes de lavage ultérieures.
    4. Tirez lentement l'anneau embryon/papier à un angle oblique vers le haut et hors du jaune dans un plat Petri rempli de PBS pour un nettoyage ultérieur. Une fois que la majeure partie du jaune a été enlevée, placez le côté ventral de l'embryon vers le haut sur un plat Petri de 35 mm recouvert d'un mélange semi-solide d'agar/albumen.
  3. Préparer six à huit microcapillaires en verre de 10 cm de long (O.D. et 1,2 mm) à l'aide d'un instrument de traction micropipette en verre.
  4. Placez le côté ventral de l'embryon vers le haut dans la chambre d'électroporation remplie de PBS. À l'aide d'un microcapillaire en verre, injecter un bolus de 200 nL de l'ARNm ou de l'ADN/arnde mélange d'électroporation dans la cavité entre l'épiblaste et la membrane vitelline couvrant la région désirée.
    REMARQUE: Toute la zone antérieure pour la pellucida et une partie de la zone pour l'opaca ont été électroporated dans la plupart des expériences montrées dans ce manuscrit.
  5. Placer les électrodes positives et négatives (électrode carrée plate de platine; longueur latérale de 5 mm) sur le dessus et le bas de l'embryon respectivement et électroporate en utilisant la séquence d'impulsion suivante : cinq impulsions électriques carrées de 5 V, durée de 50 ms avec des intervalles de 100 ms à l'aide d'un électroporateur in vivo. Assurez-vous que la distance entre les électrodes est de 5 mm.
    REMARQUE: L'optimisation des paramètres d'électroporation est cruciale pour éviter les conditions qui peuvent tuer les cellules embryonnaires fragiles. Les paramètres de tension, la longueur des impulsions, les intervalles d'impulsions et le nombre d'impulsions pour l'ADN et l'ARNm devraient être pris en considération pour divers dispositifs d'électroporation.
  6. Incuber les embryons électroporated à 38 oC jusqu'au stade de développement souhaité.
    REMARQUE: Un stéréoscope de dissection fluorescent (voir Tableau des matériaux)aide à dépister les embryons transfectés par rapport aux embryons non transfectés.
  7. Si les embryons doivent être représentés de façon statique, fixez-les en 4 % de paraformaldéhyde en PBS pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC.
    1. Retirez les embryons de la membrane vitelline en coupant en douceur le périmètre du papier filtre avec des ciseaux et en épluchant la membrane brillante sur la surface dorsal avec des forceps pointus doucement.
    2. Laver les embryons fixes dans PBS/Triton (0,1 %) 2x pendant 5 min et continuer avec l'hybridation in situ ou immunostaining si désiré.
    3. Enfin, tachez l'embryon dans un DAPI de 0,5 g/L dans PBS/Triton (0,1 %) pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver les embryons dans PBS/Triton 2x pendant 5 min et effacer l'embryon dans la solution SCALE-U223 pendant la nuit.
  8. Pour analyser l'efficacité de l'électroporation (voir Figure 2), utilisez l'outil d'analyse binaire et particule et le canal DAPI sur ImageJ pour obtenir des contours nucléaires de toutes les cellules de l'image.
    1. Pour utiliser l'outil binaire sur ImageJ, utilisez une seule tranche z dans le canal DAPI contenant une majorité de cellules et cliquez sur Processus 'gt; binaire 'gt; Faire binaire. Pour séparer les cellules voisines, cliquez sur Processus 'gt; binaire 'gt; Watershed. Obtenir les contours des cellules en cliquant sur Analyser les particules, analysez les particules , taille définie à 100-500 (m2).
    2. Assurez-vous qu'une majorité des cellules sont décrites dans le canal DAPI et enregistrer les contours de la cellule en cliquant sur Plus de 'gt; Enregistrer sur le gestionnaire de retour d'investissement fenêtre pop-up.
    3. Utilisez ces contours pour obtenir des valeurs d'intensité de fluorescence pour l'ARNm et le canal d'ADN en ouvrant le fichier précédemment enregistré sur une seule tranche z dans l'ARNm ou le canal d'ADN, puis cliquez sur Mesurer sur le gestionnaire de retour sur investissement.
    4. Enfin, filtrez ces valeurs d'intensité, en comptant les cellules dont l'intensité de fluorescence n'est pas transfectée et les cellules dont l'intensité de fluorescence est transfectée.

5. FPs d'image codés par des ARNm électroporated

  1. Choisissez l'embryon le plus sain et le mieux électroporated pour les expériences d'imagerie dynamique après avoir examiné tous les embryons électroporated sous le stéréoscope fluorescent de dissection.
    1. Continuer à incuber les autres embryons électroporated et l'embryon non électroporated (le contrôle négatif) dans un incubateur séparé tout en imagerie de l'embryon choisi au cas où cet embryon meurt pendant l'expérience.
  2. Pour l'imagerie dynamique, utilisez la culture d'embryons aviaires ex ovo à monture entière telle qu'elle a été décrite précédemment24,25,26 avec un microscope confocal inversé.
    REMARQUE :     Le microscope est équipé d'un incubateur sur scène (voir Tableau des matériaux)qui maintient la température à 36 oC pendant l'imagerie. On a observé au microscope que les embryons incubés à 36 oC survivent plus longtemps qu'à des températures plus élevées, peut-être parce que le laser peut causer un chauffage local sur l'embryon. Les lecteurs doivent déterminer la température optimale d'incubation sur scène pour leur propre mise en place au microscope.
    1. Pour imager et visualiser dynamiquement l'embryogenèse, nettoyez brièvement l'embryon électroporated avec pbS pour enlever toutes les bulles qui peuvent se former sur le côté dorsal de l'embryon pendant le processus d'électroporation en déplaçant l'embryon autour en utilisant des forceps dans un PBS propre solution.
    2. Placez l'embryon propre directement sur un plat d'imagerie contenant une fine couche d'albumen-agar (150 l) en veillant à ne pas générer de bulles sur la surface dorsale de l'embryon22.
    3. Pour assurer la survie de l'imagerie à long terme, ajoutez un petit morceau de papier de soie roulé humide sur les bords intérieurs du plat d'imagerie et scellez le plat à l'aide d'un film paraffine pour minimiser l'évaporation pendant l'imagerie et l'incubation.
    4. Déplacez ce plat rapidement au stade pré-chauffé d'un microscope confocal et localisez le colorant coloré dans l'embryon à l'aide du canal brightfield (PMT laser 20%), qui identifie la région injectée et électroporated.
  3. Définir le logiciel d'imagerie à l'objectif souhaité (10 ou 20x), miroir dichroic (488 nm pour GFP nm, 561 pour la DP), spectres d'émission (499-562 nm pour GFP, 570-695 nm pour la DP), et allumer un laser approprié (488 nm pour GFP, 561 nm pour la DP).
    REMARQUE :     L'ARNm électroporated a été traduit en protéines qui ont été observées dans les 20 minutes (voir la figure 3). Les métadonnées d'imagerie utilisées pour la plupart des images de cet article étaient : un microscope confocal inversé avec un objectif 20x (voir Tableau des matériaux); temps d'habiter le pixel, 1,5 's; moyenne des scans à 4 lignes.
    1. Cliquez en direct sur le logiciel d'imagerie et ajustez la puissance laser à un réglage qui convient à l'intensité de fluorescence en fonction de chaque puissance laser microscope. Commencez par l'imagerie de l'embryon en utilisant 1% de puissance laser, 800 gain, et augmenter la puissance laser lentement par 1% incréments jusqu'à ce que les pixels saturés sont vus.
    2. Suivez ceci en diminuant légèrement la puissance du laser jusqu'à ce qu'aucun pixel saturé ne soit plus vu.
      REMARQUE: La puissance laser choisie pour le début d'une séance d'imagerie d'un embryon peut être bonne pour les points de temps plus tôt, mais pas idéale à des moments ultérieurs si la fluorescence des cellules devient beaucoup plus brillante ou plus faible au fil du temps. Pour remédier à cette situation, imagez l'embryon à des réglages de puissance légèrement inférieurs, d'abord, puisque les cellules électroporateds s'éclaircissent généralement au cours des 6 premières heures suivant l'électroporation (voir la figure 3A-E pour la quantification de l'augmentation du signal). Si les images ultérieures sont saturées, continuez à imager avec les paramètres d'imagerie d'origine, mais prenez une image supplémentaire immédiatement après avec des réglages d'imagerie plus faibles (plus petit trou d'épingle ou puissance laser plus faible).
    3. Imagez l'embryon toutes les 3-5 min afin de suivre la migration cellulaire individuelle à travers différents points de temps. Pour ce travail, les images étaient des z-stacks (50 m d'épaisseur) de toute la zone électroporated, plus un peu d'espace supplémentaire vers le bas de la z-pile au cas où l'embryon s'enfonce dans le lit d'agarose tout au long de la séance d'imagerie.
    4. Observez à quelle vitesse les cellules se déplacent en vérifiant les premiers points de temps du premier film. Si les cellules se déplacent à un rythme rapide (ce qui signifie qu'elles quitteront la zone de la région imagedans un délai de quelques points de temps plus), envisagez d'étendre le zoom de la zone d'image (1x à 0,8x) ou d'imaginer une autre région.
      REMARQUE: Les régions embryonnaires de la région pellucida se déplacent beaucoup plus rapidement que celles de la région opaca. En outre, les embryons plus jeunes (HH3, HH5) contiennent souvent des cellules qui subissent un mouvement plus rapide par rapport aux embryons plus âgés (HHH7).
    5. Après l'imagerie de la région électroporated de l'embryon, imagez une région non électroporated du même embryon pour déterminer les niveaux d'autofluorescence (devrait être minime si la faible puissance laser est utilisée pour l'image de l'embryon).

6. Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) pour évaluer l'intégrité de l'ARNm

REMARQUE: Une récupération in vivo de fluorescence après l'essai de photoblanchiment (FRAP) peut être employée pour déterminer combien de temps l'ARNm transfecté pourrait être traduit en FPs. Le protocole suivant décrit une expérience FRAP pour détecter la demi-vie de H2B. ARNm de citrine dans un embryon électroporated.

  1. Effectuez des expériences FRAP sur le microscope confocal inversé à l'aide d'un objectif 20x 0.8 NA et d'un trou d'épingle complètement ouvert.
    1. Après avoir confirmé l'électroporation de H2B-Citrine sur le stéréomicroscope et mis l'embryon sur la scène préchauffée sur le microscope confocal inversé (voir l'étape 5.2.4), photobleach la majeure partie de la fluorescence cellulaire de H2B-Citrine à une variété de temps points (45 min, 2 h et 5 h après l'électroporation) en utilisant le laser 405 nm avec 70% de puissance laser, 100 itérations, vitesse de balayage 4, qui ne laisse que 5% de fluorescence restante.
      REMARQUE: Ce processus devrait prendre quelques minutes.
    2. Continuer à incuber les embryons sur la scène à 36 oC après le photoblanchiment.
  2. Assurez-vous de prêter attention à la division active des cellules dans la région photoblanchie, qui indiquent que les cellules photoblanchies ne sont pas complètement morts après le traitement.
  3. Acquérir des images post-blanchiment (z-piles de la région électroporated) jusqu'à 30 min à intervalles réguliers (3 ou 5 min) à l'aide du microscope confocal.
    REMARQUE: Si disponible, utilisez une ligne transgénique H2B-XFP comme un contrôle positif pour assurer la survie des cellules dans la région photoblanchie. Le taux de récupération de fluorescence pour le FP codé par l'ARNm électroporated devrait diminuer, mais celui pour le FP codé par transgène devrait rester cohérent tout au long du film.
  4. Pour s'assurer que les conditions d'imagerie n'affectent pas de façon diététuse la survie des embryons, en même temps incuber des embryons électroporated qui ne sont pas photoblanchis, ce qui peut servir de contrôle pour l'imagerie.
  5. Pour quantifier les résultats de la carie de l'ARNm après l'électroporation de l'ARNm, suivez la fluorescence cellulaire au fil du temps (3 ou 5 min) en mesurant l'intensité de fluorescence du centre (un cercle de 7,5 m) de chaque cellule à l'aide d'ImageJ. Mesurez ceci pour toutes les cellules dans la région photoblanchie qui ne subissent pas la mitose et ont été complètement photobleached.
    REMARQUE: Envisagez d'omettre les cellules mitotiques de la quantification puisque les noyaux mitotiques ont une fluorescence plus forte que les noyaux interphases en raison de la condensation de chromatine.
  6. Tracer l'intensité de fluorescence au fil du temps après l'eau de Javel à une variété de points de temps (45 min, 2 h et 5 h).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

l'électroporation d'ARNm est plus efficace que l'électroporation d'ADN

Nous avons utilisé pCS2. H2B-Citrine pour préparer l'ARNm transcrit in vitro. Étant donné que l'électroporation de l'ADN est habituellement effectuée à 1-2 g/L, nous avons utilisé une concentration équimolar d'ARNm (calculée pour être d'environ 0,25-0,5 g/L pour l'électroporation de l'ARNm). Nous avons d'abord testé l'efficacité de l'électrop...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous avons fourni des instructions étape par étape sur la façon de micro-injecter et d'électroporate précisément l'ARNm dans les cellules des embryons de caille gazateurs. Nous avons démontré que l'électroporation de l'ARNm synthétisée in vitro permet une expression rapide et efficace des protéines fluorescentes (F) dans les embryons de caille gazateurs (figure2 et 3). La fluorescence de la protéine H2B-citrine traduite par des ARNm électroporated s'est av...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions David Huss pour ses idées utiles sur ce travail. Ce travail a été soutenu en partie par la Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) et la bourse de recherche de premier cycle de l'USC Provost à M.T., le Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., et l'Université de Southern California Undergraduate Research Associates Program award to R.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamyliqueThermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcription in vitroThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phényl-polyéthylène glycol, t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol, Polyéthylène glycol tert-octylphénylphényléther
DAPISigma AldrichD95422-(4-Amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine, 4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole, dichlorhydrate DAPI
Whatman No.1 papier filtreSigma AldrichWHA1001125
glycérolSigma AldrichG9012
UreaSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi était un cadeau de Dorus Gadella (plasmide Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID :Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID : 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneCet article
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine était un cadeau de Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID :Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry était un cadeau de Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID :Addgene_53750)
Microscope inversé Zeiss LSM-780Carl Zeiss Microscopy GmbHLe LSM-780 est un microscope confocal et multiphotonique qui offre la sensibilité requise pour les travaux d’imagerie essentiels. Équipé d’une platine motorisée, d’un dispositif de mise au point automatique et d’un incubateur occultant sur le dessus de la scène, le 780 est un excellent microscope pour l’imagerie haut de gamme de cellules vivantes/embryonnaires. Le détecteur Quasar 32 canaux haute sensibilité permet l’imagerie spectrale, le démélange linéaire et l’acquisition d’images à grand nombre de couleurs (>4). L’excitation peut être réalisée avec des lasers à photons uniques à 6 lignes (405, 458, 488, 514, 564 et 633 nm), un laser à 2 photons Chameleon (cohérent) (plage de 690 nm à 1000 nm), et exécutée avec le logiciel système ZEN 2011 SP7 (Black).
Électroporateur in vivo CUY-21 EDITBex Co., Ltd.
Électrode carrée plate en platine, longueur latérale 5 mmBex Co., Ltd.
Microscope stéréoscopique Olympus MVX10 FLOlympus LifeScience
XM10 OlympusLifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) pour HCR (10 fois ; pH 7,4) Pour préparer 1 L d’une solution mère 10 fois ;, mélanger 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anhydre ; Sigma-Aldrich S3264) et 2,7 g de KH2PO4 (anhydre ; Sigma-Aldrich P9791). Ajustez le pH à 7,4 avec du HCl et amenez le volume final à 1 L avec du H2O ultrapur. Évitez d’utiliser CaCl2 et MgCl2 dans le PBS pour la RCH. Il est important que le PBS pour le HCR soit préparé sous forme de solution sans RNase (par exemple, via un traitement au diéthylpyrocarbonate [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonAjouter 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) et 100 mL de 10× ; PBS à 890 mL de H2O distillé ultrapur. Filtrer la solution à travers un 0,2 &mu ; m filtrer et le stocker à 4 ? C jusqu’à l’utilisation.
1& fois ; solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (traitée au DEPC ; pH 7,4)
0,1 % Triton X-100
15593031LF701P5E Appareil photo monochrome

References

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