Test standardisé et évolutif pour étudier perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Résumé

Cette méthode décrit la culture des cellules endothéliales dérivées de l'iPSC comme 40 microvaisseaux 3D perfusés dans une plate-forme microfluidique normalisée. Cette plate-forme permet l'étude de la germination angiogénique à gradient en 3D, y compris l'anastomose et la stabilisation des germes angiogéniques d'une manière évolutive et à haut débit.

Résumé

La recherche préclinique de médicaments sur les maladies vasculaires nécessite des modèles in vitro de vascularisation qui sont modifiables au dépistage à haut débit. Cependant, les modèles actuels de dépistage in vitro qui ont un débit suffisant n'ont qu'une pertinence physiologique limitée, ce qui entrave la traduction des résultats de l'in vitro à l'in vivo. D'autre part, les plates-formes de culture cellulaire microfluidique ont montré une pertinence physiologique inégalée in vitro, mais manquent souvent du débit, de l'évolutivité et de la normalisation nécessaires. Nous démontrons une plate-forme robuste pour étudier l'angiogenèse des cellules endothéliales dérivées des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC-ECs) dans un microenvironnement cellulaire pertinent physiologique, y compris la perfusion et les gradients. Les iPSC-EC sont cultivés comme 40 micro-navires 3D perfused contre un échafaudage de collagène-1 à motifs. Sur l'application d'un gradient de facteurs angiogéniques, les caractéristiques importantes de l'angiogenèse peuvent être étudiées, y compris la différenciation dans la cellule de pointe et de tige et la formation du lumen perfusable. La perfusion avec des colorants fluorescents traceur permet l'étude de la perméabilité pendant et après l'anastomose des germes angiogéniques. En conclusion, cette méthode montre la faisabilité des EC dérivés de l'iPSC dans un analyse angiogénique 3D standardisée et évolutive qui combine les conditions physiologiques pertinentes de la culture dans une plate-forme qui a la robustesse et l'évolutivité requises pour être intégrée s'intégrer dans l'infrastructure de dépistage des drogues.

Introduction

Les modèles in vitro jouent un rôle fondamental dans la découverte et la validation de nouvelles cibles médicamenteuses des maladies vasculaires. Cependant, les modèles actuels de dépistage in vitro qui ont un débit suffisant n'ont qu'une pertinence physiologique limitée¹, ce qui entrave la traduction des résultats de l'in vitro à in vivo. Ainsi, pour faire avancer la recherche préclinique de drogue vasculaire, les modèles in vitro améliorés de vascularisation sont nécessaires qui combinent le criblage à haut débit avec un micro-environnement cellulaire 3D physiologiquement pertinent.

Au cours de la dernière décennie, des progrès significatifs ont été réalisés pour accroître la pertinence physiologique des modèles in vitro de vascularisation. Au lieu de cultiver des cellules endothéliales sur des surfaces planes telles que des plastiques de culture tissulaire, les cellules endothéliales peuvent être incorporées dans des échafaudages 3D, tels que les gels de fibrine et de collagène². Dans ces matrices, les cellules endothéliales montrent un phénotype plus physiologiquement pertinent associé à la dégradation de matrice et à la formation de lumen. Cependant, ces modèles ne démontrent qu'un sous-ensemble des nombreux processus qui se produisent pendant la germination angiogénique car les indices importants du microenvironnement cellulaire font encore défaut.

Les plates-formes de culture cellulaire microfluidique sont particulièrement adaptées pour accroître encore la pertinence physiologique des modèles in vitro de vascularisation. Par exemple, les cellules endothéliales peuvent être exposées au stress de cisaillement, qui est un stimulus biomécanique important pour la vascularisation. En outre, la possibilité de contrôler spatialement les fluides dans la microfluidique permet la formation de gradients biomoléculaires^3,4,5,6. Ces gradients jouent un rôle important in vivo lors de la formation et du modelage pendant l'angiogenèse. Cependant, alors que les plates-formes de culture cellulaire microfluidique ont fait preuve d'une pertinence physiologique inégalée par-dessus les méthodes traditionnelles de culture cellulaire 2D et 3D, elles n'ont souvent pas le débit, l'évolutivité et la normalisation nécessaires au dépistage des médicaments. ⁷. De plus, bon nombre de ces plates-formes ne sont pas disponibles dans le commerce et exigent que les utilisateurs finaux reproduisent leurs appareils avant d'utiliser⁸. Cela nécessite non seulement des appareils de fabrication et des connaissances techniques, mais limite également le niveau de contrôle de la qualité et affecte négativement la reproductibilité⁹.

À ce jour, les cellules endothéliales humaines primaires restent la source cellulaire la plus largement utilisée pour modéliser l'angiogenèse in vitro¹⁰. Cependant, les cellules humaines primaires ont un certain nombre de limitations qui entravent leur application courante dans les approches de criblage. Premièrement, il y a une possibilité limitée d'étendre et d'élargir les cultures d'origine cellulaire primaire. Ainsi, pour les expériences à grande échelle, des lots de différents donateurs doivent être utilisés, ce qui entraîne des différences génomiques et des variations de lot à lot. Deuxièmement, après quelques passages, les cellules endothéliales primaires perdent généralement des propriétés pertinentes lorsqu'elles sont cultivées in vitro^11,12.

Les cellules endothéliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC) sont une alternative prometteuse : elles ressemblent aux cellules primaires, mais avec un génotype plus stable qui est également propice à l'édition précise du génome. En outre, les iPSC sont capables de se renouveler eux-mêmes et peuvent donc être étendus en quantités presque illimitées, ce qui fait des cellules dérivées de l'iPSC une alternative attrayante aux cellules primaires pour une utilisation dans les modèles de dépistage in vitro¹³.

Ici, nous décrivons une méthode à la culture des cellules endothéliales comme micronavires 3D perfusables dans une plate-forme standardisée et à haut débit de culture microfluidique de cellules. La perfusion est appliquée en plaçant l'appareil sur une plate-forme de bascule, ce qui assure un fonctionnement robuste et augmente l'évolutivité de l'analyse. Comme les microvaisseaux sont continuellement perfusés et exposés à un gradient de facteurs angiogéniques, la germination angiogénique est étudiée dans un microenvironnement cellulaire plus physiologique pertinent. Bien que le protocole soit compatible avec de nombreuses sources différentes de cellules endothéliales (primaires)^14,15, nous nous sommes concentrés sur l'utilisation d'ECs dérivés de l'iPSC humain afin d'augmenter la normalisation de cet test et de faciliter son intégration dans la recherche sur les médicaments vasculaires.

Protocole

1. Préparation de l'appareil

1. Transférer la plaque microfluidique de 384 puits sur une hotte stérile à flux laminaire.
2. Retirez le couvercle et ajoutez 50 L d'eau ou de salin tamponné par le phosphate (PBS) à chacun des 40 puits d'observation(figure 1b,puits B2) à l'aide d'une pipette multicanal ou répétitive.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Laissez la plaque avec le couvercle dans l'armoire de culture stérile à température ambiante (RT).

2. Préparer le gel et le revêtement

1. Préparer 2,5 ml de 10 g/mL de fibronectin (FN). Diluer 25 'L de 1 mg/mL de cofibrose dans 2,5 ml de PBS de Dulbecco (sans PBS, calcium et magnésium). Placez la solution dans le bain d'eau à 37 oC jusqu'à l'utilisation.
2. Préparer 100 l l de solution de collagène-1. Ajouter 10 l de HEPES (1 M) à 10 oL de NaHCO₃ (37 g/L) et mélanger par pipetting. Placer le tube sur la glace et ajouter 80 oL de collagène-1 (5 mg/mL) pour produire une concentration neutralisée de collagène-1 de 4 mg/mL. Utilisez une pipette pour mélanger soigneusement et éviter la formation de bulles.
3. Ajouter 1,5 l de solution de collagène-1 (4 mg/ml) à l'inlet de gel de chaque unité microfluidique (Figure 1b, bien B1). Assurez-vous que la gouttelette de gel est placée au milieu de chaque puits afin que le gel pénètre dans le canal (voir Figure 2a).
   REMARQUE: Les guides de phase empêchent le remplissage des canaux adjacents et permettent le modelage du gel. La charge correcte de gel peut être confirmée sous un microscope de brightfield en observant la formation de ménisque par la « fenêtre d'observation » (bien B2) ou en renversant la plaque à l'envers. Si le gel n'a pas complètement rempli le canal, une gouttelette supplémentaire de 1 L peut être ajoutée.
4. Placer la plaque microfluidique dans un incubateur (37 oC, 5 % de CO₂) pendant 10 min pour polymériser le collagène-1.
   REMARQUE: Le moment de la polymérisation est crucial; en raison des faibles volumes utilisés dans la microfluidique, l'évaporation peut déjà être observée après 15 min d'incubation, ce qui entraîne l'effondrement du gel ou le rétrécissement.
5. Sortez la plaque de l'incubateur et transférez-la dans une hotte stérile à flux laminaire.
6. Ajouter une solution de revêtement FN de 50 oL de 10 g/mL à la sortie du canal de perfusion supérieure de chaque unité microfluidique (Figure 1b,bien A3). Appuyez sur la pointe de la pipette contre le côté du puits pour un remplissage correct du puits sans piéger les bulles d'air (voir Figure 2b). Le canal doit se remplir, et le liquide doit épingler sur la prise (bien C1) sans bien remplir la prise.
7. Placer la plaque dans l'incubateur (37 oC, 5 % de CO₂) pendant au moins 2 jours.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici, comme le gel de collagène-1 avec le mélange de revêtement est stable pendant au moins 5 jours dans l'incubateur. Si le mélange de revêtement est rafraîchi, des périodes plus longues pourraient être possibles, mais cela n'a pas été testé. Crucial est le niveau de FN-enduit, car cela empêche la déshydratation du gel de collagène-1.

3. Ensemencement cellulaire/Culture des micronavires

1. Ajouter 5 ml de sérum fœtal de veau et 2,5 ml de stylo/streptocoque à 500 ml de milieu de culture de cellules endothéliales basal et filtrer la stérilisation à l'aide d'un filtre de dessus de bouteille avec la taille de 0,22 m pore. Ce médium est maintenant appelé milieu basal.
2. Préparer le milieu de croissance vasculaire : Ajouter 3 'L de 50 'g/mL facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) et 2 'L de 20 facteurs de croissance de base de fibroblaste de 20 'g/mL (bFGF) à 5 mL de milieu basique.
3. Décongeler rapidement les iPSC-EC congelés (1 min) dans un bain d'eau de 37 oC et transférer dans un tube de 15 ml et diluer dans 10 ml de milieu basal.
4. Comptez les cellules.
   REMARQUE: Une seule fiole contient 1 million de cellules dans 0,5 ml avec une viabilité de 90 %.
5. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 5 min. Aspirate supernatant sans déranger la pastille cellulaire et resuspendre dans le milieu basal pour donner une concentration de 2 x 10⁷ cellules/mL.
6. Transférer la plaque microfluidique de 384 puits de l'incubateur à une hotte stérile à flux laminaire.
7. Aspirate NT-coating solution de l'infusion dansle (bien A1). Ajouter 25 l l de milieu basal dans les puits d'inlet (bien A1).
8. Ajouter une gouttelette de 1 llet de suspension cellulaire à chaque perfusion supérieure bien (Figure 1b, bien A1). La gouttelette devrait s'aplatir en quelques secondes (voir figure 3a,b pour une illustration de cette méthode de « pompage passif »).
   REMARQUE : Vérifiez au microscope si l'ensemencement est homogène. Si ce n'est pas le cas, ajouter un autre 1 l dans la prise et attendre que la gouttelette s'aplatisse.
9. Incuber la plaque de puits microfluidique pendant 1 h à 37 oC, 5 % DE CO_2. Après cela, les cellules auraient dû adhérer. Sinon, attendez encore 30 min.
10. Retirez le milieu basal des puits de sortie de perfusion supérieurs (Figure 1b, puits A3). Ajouter le milieu de culture des navires chauds dans l'intrafusion supérieure et la sortie (Figure 1b, puits A1 et A3). Placer la plaque sur la plate-forme de bascule (fixée sur un angle de 7 degrés, 8 min d'intervalle de bascule) dans l'incubateur (37 oC, 5 % CO₂).
11. Imagez la plaque à l'aide d'un microscope à champ lumineux avec un stade automatisé au jour 1 et 2 après l'ensemencement pour confirmer la viabilité cellulaire. Après 2 jours, un monocouche confluente aurait dû se former contre l'échafaudage de collagène-1.
    REMARQUE: Si les canaux ne semblent pas être également confluents, les micronavires peuvent être cultivés pendant 24 h supplémentaires.

4. Étudier le sproutage angiogénique, y compris la formation de cellules de pointe et de tige

1. Préparer 4,5 ml de milieu de germination angiogénique en complétant le milieu basal avec 4,5 l de VEGF (50 g/mL de stock), 4,5 l de phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) (2 'g/mL stock), et 2,25 'L de sphingosine-1-phosphate (S1P) (1 mm stock).
2. Préparer 8,5 ml de milieu de croissance des navires (milieu basal complété de 30 ng/mL VEGF et 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirez le milieu des puits et ajoutez 50 l de milieu de culture de récipient frais dans l'inlet de perfusion supérieure et les puits de sortie et les puits d'infusion et de sortie de gel(figure 1b, puits A1, A3, B1 et B3).
4. Ajouter 50 l de mélange de germes angiogéniques à chacune des canalisons de perfusion inférieures et puits de sortie(figure 1b, puits C1 et C3).
5. Placez l'appareil dans l'incubateur (37 oC, 5 % DE CO₂) sur la plate-forme de bascule afin de former un gradient de facteurs de croissance angiogéniques.
6. Image 1 jour et 2 jours après l'addition des facteurs de croissance angiogénique s'utilisant un microscope de brightfield avec l'étape automatisée.
   REMARQUE: Continuer à cultiver les micronavires pour étudier l'anastomose (aller à la section 5) ou fixer et tacher les micronavires pour quantifier la longueur de germination et la morphologie au jour 2 et jour 6 (aller à la section 6).

5. Étudier l'anastomose et la stabilisation des germes

1. Image utilisant un microscope de brightfield avec la scène automatisée.
2. Ajouter 1 l'albumine fluorescente (0,5 mg/mL) à l'intramane de perfusion supérieure(figure 1b,bien A1) et mélanger à l'aide d'une pipette de 50 l.
3. Transférer la plaque sur un microscope fluorescent à l'étage automatisé et à l'incubateur fixé à 37 oC. Définir le microscope à 10 x objectif et corriger les paramètres d'exposition (p. ex., la tétraméthylrhodamine [TRITC]-canal, 20 ms d'exposition). Acquérir des images en accéléré chaque minute pendant 10 minutes.
4. Retirer la plaque du microscope et la transférer dans une hotte stérile à flux laminaire.
5. Retirer tout le milieu des puits et remplacer à la fois le milieu de culture du navire et le milieu de germination angiogénique dans les puits correspondants (voir les étapes 4.3 et 4.4).
6. Remettre l'appareil dans l'incubateur (37 oC, 5 % de CO₂₎pour continuer la germination angiogénique.
7. Répétez les étapes 5.1-5.6 pour étudier la perméabilité au jour 6.

6. Fixation, coloration et imagerie

1. Aspirez tous les médias culturels de tous les puits.
   REMARQUE: Le milieu ou les liquides résiduels dans les canaux microfluidiques n'influencent pas la fixation en raison de son faible volume de 1/2 L.
2. Ajouter 25 lde de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS à tous les puits de perfusion(figure 1b,A1 et C1) et les puits de sortie(figure 1b, A3 et C3). Incuber pendant 10 min à RT. Placez l'appareil sous un léger angle (5 degrés) pour induire le débit (p. ex., en plaçant un côté de la plaque sur un couvercle).
3. Aspirez PFA des puits. Lavez toutes les perfusions et les prises deux fois avec 50 L de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS). Aspirez HBSS des puits.
4. Perméabilize à RT pendant 10 min en ajoutant 50 L de 0,2% de surfactant nonionic à toutes les entrées et sorties de perfusion.
5. Aspirez le surfactant nonionic des puits. Laver les canaux de perfusion deux fois en ajoutant 50 L de HBSS à tous les puits d'entrée et de sortie de perfusion. Aspirez HBSS des puits.
6. Tainer les noyaux à l'aide de Hoechst (1:2,000) et F-actin en utilisant la phalloidin (1:200) dans HBSS. Préparer 2,2 ml pour 40 unités et ajouter 25 L à chaque perfusion et bien sortir. Placer la plaque sous un léger angle et couver à RT pendant au moins 30 min.
7. Laver deux fois avec 50 L de HBSS dans toutes les perfusions et les prises.
8. Image directe à l'aide d'un microscope fluorescent à l'étape automatisée ou entreposez la plaque protégée de la lumière à 4 oC pour une utilisation ultérieure.

Résultats

La plate-forme de culture cellulaire 3D microfluidique se compose de 40 unités microfluidiques perfusées (Figure 1a,b), qui est utilisée pour étudier la germination angiogénique de micronavires perfusés contre un gel de collagène-1 à motifs (Figure 1c). Ces micronavires sont continuellement perfusés et exposés à un gradient de facteurs de croissance angiogéniques (figure 3a-d). Les germes angiogéniques peuvent être étudiés 2 jours après l'exposition au gradient ou cultivés pendant plus de 5 jours après l'exposition au gradient pour étudier l'anastomose et la stabilisation des germes (voir chronologie, figure 1d).

L'ensemencement des iPSC-EC à l'aide de la méthode de pompage passif devrait entraîner des densités d'ensemencement homogènes (figure 4a,b). La culture sous perfusion continue a eu comme conséquence des microvessels de confluent en 2 jours, avec les cellules doublant complètement la circonférence du canal microfluidique et la formation d'une monocouche de confluent contre le gel modelé de collagène-1.

L'exposition à un gradient de facteurs angiogéniques a entraîné la germination angiogénique directionnelle des microvaisseaux dans le gel de collagène-1 à motifs(figure 5a-g). La formation et l'invasion claires de cellules de pointe dans le gel de collagène-1 étaient visibles 24 h après l'addition du gradient angiogénique, alors que les cellules de tige comprenant la formation de lumen étaient visibles après 48 h (figure 5a).

Après fixation et coloration, le réseau capillaire peut être visualisé à l'aide de phalloidin pour tacher F-actin et en utilisant Hoechst 33342 pour tacher le noyau (Figure 5b,c). Ces germes peuvent être quantifiés (p. ex., forme et longueur¹⁴). Sans ajout de facteurs de croissance, aucune invasion dans le gel de collagène-1 ne doit être observée (Figure 5d). L'imagerie confocale a été utilisée pour déterminer le diamètre de la pousse et pour confirmer la formation de lumen(figure 5e-g).

Les germes continuent de croître vers la direction du gradient et atteignent le canal de perfusion opposé dans les 3 à 4 jours suivant l'ajout de facteurs de croissance angiogéniques. Il en résulte un remodelage du réseau vasculaire, avec une nette réduction du nombre de germes angiogéniques (Figure 6a). La formation de Lumen a été évaluée par perfusion du réseau vasculaire avec les macromolécules fluorescentes étiquetées (par exemple, albuminou dextrans). Persiner les micronavires avec 0,5 mg/mL étiqueté albumin avant et après l'anastomose a révélé une nette différence dans la perméabilité des germes après 10 min (Figure 6b-e), ce qui suggère que les capillaires se stabilisent et mûrissent après l'anastomose.

Figure 1 : Protocole de culture cellulaire microfluidique pour les micronavires dérivés de l'iPSC. (a) Le fond du dispositif de culture cellulaire microfluidique est représenté affichant les 40 unités microfluidiques qui sont intégrées sous la plaque de 384 puits. Une vue plus grande affiche l'une des 40 unités microfluidiques. ( b) Chaque unité microfluidique est positionnée sous 9 puits avec 3 puits d'inlet et 3 puits de sortie. Les canaux microfluidiques sont séparés par des crêtes (« guides de phase »), qui permettent la modelage des hydrogels dans le chenal central (« canal de gel ») pendant qu'il y a encore un contact avec les canaux adjacents (« canaux de perfusion »). (c) Méthode de culture d'un microvessel perfused dans le dispositif microfluidique, qui est utilisé pour étudier la germination angiogénique entraînée par gradient à travers une matrice de collagène-1 à motifs. d) Chronologie de l'étude de la germination angiogénique et/ou de l'anastomose. Ce chiffre a été modifié par van Duinen et^al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Procédures de chargement pour gel et milieu. (a) Exemples de dépôt de gel correct et incorrect. Le dépôt correct a des résultats dans un gel de collagène-1 modelé dans le canal moyen, qui est plus tard polymérisé. (b) Exemples de remplissage correct et incorrect des puits. Les puits sont remplis de l'ordre de 1/4 pour empêcher le piégeage des bulles d'air dans les canaux microfluidiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Pression hydrostatique continue entraînée par le débit et la stabilisation du gradient. (a) Les différences de pression hydrostatique entre les puits entraînent un nivellement passif et un écoulement dans les canaux microfluidiques. ( b) Placer l'appareil sur une plate-forme de bascule à 7 et 8 minutes de temps de cycle entraîne une perfusion bidirectionnelle continue dans les canaux microfluidiques. (c) Les gradients sont formés en introduisant deux concentrations différentes dans les puits, qui sont continuellement rafraîchies par un nivellement passif. d) Visualisation de gradient utilisant l'isothiocyanate de fluorescein (FITC)-dextran. Le débit bidirectionnel stabilise le gradient jusqu'à 3 jours. Barre d'échelle de 200 m. Ce chiffre a été modifié par van Duinen et^al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Méthode de pompage passif pour l'ensemencement cellulaire. (a) Le pompage passif est entraîné par des différences de pression causées par des différences de tension de surface. Il en résulte un flux de la gouttelette (haute pression interne) vers le réservoir (faible pression interne). (b) Délai d'une gouttelette (contour gris) qui est placée au-dessus de l'inlet (contour blanc) du canal microfluidique (contour bleu). Juste après l'addition (Figure 4b, i), la gouttelette au-dessus de l'inlet se rétrécit (Figure 4b, ii: 1 s après ajout; iv: 2 s après ajout), ce qui entraîne un flux vers la prise. Cela se poursuit jusqu'à ce que le ménisque gouttelette soit épinglé par l'aube (Figure 4b, iv). Barre d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Germination 3D robuste de micronavires iPSC-EC. (a) Sprouting de iPSC-EC au fil du temps. Les micronavires ont été cultivés pendant 48 h (à droite) puis stimulés avec un cocktail angiogénique contenant 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P, et 2 ng/mL PMA. Les premières cellules de pointe qui envahissent l'échafaudage de collagène-1 (au milieu) sont visibles 24 h après l'exposition. Les premiers lumens sont visibles (flèches) 48 h après exposition (à droite) tandis que les cellules de pointe ont migré plus loin dans la direction du gradient. b) Tableau de 15 micronavires qui ont été stimulés avec VEGF, S1P et PMA pendant 2 jours et tachés pour F-actin (jaune) et noyaux (bleu). Barre à l'échelle de 200 m. (c) Micronavire stimulé (contrôle positif). d) Microvessel non stimulé (contrôle négatif). (e) La projection maximale d'un seul capillaire dans le gel. (f) Même que (g) mais axé sur le milieu. La ligne pointillée indique la position de la vue orthogonale dans le panneau g. Barres d'échelle (a-d : 200 m ; e-g : 20 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Visualisation de la perméabilité des germes angiogéniques avant et après l'anastomose. (a) L'anastomose avec canal basal déclenche l'élagage et la maturation des germes angiogéniques. Plan rapproché du lit capillaire à 2, 4, 6 et 7 jours après stimulation avec des facteurs de croissance angiogéniques. (b) Les germes angiogéniques après 2 jours après l'ajout de facteurs de croissance angiogéniques. Les germes angiogéniques sont formés dans le gel, mais ne sont pas encore connectés au canal de perfusion inférieure. (c) Perfusion du micronavire avec une solution de 0,5 mg/mL d'albumine-Alexa 555. Images fluorescentes obtenues à 0 et 10 min. (d,e) Même que dans les panneaux b et c, mais après 7 jours de stimulation. Les germes sont reliés à l'autre côté et forment un micro-navire confluent dans le canal de perfusion basale. Barres d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Problème	Cause	Solution
Le collagène-1 n'entre pas ou ne remplit pas complètement le canal	La gouttelette de collagène-1 n'est pas placée sur le dessus de l'inlet	Placer délicatement la gouttelette sur le dessus de l'inlet du canal gel
	Le volume de collagène-1 est trop faible	Utilisez 1,5 l de gel pour remplir complètement le canal
	Le collagène-1 est trop visqueux	Utiliser un autre lot de collagène-1
Le collagène-1 se jette dans les canaux de perfusion	Le collagène-1 est pipetted directement dans l'entrée du canal de gel	Placer délicatement la gouttelette sur le dessus de l'inlet du canal gel
Le collagène-1 n'est pas clair/formation de fibre	Le collagène-1 n'est pas stocké correctement	Conserver le collagène-1 à 4 oC, ne pas congeler
	NaHCO3 et HEPES ne sont pas bien mélangés avant d'ajouter du collagène-1	Mélanger délicatement le NaHCO3 et le HEPES par pipetting avant d'ajouter le collagène-1
Droplet ne rétrécit pas à l'aide de la méthode de pompage passif	Droplet adhère au côté du puits	Aspiratedroplet et ajouter de nouvelles gouttelettes sur le dessus de l'inlet
		Assurez-vous que la prise est bien remplie d'au moins 20 l de milieu
Aucune germination n'est observée	Les facteurs de croissance ne sont pas ajoutés ou les aliquots ne sont pas stockés correctement	Préparer le milieu de germination angiogénique frais
	Blocs d'air perfusion / formation de gradient	Retirez les bulles d'air à l'aide d'une pipette P20 ou P200
	Différences de volume entre les puits	Les volumes dans tous les puits doivent être égaux afin de former un gradient linéaire
Cellules non viables	Plaque non placée sur la plate-forme de bascule/plate-forme de bascule éteinte	Assurez-vous que la plate-forme de bascule est allumée et a le bon temps de cycle/angle (8 min/7)
	Aucune perfusion possible en raison de la présence de bulles d'air	Retirez les bulles d'air à l'aide d'une pipette P20 ou P200
Aucun lumens ne se forme, les cellules migrent sous forme de cellules	Le mélange de germination angiogénique a été ajouté avant qu'un monocouche ait été formé	Attendez 24 h de plus avant d'ajouter les facteurs de croissance angiogéniques
Variation majeure de la densité de germination	Différences dans les densités cellulaires après l'ensemencement	Vérifiez si la densité cellulaire est homogène et comparable entre les unités microfluidiques. Ajouter une autre gouttelette de suspension cellulaire si nécessaire

Tableau 1 : Erreurs courantes de dépannage.

Discussion

Cette méthode décrit la culture de 40 micronavires endothéliaux perfusables au sein d'une plate-forme de culture cellulaire microfluidique robuste et évolutive. Comparée aux méthodes traditionnelles de culture cellulaire 2D et 3D, cette méthode montre comment un microenvironnement cellulaire physiologique pertinent qui comprend des gradients et une perfusion continue peut être combiné avec la culture cellulaire 3D avec un débit adéquat pour le dépistage Fins.

L'un des principaux avantages par rapport aux essais microfluidiques comparables est que cette méthode ne repose pas sur des pompes pour la perfusion, mais utilise une plate-forme de bascule pour induire une perfusion continue dans toutes les unités microfluidiques simultanément. Cela garantit que l'analyse est robuste et évolutive : les plaques peuvent être empilées sur une plate-forme de bascule. Fait important, toutes les unités microfluidiques restent individuellement adressables, ce qui permet à cette méthode d'être mise en œuvre dans le cadre du dépistage des médicaments, y compris la génération d'une courbe dose-réponse. De plus, sans pompe, l'imagerie et le remplacement moyen sont beaucoup plus simples avec moins de risque de contamination (croisée).

Un autre avantage de cette méthode est l'utilisation d'une plate-forme normalisée et préfabriquée, tandis que des plates-formes comparables de culture cellulaire microfluidique doivent être fabriquées par les utilisateurs finaux. Cette disponibilité facilite l'adoption de cet analyse parmi d'autres groupes de recherche universitaire et pharmaceutique, conduisant à la normalisation. De plus, contrairement aux prototypes microfluidiques, l'interface de plaques de 384 puits assure la compatibilité avec l'équipement de laboratoire actuel (p. ex., aspirateurs, manutentionnaires de plaques et pipettes multicanaux), ce qui facilite l'intégration dans l'infrastructure de criblage actuelle. .

Il y a plusieurs étapes critiques dans l'exécution de cet analyse. Le gel de collagène-1 devrait remplir complètement le canal de gel. Pendant la charge du gel, cette obturation peut être observée en inspectant les canaux microfluidiques soit par la fenêtre d'observation (Figure 2a) ou en renversant la plaque à l'envers (comme le montre la figure 1a). Pendant le remplissage, le gel de collagène doit rester dans le canal central, sans couler dans les canaux de perfusion adjacents. Nous avons remarqué que la qualité du gel de collagène-1 est cruciale pour la bonne performance d'essai. Les lots de collagène-1 avec une viscosité trop élevée mèneront au remplissage incomplet du canal de gel. Après 10 min de polymérisation à 37 oC, le gel doit être homogène et clair. Si le collagène-1 n'est pas stocké correctement (p. ex., en raison des fluctuations des températures dans le réfrigérateur), le collagène polymérisera dans les canaux avec une formation de fibres clairement visible. Ceci peut avoir comme conséquence l'invasion des EC dans le gel sans addition des facteurs angiogéniques, mais sans le développement de lumen approprié.

Lorsque les cellules sont ensetcées, la solution de revêtement de fibronectine est retirée des puits, ne laissant que les canaux microfluidiques remplis de solution de revêtement. L'aspiration de la solution de revêtement à partir de canaux microfluidiques pourrait causer une perturbation du gel ou l'aspiration de gel. La suspension cellulaire doit remplacer/déplacer cette solution de revêtement. Cela fonctionne mieux lorsque la suspension cellulaire est ensemencée en utilisant la méthode de pompage passif, comme directement pipetting la suspension cellulaire dans les canaux montrent des densités d'ensemencement moins reproductibles.

Comme les micronavires forment une monocouche stable contre le gel, ces petites différences n'entraînent que des temps différents nécessaires pour atteindre la confluence. Ainsi, le point de départ de l'assidu est déterminé par la confluence plutôt que par le temps de culture. Si nécessaire, le temps de culture peut être prolongé jusqu'à ce qu'une monocouche claire ait été formée contre le gel.

Dans les puits, les bulles d'air peuvent être piégées par un remplissage incorrect des puits (voir figure 2b). Ces bulles d'air limiteront le flux du milieu, même lorsque l'appareil est placé sur une plate-forme de bascule, et entraîneront l'effondrement du micronavire et la formation de gradient incorrecte. Appuyer sur la pointe de la pipette contre le mur latéral des puits augmentera le succès de remplir complètement le puits. Si une bulle d'air est emprisonnée dans les puits, elle peut être enlevée en insérant doucement une pointe de pipette stérile dans le fond de verre. Des bulles d'air peuvent également se produire dans les canaux microfluidiques. Lorsque le milieu a été retiré des puits, l'évaporation du milieu est perceptible dans les canaux microfluidiques après 30 minutes (en raison des volumes de microlitres dans les canaux). Ainsi, les changements moyens sont de préférence effectués aussi rapidement que possible. Lorsque le milieu est ajouté dans un canal avec milieu évaporé, bulles d'air seront piégés dans les canaux microfluidiques. Ces bulles d'air dans les canaux microfluidiques peuvent être enlevées manuellement en plaçant une pipette P20 directement sur l'aurete ou la sortie et en forçant le milieu à travers les microfluidiques du puits opposé. L'élimination réussie des bulles d'air entraîne une diminution faible mais notable du volume dans l'autre puits. Le tableau 1 répertorie les erreurs courantes et la façon de les dépanner.

L'absence d'une pompe est une limitation lorsque l'imagerie continue est nécessaire, car la plate-forme de bascule limite l'utilisateur à l'image à intervalles de temps séquentiels. En outre, la perfusion du milieu dans cette plate-forme se compose d'écoulement bidirectionnel avec de faibles niveaux de stress de cisaillement, tandis que la vascularisation in vivo est exposée à un flux unidirectionnel avec des niveaux plus élevés de stress de cisaillement. Bien que nous n'observions pas les effets négatifs du flux bidirectionnel en ce qui concerne la germination angiogénique, le flux est un stimulus biomécanique important et de préférence contrôlé. Cependant, bien qu'il existe des configurations de pompe disponibles dans le commerce, l'interfaçage avec la plaque de 384 puits reste difficile et les configurations de la pompe entravent gravement l'évolutivité de cet assay.

La possibilité d'utiliser les iPSC-EC pour étudier la germination angiogénique ouvre de nouvelles possibilités dans la modélisation des maladies et la recherche sur les médicaments. Contrairement aux EC primaires, ces cellules peuvent être générées en quantités presque illimitées avec un génotype stable et en utilisant des techniques d'édition du génome, les cellules peuvent être générées que, y compris les kogènes et knock-ins. Cependant, comme les protocoles visant à différencier les CE de l'iPSC sont relativement nouveaux, on ne sait toujours pas ce qui conduit à des cPE-EC qui reflètent le mieux les CE primaires et quels sous-types d'EC sont ou peuvent être générés. En outre, il reste encore des questions concernant leur pertinence. Par exemple, les iPSC-EC présentent-ils encore la plasticité typique des cellules endothéliales? Et dans quelle mesure les cellules dérivées de l'iPSC réagissent-elles et interagissent-elles avec leur microenvironnement cellulaire? La plate-forme standardisée présentée ici pourrait être utilisée pour répondre à certaines de ces questions afin de valider davantage l'utilisation in vitro des EC dérivés de l'iPSC.

La direction future la plus directe pour cet avertissement sera l'intégration d'autres types de cellules qui jouent un rôle important pendant l'angiogenèse, tels que les péricytes et les macrophages. Cela facilitera la capacité d'étudier le rôle des macrophages pendant l'anastomose entre les germes ou l'adhérence des péritytes après la formation capillaire. En outre, il est possible de culture de divers autres types de cellules à l'intérieur ou contre une matrice extracellulaire (par exemple, nous avons montré la culture des neurones et diverses structures épithéliales telles que les tubules proximal et les intestins grêles), qui peuvent être combinés avec le vasculaire lits générés à l'aide de cette méthode. Enfin, il sera intéressant d'étudier la germination angiogénique dans les hydrogels synthétiques, car leur composition définie augmente encore la normalisation de l'analyse et permet l'accord agede de la rigidité et des motifs contraignants qui affectent les interactions cellule-matrice.

En conclusion, cette méthode montre la faisabilité des EC dérivés de l'iPSC dans un analyse angiogénique 3D standardisée et évolutive qui combine les conditions physiologiques pertinentes de la culture dans une plate-forme qui a la robustesse et l'évolutivité requises pour être intégrée s'intégrer dans l'infrastructure de dépistage des drogues.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 à 10 &mu ; L Pipette à répétition électronique	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
OrganoPlate 3 voies	Mimetas	4003-400B
4 % PFA in PBS	Alfa Aesar	J61899
Milieu de culture basal	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2,5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL dans l’eau milliQ
HBSS	Gibco	14025-050
Sondes moléculaires	Hoechst	H3569	10 mg/mL solution dans l’eau
Cellules endothéliales dérivées d’iPSC	NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L en milliQ
eau OrganoPlate Perfusion Rocker Mini	Mimetas		Plate-forme à bascule utilisée pour fournir un débit
Pen/	Strep Sigma	P4333
Phalloidin	Sigma	P1951	1 mg/mL DMSO
PMA	Focus-Biomolécules	10-2165	2 &mu ; g/mL dans du PBS contenant 0,1 % de DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM dans du méthanol contenant 1 % d’acide acétique
TRITC-albumine	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 &mu ; g/mL dans de l’eau contenant 0,1 % de BSA