Article de méthode

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

DOI :

10.3791/59690

⸱

11 juillet 2019

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présente la reprogrammation des cellules mononucléaires périphériques de sang pour induire des cellules souches neurales par l'infection de virus de Sendai, différenciation des iNSCs dans les neurones dopaminergiques, transplantation des précurseurs de DA dans le unilatéralement-lesioned Modèles de souris de la maladie de Parkinson, et évaluation de l'innocuité et de l'efficacité des précurseurs d'AD dérivés de l'iNSC pour le traitement de la MALADIE.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maladie de Parkinson (MP) est causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mesencephalon ventral (VM). La thérapie de remplacement de cellules est grande promesse pour le traitement de la. Récemment, les cellules souches neurales induites (iNSC) ont émergé en tant que candidat potentiel pour la thérapie de remplacement cellulaire due au risque réduit de formation de tumeur et à la plasticité pour donner lieu à neurones et gliales spécifiques à la région. Les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires somatiques autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules. Comparé à d'autres types de cellules somatiques, les PBMNC sont un type attrayant de cellule de démarrage en raison de la facilité d'accès et d'expansion dans la culture. Le virus Sendai (SeV), un virus non intégrateur à ARN, codant des facteurs de reprogrammation tels que l'OCT3/4humain, LE SOX2, le KLF4 et le c-MYC, a un génome à sens négatif, à brin unique et non segmenté qui ne s'intègre pas dans génome hôte, mais ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation. Dans cette étude, nous décrivons un protocole dans lequel les iNSCs sont obtenus en reprogrammant des PBMNC, et différenciés en neurones spécialisés de DA de VM par une méthode en deux étapes. Ensuite, les précurseurs d'AD sont transplantés dans des modèles de souris à lésion à 6-hyroxydopamine (6-OHDA) pour évaluer l'innocuité et l'efficacité du traitement de la. Cette méthode fournit une plate-forme pour étudier les fonctions et les effets thérapeutiques des cellules neurales DA spécifiques au patient in vitro et in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maladie de Parkinson (MP) est un trouble neurodégénératif commun, causé par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mésencéphalon ventral (VM), avec une prévalence de plus de 1% dans la population de plus de 60 ans 1 Fois , 2. Au cours de la dernière décennie, la thérapie cellulaire, visant à remplacer les cellules dégénératives ou endommagées, ou à nourrir le microenvironnement autour des neurones en dégénérescence, a montré un potentiel dans le traitement de la3. Pendant ce temps, la technologie de reprogrammation a fait des progrès significatifs4, qui fournit une source cellulaire prometteuse pour la thérapie de remplacement. Il a été prouvé que les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC) et les cellules souches embryonnaires (ESC) sont capables de se différencier en cellules neurales DA, qui pourraient survivre, maturate et améliorer les fonctions motrices lorsqu'elles sont greffées dans des modèles de MP de primates non humains5 ,6,7,8. iPSCs représentent une étape importante dans les technologies de reprogrammation cellulaire et ont un grand potentiel dans la transplantation cellulaire; cependant, il y a toujours une préoccupation au sujet du risque de formation de tumeur des cellules incomplètement différenciées. Une autre source cellulaire pour la transplantation cellulaire est les cellules souches adultes établies par lignée obtenues par reprogrammation directe, telles que les cellules souches neurales induites (iNSC), qui peuvent être dérivées des intermédiaires instables, en contournant la pluripotence étape9,10,11.

Les iPSC et les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules12,13,14, réduisant ainsi le immunogénicité des cellules transplantées dans une large mesure. En outre, par rapport aux iPSC, les iNSC sont inhérents à un risque réduit de formation tumorale et de plasticité liée à la lignée, seulement capable de se différencier en neurones et en gliales11. Dans les études initiales, les iPSC humains ou de souris et les iNSC ont été générés à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsies de la peau, qui est une procédure invasive14,15. À cet égard, les PBMNC sont une source attrayante de cellules de démarrage en raison du processus d'échantillonnage moins invasif, et de la facilité d'obtenir un grand nombre de cellules dans un court laps de temps d'expansion16. Les premières études de reprogrammation ont utilisé des systèmes d'administration intégratif, tels que des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux, qui sont efficaces et faciles à mettre en œuvre dans de nombreux types de cellules17; cependant, ces systèmes d'administration peuvent causer des mutations et la réactivation des transgènes résiduels, qui présentent des problèmes de sécurité à des fins thérapeutiques cliniques12. Le virus Sendai (SeV) est un virus à ARN non intégratif dont le génome à un seul brin à sens négatif ne s'intègre pas dans le génome de l'hôte, mais qui ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation18 ,19. Des vecteurs SeV recombinants sont disponibles qui contiennent des facteurs de reprogrammation, y compris l'humain OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC dans leurs cadres de lecture ouverts. En outre, les vecteurs viraux SeV peuvent être encore améliorés en introduisant des mutations sensibles à la température, de sorte qu'ils pourraient être rapidement enlevés lorsque la température de la culture est élevée à 39 oC20. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour reprogrammer PBMNCs aux iNSCs utilisant le système de SeV.

De nombreuses études ont rapporté la dérivation des neurones DA à partir d'ESC sais humains ou iPSCs en utilisant diverses méthodes6,8,21. Cependant, il ya une pénurie de protocoles décrivant la différenciation des neurones DA des iNSCs dans les détails. Dans ce protocole, nous décrirarons la génération efficace de neurones DA à partir d'iNSCs en utilisant une méthode en deux étapes. Les précurseurs neuronaux DA peuvent être transplantés dans le striatum des modèles de souris pour des évaluations de l'innocuité et de l'efficacité. Cet article présentera un protocole détaillé qui couvre diverses étapes de la génération de cellules souches neurales induites par le virus Sendai, la différenciation des iNSCs dans les neurones DA, l'établissement de modèles de de souris, à la transplantation des précurseurs de DA dans le striatum des modèles. En utilisant ce protocole, on peut générer des iNSC à partir de patients et de donneurs sains et dériver des neurones DA qui sont sûrs, standardisables, évolutifs et homogènes à des fins de transplantation cellulaire, ou pour la modélisation de la DP dans un plat et l'étude des mécanismes l'évolution et le développement de la maladie sous-jacente.

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Protocole

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Toutes les procédures doivent suivre les lignes directrices du comité institutionnel d'éthique de la recherche humaine. Le consentement éclairé doit être obtenu auprès de patients ou de volontaires en bonne santé avant la collecte de sang. Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche humaine de l'établissement et a été exécuté conformément aux lignes directrices de l'établissement en matière de soins et d'utilisation des animaux.

1. Collecte, isolement et expansion des PBMNC

  1. Collection de PBMNCs
    1. Recueillir 10-20 ml de sang veineux périphérique du donneur par venipuncture à l'aide d'un flacon de conservation de l'héparine de sodium.
      REMARQUE : Les échantillons de sang doivent être entreposés ou expédiés à température ambiante (RT). Traiter les échantillons de sang dans les 24 h.
  2. Préparation du milieu de culture
    1. Préparer le milieu sans sérum (SFM) en combinant les composants suivants : 245 ml du milieu modifié de Dulbecco (IMDM) d'Iscove, 240 mL de F-12 de Ham, 5 mL de supplément d'insuline-transferin-sélénium-X (ITS-X), 5 mL de solution de stock de glutamine 100x (tableaude Matériaux), 5 ml de concentré lipidique défini chimiquement, 2,5 g de sérum bovin fœtal, 0,025 g d'acide ascorbique et 9 l de 1 thioglycérol. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
      CAUTION : L'acide ascorbique et le 1-thioglycérol sont toxiques par contact cutané et par inhalation.
    2. Pour préparer le milieu des cellules mononucléaires (MNC), compléter le milieu SFM par un interleukin humain de 10 ng/mL 3 (IL-3), 2 U/mL érythropoïétine (EPO), 100 ng/mL facteur de cellules souches humaines (SCF), 40 ng/mL facteur de croissance humain ressemblant à une insuline 1 (IGF-1), 100 g/mL holo-transfert et 1 M dexamethasone. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
      REMARQUE : Préparer le milieu immédiatement avant l'utilisation.
  3. Isolement des PBMNC
    1. Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les conseils à l'aide d'un autoclave.
    2. Transférer le sang périphérique (PB) dans un tube conique de 50 ml et diluer le PB avec un volume égal de salin tamponné par le phosphate (D-PBS) de Dulbecco.
    3. Préparer 15 ml de milieu de gradient de densité stérilisée (Tables of Materials) dans un autre tube conique de 50 ml.
      REMARQUE : Maintenir le milieu de gradient de densité et le PB à RT pour permettre un meilleur isolement des PBMNC.
    4. Inclinez le tube conique contenant le milieu de gradient de densité à un angle de 45 degrés, puis déposez lentement et soigneusement 30 ml de PB dilué sur le milieu de gradient de densité.
      REMARQUE : Faites attention et laissez le PB couler lentement sur le côté du tube conique sur la couche moyenne de gradient de densité. Les globules rouges se déposeront au fond du tube. Inclinez soigneusement le tube pour minimiser les perturbations de l'interface de la couche.
    5. Centrifuger les tubes à 800 x g pendant 15 min à RT avec le frein de centrifugeuse réglé à la position "off". Aspirez la couche de plasma jaune supérieure et jetez-la. Transférer ensuite la couche de film mince nuageuse blanche contenant des MNC avec une pipette de 10 ml à un nouveau tube conique de 50 ml.
      REMARQUE : Il est important de changer de frein de centrifugeuse pour l'isolement des MNC.
    6. Ajouter 30 ml de D-PBS au tube avec les MNC et la centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min à 4 oC. Jeter le supernatant, puis ajouter 45 ml de D-PBS pour re-suspendre les cellules. Centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min à 4 oC.
      REMARQUE : Le frein de centrifugeuse doit être allumé pour cela et les étapes suivantes de centrifugation. Comme les granulés cellulaires sont denses, ajouter 1-2 ml de D-PBS pour re-suspendre doucement les granulés, puis ajouter D-PBS à 45 ml.
    7. Jetez le supernatant et re-suspendre les cellules avec 5 ml de D-PBS et compter les cellules vivantes avec la méthode d'exclusion bleu trypan.
    8. Après avoir mis de côté les MNC nécessaires à l'expansion, congelez les cellules restantes pour une utilisation future.
      REMARQUE : Au moins 5 x 106 MNC peuvent être congelés dans une fiole avec 1 ml de milieu de congélation (Tableau des matériaux). Le protocole peut être mis en pause ici.
  4. Expansion des MNC
    1. Le jour -14, les MNC de semence à une densité de 2-3 x 106 cellules par millilitre dans un puits de six-puits plaques avec 1,5 ml de pré-chauffé (37 oC) MNC milieu. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 2 jours.
    2. Le jour -11, recueillir les cellules et le milieu avec une pipette stérilisée et transférer à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 5 min à RT. Jeter le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml de milieu MNC pré-chauffé (37 oC).
    3. Comptez les cellules viables avec le bleu trypan. Ensemencer les MNC à une densité de 1 x 106 cellules par millilitre dans le milieu MNC pré-chauffé et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant 3 jours.
      REMARQUE : On s'attend à ce que le nombre total de cellules diminue le jour -11.
    4. Le jour -8, répétez les étapes 1.4.2-1.4.3 et culture les cellules pendant 3 jours.
    5. Le jour -4, répétez les étapes 1.4.2-1.4.3 et culture les cellules pendant 3 jours.
      REMARQUE : Après 14 jours de culture, un nombre égal ou supérieur de MNC devrait rester dans la culture.

2. Reprogrammation des PBMNC aux iNSC par infection à seV

  1. Préparation de la solution et du milieu de culture
    1. Préparer une solution de bouillon de poly-D-lysine (PDL) en dissolvant 100 mg de PDL avec 100 mL de H2O à une concentration de 1 mg/mL. Conserver à -20 oC dans 1 ml d'aliquots.
    2. Préparer une solution de stock d'insuline en dissolvant 100 mg d'insuline dans 20 ml de 0,01 N HCl à une concentration de 5 mg/mL. Conserver à -20 oC dans 1 ml d'aliquots.
    3. Pour préparer 200 ml de milieu basal iNSC, combiner 96 ml de DMEM-F12 et 96 ml de milieu de base (Tableau des matériaux) avec 2 ml de solution de stock de glutamine 100x, 2 mL d'acide aminé non essentiel (NEAA), 2 ml de supplément N2 et 2 ml de supplément B27. Ajouter 10 ng/mL recombinant facteur inhibiteur de la leucémie humaine, 3 M CHIR99021 et 2 M SB431542 avant l'utilisation. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
      REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines. Ajouter le facteur inhibiteur de la leucémie humaine recombinant, CHIR99021 et SB431542 immédiatement avant utilisation.
  2. Reprogrammation des PBMNC aux iNSC par infection à seV
    1. Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les pourboires à l'aide d'un autoclave.
    2. Le jour 0, recueillir les cellules dans le milieu MNC et le transférer dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules avec 1 ml de milieu MNC pré-chauffé.
    3. Comptez les cellules viables avec le bleu trypan. Re-suspendre les cellules avec un milieu MNC pré-chauffé (37 oC) à une concentration de 2 x 105 cellules par puits dans des plaques de 24 puits.
    4. Après avoir retiré les tubes SeV de -80 oC de stockage, décongeler les tubes contenant seV dans un bain d'eau de 37 oC pour 5-10 s, puis les laisser décongeler à RT. Une fois décongelés, placez-les immédiatement sur la glace.
    5. Ajouter le SeV encodage humain Klf4, Oct3/4, SOX2 et c-MyC aux puits, à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Centrifugeuses cellules avec plaques à 1000 x g pendant 30 min pour faciliter l'attachement des cellules. Laissez les cellules et le supernatant dans les assiettes. Placer les plaques dans l'incubateur à 37 oC, 5 % de CO2.
      CAUTION: Toutes les procédures impliquant SeV doivent être effectuées dans une armoire de sécurité, et tous les bouts et les tubes doivent être traités avec de l'éthanol ou de l'eau de Javel avant l'élimination.
    6. Le jour 1, transférer le milieu et les cellules dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Rincer le puits avec 1 ml de milieu MNC. Centrifugelant la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules à l'aide de 500 ll de milieu MNC frais et réchauffé dans des assiettes de 24 puits.
      REMARQUE : Utilisez une plaque à faible attachement de 24 puits pour empêcher l'attachement de toutes les cellules avant de placage sur PDL/lamininin.
    7. Le jour 2, diluer 1 ml de 1 mg/mL de PDL avec 19 ml de D-PBS à une concentration de 50 g/mL. Enrober les plaques de 6 puits de 50 g/mL pDL pendant au moins 2 h à RT.
    8. Diluer 200 oL de laminine de 0,5 mg/mL avec 20 ml de D-PBS à une concentration de 5 g/mL. Aspirez PDL dans les plaques de 6 puits, et séchez sur le banc vertical propre.
    9. Enrober les assiettes de 6 puits de laminine de 5 g/mL et incuber de 4 à 6 h à 37 oC. Laver avec D-PBS avant utilisation.
    10. Le jour 3, plaquez les cellules transducées obtenues à l'étape 2.2.6 dans le milieu iNSC sur des plaques de 6 puits enduites de PDL/laminin.
      REMARQUE : Déplacez les plaques doucement si nécessaire après que les cellules sont placées sur des plaques enduites de PDL/laminin, en essayant de ne pas perturber l'attachement des cellules.
    11. Le jour 5, ajouter 1 ml de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) dans chaque puits dans des assiettes de 6 puits en douceur.
      REMARQUE: On s'attend à ce que les cellules subiront la mort drastique (-gt;60%).
    12. Le jour 7, ajouter 1 ml de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) dans chaque puits dans des assiettes de 6 puits en douceur.
    13. Du jour 9 au 28e jour, remplacez le milieu usé par un iNSC frais et préréchauffé (37 oC) tous les jours. Surveiller l'émergence des colonies iNSC. Choisissez et transférez les clones iNSC pour l'expansion dans environ 2-3 semaines. Ramassez les colonies avec une morphologie appropriée à l'aide de pipettes en verre brûlée, à l'exclusion de toute cellule contaminante possible, et aspirez les colonies avec des pointes de 200 L.
      REMARQUE : Les ciseaux caractérisés peuvent être congelés pour une utilisation future avec 2-5 colonies dans une fiole. Le milieu de congélation comprend le milieu basal sans sérum (Tableau des matériaux) et le sulfoxure de diméthyle mélangé à un rapport de 9:1, qui doit être préparé immédiatement avant l'utilisation. Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Différenciation des iNSC aux neurones dopaminergiques

  1. Préparation de la solution et du milieu de culture
    1. Préparer 200 mL de milieu basique de différenciation iNSC en combinant 192 ml de DMEM-F12 avec 2 ml de 100x solution de stock de glutamine, 2 mL de NEAA, 2 mL de supplément N2 et 2 ml de supplément B27.
      REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines.
    2. Préparer l'étape de différenciation iNSC I moyen en complétant le milieu basique de différenciation iNSC avec 1 M SAG1 et 100 ng /mL FGF8b.
      REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines.
    3. Préparer le milieu de l'étape II de différenciation iNSC en complétant le milieu basal de différenciation iNSC avec 0,5 mM de monophosphate d'adénosine cyclique (cAMP), 0,2 mM d'acide ascorbique, 10 M DAPT, 10 ng/mL facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), 10 ng/mL glial dérivé facteur neutrophique (GDNF) et 1 ng/mL transformant le facteur de croissance III (TGF-III).
      REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines.
  2. Enrober les plats de culture
    1. Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les pourboires à l'aide d'un autoclave.
    2. Pour le revêtement PDL, au moins un jour avant de re-placage les cellules, diluer 1 ml de 1 mg/mL de PDL avec 19 ml de D-PBS à une concentration de 50 g/mL. Enrober les couvercles en verre de 12 mm qui ont été stérilisés avec 75 % d'alcool dans les assiettes de 24 puits avec 50 g/mL de PDL à RT pendant au moins 2 h.
    3. Pour le revêtement de lamininin, diluer 200 'L de laminine de 0,5 mg/mL avec 20 ml de D-PBS à une concentration de 5 'g/mL. Aspirez PDL et séchez les puits sur le banc propre. Enrober les couvercles de 12 mm de laminine de 5 g/mL et incuber de 4 à 6 h à 37 oC. Laver avec D-PBS avant utilisation.
  3. Cellules de passage pour la différenciation.
    1. Lorsque la confluence des iNSC cultivés atteint 70-90%, aspirent le milieu de la plaque de culture, et ajouter 1 ml de D-PBS pour laver les cellules. Ajouter 1 ml de résociation cellulaire préréchauffée (37 oC) (tableaudes matériaux)par puits et incuber à 37 oC pendant 3 min pour dissocier les cellules.
    2. Après l'incubation pendant 3 min, les cellules sont devenues semi-flottantes; ajouter 3 mL de dissocié (37 oC) de milieu DMEM-F12 par puits, et des cellules de pipette de haut en bas pour dissocier les granulés de cellules en cellules individuelles.
    3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 250 x g pendant 3 min. Aspirez le supernatant, suspendez à nouveau les cellules avec un volume approprié de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) selon le nombre de cellules.
    4. Comptez les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion bleue trypan. Plaque 5 x 103 cellules par couvercle en verre de 12 mm dans des plaques de 24 puits et incuber à 37 oC, 5 % CO2.
  4. Différencier les iNSC en neurones dopaminergiques.
    1. Commencez la différenciation 24 h après avoir re-placage les cellules sur PDL/laminin-coated coverslips. Aspirer le milieu de culture, laver les cellules une fois avec D-PBS, puis ajouter 600 L de stade de différenciation pré-chauffée I moyen par puits dans des plaques de 24 puits et incuber à 37 oC, 5% CO2.
    2. Changer de moyen tous les jours du jour 1 au jour 10 au cours de la première étape de différenciation.
    3. Le jour 10, aspirer le milieu de culture, et laver les cellules une fois avec D-PBS. Ajouter 600 ll de stade de différenciation préréchauffé (37 oC) moyen II par puits dans des assiettes de 24 puits et incuber à 37 oC, 5 % CO2.
    4. Changer de moyen tous les deux jours du jour 11 au jour 25 au cours de la deuxième étape de différenciation. Les cellules différenciées peuvent être fixées par paraformaldéhyde à différents moments pour l'analyse.
    5. Pour la coloration immunofluorescente, lavez les cellules avec D-PBS trois fois doucement aux points de temps choisis dans le jour de différenciation 11 à 25.
    6. Pipette 300 l de surfactant nonionic (Table of Materials) en 100 ml de PBS pour faire un surfactant nonionic de 0,3% en PBS.
      CAUTION : Le surfactant nonionique est toxique par contact de peau et inhalation.
    7. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min à RT. Ensuite, laver avec 0,3% en PBS trois fois.
      CAUTION : Le paraformaldéhyde est toxique par contact cutané et par inhalation.
    8. Bloquer les cellules par 3% sérum d'âne pendant 2 h à RT.
    9. Diluer l'anticorps primaire dans 1% de sérum d'âne à une concentration appropriée et triturate doucement pour mélanger. Ajouter 300 L de la solution d'anticorps primaire à chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules à 4 oC pendant la nuit. Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois.
    10. Diluer l'anticorps secondaire dans 1% de sérum d'âne à une concentration appropriée et triturate doucement pour mélanger. Ajouter 300 L de la solution d'anticorps secondaire à chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules à RT pendant 2 h, à l'abri de la lumière.
    11. Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois. Diluer 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) avec PBS avec 1:500 dilution. Incuber les cellules dans chaque puits de la plaque de 24 puits avec 300 L de DAPI dilué pendant 15 min à RT, à l'abri de la lumière. Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois.
    12. Sortez délicatement les couvertures des puits de plaques avec des forceps. Sécher dans l'obscurité pendant la nuit à RT. Mount sous un microscope à fluorescence.

4. Établissement de modèles unilatéraux de souris à lésinsde de 6-hyroxydopamine (6-OHDA)

  1. Pour générer des modèles de souris pour la transplantation cellulaire, utilisez des souris mâles adultes SCID-beige pesant 20-25 g pour l'injection de 6-OHDA.
  2. Préparation des médicaments pour la chirurgie
    1. Préparer une solution d'acide ascorbique de 0,2 % en dissolvant 0,2 g d'acide ascorbique en 100 ml de salin stérilisé (0,9 %) et conserver à -80 oC jusqu'à utilisation. Le jour de la chirurgie, diluer 0,2% de solution d'acide ascorbique par 10 fois pour obtenir une solution d'acide ascorbique de 0,02%.
      REMARQUE : L'acide ascorbique est ajouté pour empêcher l'oxydation de 6-OHDA à une forme inactive.
    2. Pour préparer une solution 6-OHDA, peser la quantité appropriée de 6-OHDA dans un tube stérilisé de 1 ml, puis ajouter un certain volume d'acide ascorbique de 0,02 % pour faire une solution de 5 g/L 6-OHDA. Vortex le mélange jusqu'à ce qu'il soit dissous. Placer le 6-OHDA sur la glace jusqu'à l'utilisation.
      REMARQUE : 6-OHDA est sensible à la température et à la lumière. Veillez à protéger la solution de la lumière et à la garder sur la glace avant de l'utiliser.
  3. Préparer l'équipement chirurgical stérilisé en autoclantavant avant la chirurgie. Nettoyez tous les équipements et surfaces avec de l'éthanol lors de la mise en place du cadre stéréotaxique. Installez une cage de récupération de souris sous une lampe chauffante.
  4. Effectuer la chirurgie pour établir des modèles de souris unilatérals 6-OHDA-lesioned.
    1. Pesez chaque souris, enregistrez le poids et calculez la quantité de médicament qui doit être administrée. Chaque souris reçoit 0,5 mg/kg d'atropine 20 min avant les opérations. Anesthésiez la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine.
    2. Administrer 0,5 mg/kg d'atropine par injection intrapéritonéale.
    3. Anesthésiez la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale 20 min après administration d'atropine.
    4. Mettez la souris dans une chambre fermée. Après 3-5 min, la souris sera profondément anesthésié sans réponse à la pince de la jambe arrière.
      REMARQUE : On s'attend à ce que la souris qui a reçu l'anesthésie connaîtrait une période d'excitation.
    5. Raser la tête de la souris et appliquer onduleur oculaire érythromycine sur les yeux de la souris pour la protection contre le développement des ulcères cornéens.
    6. Placez la souris sur l'appareil stéréotaxique. Fixer la souris avec des barres d'inciseur tout d'abord. Insérez correctement les oreillettes pour que la tête de la souris soit en position plate et sécurisée.
    7. Stériliser la tête de la souris avec de l'iode de povidone et de l'alcool isopropyl. Couper une incision sagittale (1,5 cm) sur la peau de la tête avec une lame de scalpel, et exposer le crâne. Ajuster la barre d'inciseur et les barres d'oreilles pour réduire la différence de hauteur entre le bregma et le lambda à moins de 0,1 mm.
      REMARQUE: Le bregma de souris est situé à l'intersection des sutures coronales et sagittales, et lambda est à l'intersection des sutures lambdoid et sagittale.
    8. Déplacez lentement et abaissez la pointe de l'aiguille vers bregma et traitez le bregma comme un point zéro. Déplacez la pointe vers une position avec des coordonnées de A/P 0,5 mm, M/L -2,1 mm par rapport à bregma. Retirez la pointe et marquez le point. Burr un petit trou dans le crâne.
    9. Extrait de 2 l de 5 'g/L 6-OHDA solution dans la microsyringe (Tableau des matériaux). Remettre l'aiguille au point marqué et insérer l'aiguille sur D/V -3,2 mm.
    10. Injecter 2 'L de 5 'g/L 6-OHDA solution (10 'g au total) à un taux de 1 'L/min. Une fois l'injection de 6-OHDA terminée, laissez l'aiguille en place pendant 5 min. Puis rétractez l'aiguille d'injection lentement.
    11. Fermez l'incision avec des sutures et appliquez l'onpomation d'oeil d'érythromycine sur les yeux de la souris. Fournir 0,5 mL de saline sous-cutanée pour prévenir la déshydratation, et appliquer une pommade antibiotique directement sur la peau suture.
    12. Retirez la souris de l'appareil stéréotaxique et mettez-la dans la cage de récupération. Remettez la souris en arrière et laissez accès à la nourriture et à l'eau jusqu'à ce qu'elle retrouve conscience. Traiter la souris avec un analgésique dans l'eau potable quotidienne après la chirurgie pendant 2-3 jours, et une dose recommandée d'ibuprofène est de 0,03 mg/g de poids corporel par jour.
    13. Inspecter la souris tous les jours après la chirurgie.

5. Évaluation comportementale après une lésion unilatérale 6-OHDA

  1. Deux à trois semaines après chirurgie, mener l'évaluation comportementale pour estimer des symptômes de. Pesez chaque souris, enregistrez leur poids et calculez la quantité de médicament qui doit être administrée (0,5 mg/kg d'apomorphine avant l'évaluation).
  2. Administrer 0,5 mg/kg d'apomorphine par injection sous-cutanée avant l'évaluation et placer la souris dans un cylindre de verre.
  3. Après une période d'accoutumance de 5 minutes, comptez le nombre de rotations contralatérales et ipsilatérales par rapport au côté des lésions par minute et enregistrez leur activité à l'intérieur d'une caméra vidéo.
  4. Les souris avec des rotations contralatérales moins ipsilateral 'gt;7 rpm/min sont considérées avec succès lésions et sélectionnées comme candidats pour des expériences de transplantation cellulaire. Remettre les souris dans les cages d'habitation après un repos de 30 min.
    REMARQUE : Si la souris a été avec succès lésionnée, la souris injectée 6-OHDA montrera un plus grand biais en tournant vers le côté contralatéral puisque l'agoniste de DA active le striatum dénervated supersensible du côté lescionné principalement.
  5. Effectuer l'évaluation comportementale une semaine avant et 2, 4, 6, 8, 12, 16 semaines après la transplantation cellulaire.

6. Transplantation cellulaire de précurseurs DA

  1. Préparer la suspension cellulaire pour la transplantation. Pour l'engraftment cellulaire, suspendre 2 x 105 précurseurs DA mélangés par des précurseurs D10 et D13 DA à un rapport de 1:7 dans 4 'L de 5 g L-1 glucose dans la solution équilibrée de sel (Tableau des matériaux) de tampon de transplantation.
  2. Effectuer la chirurgie de transplantation cellulaire suivant les procédures décrites dans la section 4.4, sauf que 6-OHDA est remplacé par la suspension ou tampon de cellules précurseurs d'AD.
  3. Effectuer l'évaluation comportementale 2, 4, 6, 8, 12, 16 semaines après la transplantation cellulaire des précurseurs d'AD suivant les procédures décrites dans la section 5. Comptez le nombre de rotations contralatérales induites par l'apomorphine par rapport au côté lésion par minute et enregistrez leur activité à l'aide d'une caméra vidéo.
    REMARQUE : Après la transplantation, un taux réduit de rotations contralatérales suggère une fonction motrice améliorée.
  4. À 4, 8 ,12, et 16 semaines après la transplantation cellulaire, perfuser la souris sous anesthésie profonde avec 4% de paraformaldéhyde jusqu'à ce que le corps de la souris devient raide et le foie de la souris devient pâle.
  5. Séparez doucement le cerveau de la souris et mettez le cerveau dans 4 % de paraformaldéhyde à 4 oC pendant la nuit.
  6. Le deuxième jour, mettre le cerveau dans 30% de saccharose pour la déshydratation jusqu'à ce que le cerveau s'enfonce au fond.
  7. Trancher le cerveau à 40 m d'épaisseur à l'aide d'un microtome de congélation.
  8. Effectuer l'immunostaining comme précédemment décrit dans les étapes 3.4.5-3.4.12.

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Résultats

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Ici, nous rapportons un protocole qui couvre différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour traiter les modèles de. Tout d'abord, les PBMNC ont été isolés et élargis, et reprogrammés en iNSCs par infection à SeV. Une représentation schématique des procédures avec l'expansion de PBMNC et l'induction d'iNSC est montrée dans la figure 1. Le jour -14, les PBMNC ont été isolés à l'aide d'un milieu de gradient de densité (Tableaudes matériaux). Avant la centrifugation, ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous avons présenté un protocole qui a couvert différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour des modèles de. Les aspects critiques de ce protocole comprennent : (1) l'isolement et l'expansion des PBMNC et la reprogrammation des PBMNC en iNSC par infection à SeV, (2) la différenciation des iNSC aux neurones DA, (3) l'établissement de modèles de souris à lésion 6-OHDA unilatérales et comportementaux l'évaluation, et (4) la transplantation cellulaire des précurseurs de DA et l'évaluation comportementale.

...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Les travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 8156138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Projet de soutien des enseignants de haut niveau dans les universités municipales de Beijing dans la période du 13e plan quinquennal (CIT et TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Fonds de la Commission municipale de la santé (PXM 2018-026283-000002), Beijing Cent, Mille et Dix Mille Talents (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), et le Bourse avancée Royal Society-Newton (NA150482).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 mlCorning430052
1-ThioglycérolSigma-AldrichM6145Toxique pour inhalation et contact avec la peau
Plaque à 24 puitsCorning3337
Tube conique de 50 ml.Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
Plaque à 6 puitsCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Réactif de dissociation cellulaire
ApomorphineSigma-AldrichA4393
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA92902Toxique en cas de contact avec la peau  ;
Supplément de B27Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Facteur neurotrophique dérivé du cerveau
Tubes de prélèvement sanguin contenant de l’héparine sodiqueBD367871
BSAyisheng36106es60Sérum fœtal bovin
AMPcSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine monophosphate cyclique
CellBanker 2ZENOAQ100mlUtilisé comme moyen de congélation pour les PBMNC
Concentré lipidique chimiquement définiInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
CoverslipFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DexaméthasoneSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Sérum d’âneJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGÉrythropoïétine humaine
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, gradient de densité moyen
GDNFPeprotech450-10Facteur neurotrophique dérivé de la glie
GlutaMAXInvitrogen21051024100 & fois ; Solution mère de glutamine
Ham’s-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Solution saline équilibrée
Leucémie humaine facteur inhibiteurMillporeLIF1010
Recombinant humain SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGCroissance insuline humaine semblable à celle facteur  ;
IL-3Peprotech200-03-10UGInterleukine humaine 3
IMDMGibco215056-023Milieu de Dulbecco modifié d’Iscove
InsulineRoche  ;
ITS-XInvitrogen51500-056Supplément d’insuline-transferrine-sélénium-X
Remplacement sérique knockoutGibco10828028Milieu basal sans sérum
LamininRoche  ;
MicroseringueHamilton7653-01
Supplément N2Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Acide aminé non essentiel
NeurobasalGibco10888Milieu de base
PDLSigma-AldrichP7280Poly-D-lysine
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Opération du gène04-0010-10mgStocker de la lumière à -20 ?
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
Saccharosebaiaoshengke
TGF&beta ;?Peprotech100-36EFacteur de croissance transformant  ; &beta ;?
TransferrinR& D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeTensioactif non ionique
Bleu trypanGibcoT10282
XylazineSigma-AldrichX1126
1258501411243217001

Références

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