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Article de méthode

Modèle robuste induit par la ligature de la parodontite de Murine pour l'évaluation des neutrophiles oraux

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DOI :

10.3791/59667

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21 janvier 2020

 , 
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Faculty of Dentistry, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole pour établir un modèle ligature-induit de la parodontite de murine impliquant les molaires maxillaires multiples, ayant pour résultat de plus grandes zones du tissu et de l'os gingival impliqués pour l'analyse suivante aussi bien que l'utilisation animale réduite. Une technique pour évaluer les neutrophiles oraux d'une manière analogue aux sujets humains est également décrite.

Résumé

Les principaux avantages de l'étude de la pathophysiologie de la maladie parodontale en utilisant des modèles murins sont le coût réduit des animaux, l'éventail de souches génétiquement modifiées, le grand nombre d'analyses qui peuvent être effectuées sur les tissus mous et durs récoltés. Cependant, bon nombre de ces systèmes font l'objet de critiques procédurales. Comme alternative, le modèle ligature-induit de la maladie parodontale, conduit par le développement localisé et la conservation d'un microbiome oral dysbiotique, peut être employé, qui est rapidement induit et relativement fiable. Malheureusement, les variantes du protocole de parodontite murine-induite de ligature sont isolées aux régions focales du parodontium et soumises à l'avulsion prématurée de la ligature installée. Cela minimise la quantité de tissu disponible pour les analyses ultérieures et augmente le nombre d'animaux requis pour l'étude. Ce protocole décrit les manipulations précises nécessaires pour placer les ligatures molaires prolongées avec la conservation et l'utilisation améliorées d'une technique de rinçage nouvelle pour récupérer les neutrophiles oraux chez les souris avec une approche alternative qui atténue ce qui précède défis techniques.

Introduction

La maladie parodontale (PD) est une condition ostéolytique liée à la morbidité et au fardeau économique significatifs d'hôte, qui se manifeste par l'inflammation gingivale et la perte de l'attachement mou de tissu et du soutien osseux pour la dentition affectée1,2,3,4. Ce processus est régi par les interactions entre le microbiote oral et le système immunitaire inné de l'hôte. Il est également associé à l'exacerbation d'autres maladies inflammatoires systémiques, y compris le diabète, les maladies cardiovasculaires, et le cancer5,6,7,8. Historiquement, on a émis l'hypothèse que la pathogénie de la dépend de grandes quantités de bactéries spécifiques telles que Porphyromonas gingivalis9. Cependant, des preuves récentes suggèrent que la composante microbienne de la est médiée par le biofilm dentaire. Le biofilm est une communauté organisée et complexe de nombreux micro-organismes qui peuvent exister dans des états dysbiotiques sains et dysbiotiques destructeurs10,11. Le biofilm oral offre normalement une résistance à l'hôte en empêchant l'établissement de foyers de bactéries pathogènes et favorise la structure et la fonction idéales des tissus gingivals par la régulation de la réponse immunitaire de l'hôte12,13. Perturbations de la relation equilibrious entre les organismes commensal dans la cavité buccale et le système immunitaire hôte peut conduire à des altérations de l'homéostasie tissulaire, entraînant une dysbactériose et le développement des apparences cliniques et radiographiques caractéristiques de5,10,12,13,14.

Fait intéressant, l'établissement d'une dysbactériose orale, bien que nécessaire pour l'initiation de la DP, n'est pas suffisant pour conduire la DP chez tous les individus, fuyant vers la capacité de la réponse immunitaire hôte à subvertir la transition du microbiote entre les états symbiotiques et dysbiotiques15. Cela met en lumière les moyens par lesquels la Mpd influence l'un des personnages principaux du système immunitaire inné, à savoir le granulocyte polymorphonucléaire (PMN), ou neutrophile, du point de vue local et systémique16,17.

Chez l'homme, les PMN sont recrutés à partir de la circulation à un taux de 2 x 106 cellules/h dans les tissus conjonctifs parodontaux sains, où ils sont la population prédominante de leucocytes. Ici, ils sont ensuite expulsés du sulcus gingival dans la cavité buccale comme un composant du liquide creviculaire gingival. En présence de La DP, la neutrophilie se manifeste dans la circulation et la cavité buccale, où ces cellules effectrices possèdent un phénotype hyperinflammatoire qui conduit à la destruction susmentionnée du parodontium17,18,19,20,21,22. Par conséquent, la compréhension du rôle des PMN dans la MP et d'autres conditions inflammatoires systémiques est de la plus haute importance.

Bien qu'il soit largement admis que les maladies chroniques sont réciproquement liées à la MALADIE, les mécanismes sous-jacents n'ont pas encore été élucidés, contribuant à des difficultés dans la gestion de ces conditions systémiques morbides et potentiellement mortelles. Plusieurs modèles animaux expérimentaux, chacun avec des avantages et des inconvénients uniques, ont été utilisés pour étudier la physiopathologie de la23,24. En se concentrant spécifiquement sur les modèles murins, il existe une variété de protocoles par lesquels l'étude de la DP est facilitée; cependant, ils possèdent plusieurs défauts techniques et physiologiques25,26,27,28,29,30,31.

Tout d'abord, le modèle oral de souris de gavage exige de nombreuses inoculations orales des pathogènes parodontaux humains pour produire l'inflammation gingivale et la perte d'os. En outre, il est généralement précédé d'une période de traitement antibiotique pour subvertir la flore buccale murine commensal25. Ce modèle nécessite souvent une formation spécialisée pour effectuer en toute sécurité le gavage oral, n'utilise qu'une petite fraction des pathogènes parodontaux du microbiome oral humain plus complexe, et nécessite plusieurs mois pour établir la perte osseuse alvéolaire.

En revanche, les modèles murines induits chimiquement utilisent la livraison orale de l'acide sulfonique de trinitrobenzene (TNBS) ou du sodium de sulfate de dextran (DSS), agents couramment employés en établissant des modèles murins de colite sur une période de plusieurs mois pour induire la perte parodontale d'os26. Des modèles intraoraux et extraoraux à base d'abcès sont disponibles, qui impliquent les inciseurs et les tissus murines du dorsum ainsi que le calvarium, respectivement. Dans l'ancien modèle d'abcès, plusieurs injections de bactéries sont administrées, créant de multiples abcès gingivals et une pénurie de perte osseuse alvéolaire, limitant leur utilisation dans l'étude de la. Ces derniers modèles d'abcès sont significativement plus aptes à étudier la virulence bactérienne, l'inflammation, et la résorption osseuse à des emplacements en dehors de la cavité buccale, ce qui élimine l'évaluation du parodontium et du microbiome oral27,28,29,30,31.

Utilisant le modèle de la parodontite induit par ligature, une suture de soie tressée a été généralement installée circonfèrement autour de la deuxième molaire. Comme alternative, un seul segment linéaire de matériau de suture peut être inséré entre la première et la deuxième molaire32,33. Le but du placement de ligature est de faciliter l'accumulation bactérienne et de générer la dysbiose dans le sulci gingival, ayant pour résultat l'inflammation parodontale de tissu et la destruction des tissus composant le parodontium. Plus particulièrement, ce modèle est capable de produire beaucoup plus de perte osseuse alvéolaire par rapport au modèle de gavage oral plus couramment utilisé34. La résistance naturelle de plusieurs souches de souris (c.-à-d. C57BL/6) au développement de la perte osseuse alvéolaire complique encore davantage l'utilisation du modèle de gavage oral. C'est également problématique, car cette souche est la plus fréquemment utilisée dans la recherche animale à base de murine35.

Les procédures existantes décrites par Marchesan et coll. et Abe et Hajishengallis ont été conçues pour simplifier l'acte technique de placer la ligature33,36. Malheureusement, l'ancien protocole exige de l'équipement spécialisé imprimé en 3D et possède le potentiel de perte prématurée de ligature, augmentant ainsi l'utilisation des animaux et les coûts associés au temps supplémentaire passé dans la salle d'opération. En outre, les deux protocoles ne génèrent que de petites régions du parodontium malade disponibles pour une étude.

Les avantages qui se trouvent avec cette technique sont fondés sur l'étude simultanée de la dysbiose orale et l'immunologie qui régissent le parodontium, l'utilisation d'animaux à faible coût avec des antécédents génétiques divers, et les pratiques simples de logement et d'élevage. En tant que tel, les objectifs devraient être de maximiser les volumes de tissus malades et, dans les tentatives de pratiquer les principes de réduction de la recherche animale, de réduire la consommation animale à un niveau aussi bas que possible. Pour ce faire, il faut s'assurer que tous les animaux sont capables d'être inclus dans les analyses expérimentales37. Cependant, il convient de noter que peu importe quel modèle animal de la maladie parodontale est utilisé, il n'existe pas de modèle unique qui englobe tous les éléments de la pathophysiologie de la humaine.

Ce nouveau protocole utilise le placement d'une ligature autour de multiples dents molaires maxillaires à l'aide d'instruments et de matériaux que l'on trouve dans la plupart des laboratoires. Il permet une quantité suffisante de temps pour installer facilement et en toute confiance une ligature qui est peu susceptible d'avulse prématurément. Enfin, comme les PMN coordonnent la destruction du parodontium dans la MP, une nouvelle méthodologie pour récupérer les neutrophiles oraux d'une manière analogue à l'homme est également présentée.

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Protocole

Toutes les études sur les murines étaient conformes aux règlements éthiques pertinents et ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l'Université de Toronto et le Research Ethics Board (Protocol 20011930).

1. Installation de Ligature

REMARQUE: Il s'agit d'une intervention chirurgicale non stérile qui peut être effectuée dans un bloc opératoire standard. L'utilisation d'animaux exempts de germes (non couverts ici) exige la manipulation dans un cabinet de biosécurité, l'utilisation d'instruments stériles et l'inoculation de la cavité buccale avec des agents pathogènes parodontaux pour provoquer les manifestations cliniques de parodontite.

  1. Administrer l'anesthésie intrapéritonéale à des souris C57BL/6 mâles de 8 à 12 semaines, qui devraient être acclimatées à leur installation d'hébergement, à l'aide d'une aiguille hypodermique stérile de 0,5 po 26 G et d'une seringue de 1 ml selon les directives approuvées du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC).
    REMARQUE : Une combinaison de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) d'anesthésiques induit rapidement et de façon fiable le niveau approprié d'anesthésie pendant toute la durée de la procédure.
  2. Évaluer la profondeur anesthésique avant et toutes les 15 minutes pendant la procédure comme en témoigne la perte du réflexe de la pédale.
  3. Placez la souris sur une plate-forme chirurgicale chauffée (Figure 1A). Stabiliser le maxillaire et la mandibule en position ouverte à l'aide de bandes élastiques et soutenir le cou à l'aide d'un rouleau de coton pour aider à maintenir le maxillaire dans une orientation plus horizontale (Figure 1B). Couvrez le corps et la queue de l'animal pour atténuer la perte de chaleur pendant la procédure.
  4. Placez le microscope chirurgical au grossissement et à l'éclairage désirés (s'il n'est pas monté directement au microscope) au-dessus de la cavité buccale pour la visualisation de la dentition. Tandis que le grossissement désiré est opérateur-dépendant, la visualisation optimale de la cavité buccale est obtenue à 16x.
  5. Installez une suture stérile en soie tressée 5-0 autour des premières (M1) et deuxièmes (M2) molaires maxillaires (M2) dans le sulcus gingival à l'aide de forceps à éclats.
    REMARQUE : Les sutures en soie tressées d'une jauge plus petite peuvent être utilisées à cette fin pour faciliter l'installation plus rapide et réduire la possibilité de dommages aux tissus mous iatrogènes.
    1. Placez la queue distale de la suture sur le côté palatal de la dentition et insérez le segment proximal entre le contact de M2 et M3 (figure 2A).
    2. Enroulez la suture autour de la surface buccale de M2 et insérez-la entre le contact de M1 et M2. Assurez-vous que les deux extrémités de la suture sont serrées pour entraîner la suture dans le sulcus gingival et retirez tout mou (Figure 2B).
    3. Enroulez le segment de suture proximale autour de M1, en dessous de sa hauteur de contour, et insérez-le entre le contact de M1 et M2. Tirez la queue proximale de la suture hermétiquement pour conduire la suture dans le sulcus gingival et enlever tout mou (Figure 2C).
      REMARQUE : Si une résistance est observée lors de l'insertion de la suture entre M1 et M2 ou M2 et M3, le contact peut être légèrement ouvert à l'aide d'un explorateur dentaire standard.
    4. Attachez les extrémités de la suture avec le noeud d'un chirurgien et coupez les queues aussi courtes que possible. Placez le noeud dans l'embrasure gingival entre M1 et M2 sur le côté palatal de la dentition maxillaire (Figure 2D).
      REMARQUE : Les étapes 1.4.1-1.4.4 peuvent être répétées du côté contralatéral, si nécessaire.
    5. Stériliser les instruments chirurgicaux dans un stérilisateur de perles de verre chaud entre chaque sujet animal.
      CAUTION: Les pointes des forceps sont extrêmement nettes et peuvent facilement causer des traumatismes oraux et des saignements importants. Préparer de petits segments de gaze pour enlever le sang de la cavité buccale et appliquer une pression sur les plaies saignées activement.
  6. Après l'installation de ligature, retirer la souris de l'appareil chirurgical, placer dans une cage propre sous une lampe thermique et surveiller jusqu'à ce qu'elle soit complètement récupérée.
  7. Loger individuellement chaque souris avec l'enrichissement environnemental approprié et permettre à ad libitum d'accéder à l'eau filtrée et à la purée de la chow standard dans un environnement contrôlé par la température et l'humidité (cycle sombre de 12 h/12 h) pendant 7 à 11 jours.
    REMARQUE : La chow en purée diminue les forces requises pour la mastication réduisant ainsi la douleur associée à l'alimentation, et aide à prévenir la perte prématurée de la ligature installée.

2. Collecte d'échantillons

  1. Euthanasiez les souris conformément aux directives approuvées de l'IACUC.
    REMARQUE : L'euthanasie individuelle utilisant une chambre de CO2 suivie de la dislocation cervicale est la méthode préférée pour ce protocole. Cela peut être modifié en fonction des expériences qui nécessitent la récolte de tissus supplémentaires.
  2. À l'aide d'une pipette, rincez immédiatement la cavité buccale à l'aide de 100 l de saline stérilisée de 4 oC 1x tamponnée par phosphate (PBS) sans calcium et magnésium pendant 10 s.
  3. Répétez l'étape 2.2 2x et placez chaque rinçant dans un seul tube à essai stérile en polypropylène conique de 15 ml.
  4. Transférer le contenu dans un tube à essai stérile en polypropylène conique de 50 ml en les faisant passer à travers un filtre à mailles en nylon de 40 m.
  5. Transférez ces contenus dans un nouveau tube à essai stérile en polypropylène conique de 15 ml.
    REMARQUE : Le transfert final de l'échantillon vers un tube plus petit permet d'améliorer la visualisation de la pastille cellulaire dans les étapes à venir.
    1. Si désiré, retirer la ligature molaire et les placer dans 300 oL de 1x PBS stérilisé (4 oC, sans calcium et magnésium) dans un tube à essai stérile en polypropylène conique séparé de 15 ml. Agiter doucement et retirer la suture du tube. Cet échantillon est traité de façon identique à l'échantillon de rinçant oral à partir de ce point.
  6. Ajouter 33,3 L de 16 % de paraformaldéhyde (PFA) pour faciliter la fixation de l'échantillon.
  7. Vortex les échantillons immédiatement et incuber sur la glace pendant 15 min.
  8. Remplir le tube à 15 ml avec 1x PBS pour diluer la PFA, puis centrifugeuse à 1000 x g et 4 oC pendant 5 min.
  9. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans 1 ml de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à 4 oC. Compter les cellules sur un hémocytomètre ou un compteur cellulaire automatisé.
  10. Centrifuger l'échantillon à nouveau à 1000 RCF et 4 oC pendant 5 min.
  11. Aspirez le supernatant et suspendez le granule dans un volume approprié de tampon FACS pour une concentration finale de 0,5 à 1,0 x 106 cellules/50 l de tampon FACS.

3. Coloration d'anticorps pour l'analyse cytométrique de flux

REMARQUE : Étiqueter et refroidir tous les tubes FACS requis avant l'utilisation.

  1. Ajouter 1 l de sérum de rat et 2 l d'anticorps IgG antisouris à 50 oL de l'échantillon, vortex immédiatement, et bloquer sur la glace pendant 20 min.
  2. Ajouter les anticorps appropriés à chaque échantillon, vortex immédiatement, et incuber sur la glace pendant 30 min dans l'obscurité.
    REMARQUE : La sélection et les volumes d'anticorps dépendent d'expériences pilotes d'optimisation préalables adaptées à cette technique spécifique.
  3. Laver les échantillons avec 1 ml de tampon FACS, en vortexant brièvement et en centrifuge pendant 5 min à 1000 x g et 4 oC. Répétez cette étape 2x.
  4. Resuspendre les échantillons dans 250 oL de tampon FACS, recouvrir les tubes de film de paraffine, envelopper dans du papier d'aluminium et les conserver à 4 oC jusqu'à l'analyse.
    REMARQUE : Il est idéal d'analyser des échantillons dans les heures qui suivent l'achèvement du protocole en raison de la perte de signal fluorescent pendant de longues périodes de stockage. Cependant, les échantillons peuvent être analysés 2 à 3 jours plus tard si cela est absolument nécessaire.

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Résultats

Des données représentatives de cytométrie de flux provenant d'échantillons de rinçantoral d'une cavité buccale naïve (figure 3A) et enflammée (figure 3B) de cavité buccale murine secondaire à la parodontite induite par la ligature sont fournies. La récupération des PMN à partir d'une ligature installée est également démontrée (figure 3C). Les tensions de canal de cytomètre de flux o...

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Discussion

L'élément le plus critique associé à l'utilisation du modèle de la parodontite induit par la ligature murine est centré autour de la rétention de la ligature jusqu'au moment du sacrifice ou de l'ablation intentionnelle. La ligature biofilm-retentive installée est capable d'induire une perte significative de la hauteur alvéolaire d'os en aussi peu que 6 jours, plafonnant entre la période de 11-16 jours39. La décision de sacrifier les sujets animaux avant la période maximale de perte osseuse, ce qui...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

J. W. C. est appuyé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Les auteurs tient à remercier le Dr Chunxiang Sun pour son aide dans l'exécution de la coloration bleu trypan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-souris F4/80BioLegend123131BV421, Clone BM8
Anticorps anti-souris Ly6GBD560602PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Souris mâlesCharles River8 à 12 semaines
Tube de centrifugeuse coniqueFroggaBioTB15-50015 mL
Tube de centrifugeuse coniqueFroggaBioTB50-50050 ml
Tampon FACSMultiple1 % BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDivaBDv8.0.1
Fibre-LiteDolan-JennerModèle 180
FlowJoTree Starv10.0.8R1
Pompe de thérapie thermiqueHallowellHTP-1500
Stérilisateur à billes de verre chaudMicroscopie électronique Sciences66118-10Germinateur 500
Ciseaux à irisAlmedic7602-A8-684
KétamineVetoquinol100mg/mL
LSRFortessaBDX-20
Sérum de sourisSigmaM5905-5ML
Filtre à mailles en nylonFisher Scientific22-363-54740 & micro; m
ParaformaldéhydeFisher Scientific2890816 % (p/v), sans méthanol
Phosphate Saline SagmaD1408-500MLSans CaCl2 et MgCl2, 10x
Seringues jetables en plastiqueBD3096591 mL
Sérum de ratSigmaR9759-5ML
Sutureen soieCovidienSS652C13 USP 5-0
Pince à échardesAlmedic7726-A10-700#1
Pince à échardesAlmedic7727-A10-704#5
Microscope stéréo de dissectionCarl Zeiss28865Photo-Zusatz
Aiguille Hypodémique StérileBD30511126G X 1/2"
SeringueBD3096591 mL
XylazineRompun20mg/mL
droite

Références

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