Article de méthode

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

DOI :

10.3791/59695

⸱

21 mai 2019

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Résumé

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Le système ubiquitine-protéasome est un régulateur clé de la dégradation des protéines et d'une variété d'autres processus cellulaires chez les eucaryotes. Dans le cerveau, les augmentations de l'activité ubiquitine-protéasome sont critiques pour la plasticité synaptique et la formation de mémoire et les changements aberrants dans ce système sont associés à une série de troubles neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques. L'un des problèmes dans l'étude du fonctionnement de l'ubiquitine-protéasome dans le cerveau est qu'il est présent dans tous les compartiments cellulaires, dans lesquels les cibles protéiques, le rôle fonctionnel et les mécanismes de régulation peuvent varier considérablement. En conséquence, la capacité de comparer directement le ciblage des protéines d'ubiquitine du cerveau et l'activité catalytique protéasome dans différents compartiments sous-cellulaires au sein d'un même animal est essentielle pour bien comprendre comment l'ONDu contribue à la plasticité synaptique, mémoire et la maladie. La méthode décrite ici permet la collecte de fractions synaptiques nucléaires, cytoplasmiques et brutes du même cerveau de rongeur (rat), suivie d'une quantification simultanée de l'activité catalytique protéasome (indirectement, fournissant l'activité du noyau protéasome seulement) et le marquage des protéines d'ubiquitine spécifique au lien. Ainsi, la méthode peut être utilisée pour comparer directement les changements subcellulaires dans l'activité ubiquitine-protéasome dans différentes régions du cerveau dans le même animal au cours de la plasticité synaptique, la formation de la mémoire et différents états de la maladie. Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer la distribution subcellulaire et la fonction d'autres protéines au sein d'un même animal.

Introduction

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Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un réseau complexe de structures et de ligases de protéines interconnectées qui contrôle la dégradation de la plupart des protéines de courte durée dans les cellules1. Dans ce système, les protéines sont marquées pour la dégradation ou d'autres processus cellulaires / destins par le petit modificateur ubiquitine. Une protéine cible peut acquérir 1-7 modifications d'ubiquitine, qui peuvent relier ensemble à l'un des sept sites de lysine (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) ou la méthionine N-terminale (M1; aussi connu sous le nom linéaire) dans l'ubiquitine précédente2. Certaines de ces étiquettes de polyubiquitine sont spécifiques à la dégradation (K48)3, tandis que d'autres sont largement indépendantes du processus de dégradation des protéines (M1)4,5,6. Ainsi, le processus d'ubiquitination des protéines est incroyablement complexe et la capacité de quantifier les changements dans une étiquette spécifique de polyubiquitine est essentielle pour comprendre en fin de compte le rôle de cette modification donnée dans le fonctionnement cellulaire. Compliquant encore l'étude de ce système, le protéasome, qui est la structure catalytique de l'UPS7, les deux dégrade ntlifient les protéines, mais peut également être impliqué dans d'autres processus non protéolytiques8,9. Il n'est donc pas surprenant que, depuis sa découverte initiale, l'activité normale et aberrante ubiquitine-protéasome ait été impliquée dans la formation à long terme de mémoire et une série d'états de la maladie, y compris beaucoup neurologique, neurodégénérative et psychiatrique troubles10,11. En conséquence, les méthodes qui peuvent quantifier efficacement et efficacement l'activité UPS dans le cerveau sont essentielles pour comprendre en fin de compte comment ce système est dysrégulé dans les états de la maladie et le développement éventuel d'options de traitement ciblant l'ubiquitine et / ou protéasome fonctionnement.

Il y a un certain nombre de questions dans la quantification de l'activité ubiquitine-protéasome dans les tissus cérébraux des rats et des souris, qui sont les systèmes modèles les plus communs utilisés pour étudier la fonction d'UPS, y compris 1) la diversité des modifications d'ubiquitin, et 2) la distribution et régulation différentielle du fonctionnement d'UPS entre les compartiments subcellulaires12,13,14. Par exemple, bon nombre des premières démonstrations de la fonction ubiquitine-protéasome dans le cerveau pendant la formation de mémoire ont utilisé des lysates de cellules entières et ont indiqué des augmentations de temps-dépendantes dans l'ubiquitination de protéine et l'activité protéasome15, 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20. Cependant, nous avons récemment constaté que l'activité ubiquitine-protéasome variait considérablement d'un compartiment subcellulaire à l'autre en réponse à l'apprentissage, avec des augmentations simultanées dans certaines régions et des diminutions dans d'autres, un modèle qui diffère considérablement de ce qui a été précédemment rapporté dans les lysates de cellule entière21. Ceci est compatible avec la limitation d'une approche cellulaire entière, car elle ne peut dissocier la contribution des changements dans l'activité d'UPS dans différents compartiments subcellulaires. Bien que des études plus récentes ont utilisé des protocoles de fraction synaptique pour étudier l'UPS spécifiquement aux synapses en réponse à l'apprentissage22,23,24, les méthodes utilisées occlude la capacité de mesurer changements ubiquitine-protéasome nucléaires et cytoplasmiques chez le même animal. Il en résulte un besoin inutile de répéter des expériences plusieurs fois, la collecte d'une fraction subcellulaire différente dans chacun. Non seulement cela entraîne une plus grande perte de vies animales, mais il élimine la capacité de comparer directement l'activité UPS à travers différents compartiments subcellulaires en réponse à un événement donné ou au cours d'un état de maladie spécifique. Considérant que les cibles protéiques de l'ubiquitine et du protéasome varient considérablement dans l'ensemble de la cellule, il est essentiel de comprendre comment la signalisation ubiquitine-protéasome diffère dans les compartiments subcellulaires distincts pour identifier le rôle fonctionnel de l'UPS dans le cerveau pendant la formation de mémoire et les désordres neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques.

Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis au point une procédure dans laquelle des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques pourraient être recueillies pour une région du cerveau donnée à partir du même animal21. En outre, pour tenir compte de la quantité limitée de protéines qui peuvent être obtenues à partir de la collecte de plusieurs fractions subcellulaires à partir d'un même échantillon, nous avons optimisé les protocoles précédemment établis pour analyser l'activité protéasome in vitro et lien spécifique l'ubiquitination de protéine dans les cellules lysed s'est rassemblée du tissu de cerveau de rongeur. En utilisant ce protocole, nous avons pu recueillir et comparer directement les changements dépendants de l'apprentissage dans l'activité protéasome, K48, K63, M1 et les niveaux globaux de polyubiquitination de protéine dans le noyau et le cytoplasme et aux synapses dans l'amygdale latérale des rats. Ici, nous décrivons en détail notre procédure ( Figure1), qui pourrait améliorer considérablement notre compréhension de la façon dont l'UPS est impliqué dans la formation de la mémoire à long terme et divers états de la maladie. Cependant, il convient de noter que l'activité protéasome in vitro discutée dans notre protocole, bien que largement utilisée, ne mesure pas directement l'activité des complexes protéasomes complets de 26S. Au contraire, cet analyse mesure l'activité du noyau 20S, ce qui signifie qu'il ne peut servir de proxy que pour comprendre l'activité du noyau lui-même par opposition à l'ensemble du complexe protéasome 26S.

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Protocole

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Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par le Virginia Polytechnic Institute et le State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Collection et dissection du tissu cérébral de rongeur

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué à une variété de régions du cerveau et utilisé avec diverses procédures de collecte de tissus. Voici la procédure utilisée dans notre laboratoire pour la sous-cellulaire du tissu cérébral de rat, utilisant 8-9 semaines mâle s'il s'agit de rats Mâles Dawley. Afin de traiter tous les compartiments cellulaires du même animal, section 1.3. doit être suivie indépendamment de la procédure de collecte des tissus utilisée.

  1. Extraire le cerveau du rat et le placer dans une tasse cryogénique pré-réfrigérée sur de la glace sèche. Congelez le cerveau sur de la glace sèche, ou utilisez de l'azote liquide si disponible, et transférez-le dans un congélateur de -80 oC. Les cerveaux peuvent être disséqués le même jour ou à une date ultérieure.
  2. Retirez le cerveau gelé de la tasse cryogénique et placez-le dans une matrice de cerveau de rat refroidie avec de la glace sèche. Chaque fente sur la matrice correspond à 0,5 mm, qui peut être utilisé pour déterminer l'emplacement approximatif de la région d'intérêt (ROI).
    1. À l'aide d'un Atlas du cerveau des rats, insérez une lame de rasoir dans la matrice immédiatement devant (antérieure) du début prévu du retour sur investissement. Ensuite, insérez une lame de rasoir immédiatement à l'extrémité prévue (postérieure) du retour sur investissement.
    2. Retirer la tranche entre les lames de rasoir à l'aide d'un scalpel et la placer sur une lame de microscope refroidie sur de la glace sèche. Typiquement, les sections sont 2-3 mm d'épaisseur, mais cela varie en fonction du retour sur investissement.
  3. À l'aide d'un scalpel, disséquer le retour sur investissement un hémisphère à la fois. Placer chaque hémisphère dans des tubes microcentrifuges séparés de 1,5 ml préréfrigérés sur de la glace sèche. Les tissus congelés peuvent être immédiatement utilisés pour la fractionnement subcellulaire ou traités ultérieurement s'ils sont stockés à -80 oC.

2. Extraction nucléaire et cytoplasmique

REMARQUE: Ce protocole utilise des solutions de stock préfabriquées de produits chimiques de laboratoire courants, y compris 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,5 M d'acide éthylèneminetetraacetic (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) et 50% glycérol. Si le point final est utilisé dans les essais d'activité protéasome, le glycérol et l'ATP peuvent être ajoutés à tous les tampons pour aider à empêcher le démontage des complexes protéasome pendant la lyse.

  1. Préparer le tampon Lysis. Ajouter 8,63 ml d'eau ultrapure (désionisée et distillée) dans un tube conique stérile de 15 ml.
    1. Au tube conique, ajouter 1 000 l de 0,1 M HEPES, 15 oL de 1 M MgCl, 100 oL de 1 M DTT et 50 oL de 10 % De NP-40.
    2. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase et 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase. Vortex brièvement la solution pour mélanger et placer sur la glace humide pour refroidir. Notez que la solution peut avoir une teinte jaune de l'inhibiteur de la phosphatase.
      REMARQUE: L'utilisation d'inhibiteurs de la protéase est essentielle pour préserver les protéines et assurer la spécificité de l'évaluation de l'activité protéasome in vitro. Cependant, ces inhibiteurs peuvent également entraîner une légère réduction de l'activité protéasome, ce qui signifie que l'activité mesurée sur l'in vitro peut être une sous-estimation des niveaux d'activité réels.
  2. Préparer le tampon d'extraction. Ajouter 5,925 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) dans un tube conique stérile de 15 ml.
    1. Au tube conique, ajouter 2 000 l de 0,1 M HEPES, 1250 oL de 50 % de glycérol, 15 l de 1 M MgCl2, 5 oL de 1 M DTT, 5 oL de 0,5 M EDTA et 600 oL de 5 M NaCl.
    2. Ajouter 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase et 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase. Vortex brièvement la solution pour mélanger et placer sur la glace humide pour refroidir. Notez que la solution peut avoir une teinte jaune de l'inhibiteur de la phosphatase.
  3. Retirez le microtube de centrifugeuse de 1,5 ml contenant un hémisphère du roi-roi du congélateur de -80 oC. Veiller à ce que l'hémisphère utilisé soit contrebalancé par les conditions d'extraction de chaque groupe expérimental. Par exemple, dans une expérience en deux groupes, utilisez l'hémisphère gauche pour les deux premiers animaux de chaque groupe et l'hémisphère droit pour les deux échantillons suivants, etc.
  4. À l'aide d'un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéisateur de téflon en verre de 2 ml. Ajouter 500 l de tampon lysis au tube de téflon.
    1. À l'aide du pilon B, homogénéiser le même tissu à l'aide de 15 coups jusqu'à ce qu'aucune quantité visible de matière solide ne soit présente. Utilisez un mouvement tournant (dans le sens des aiguilles d'une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) pendant chaque course.
  5. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, transférer l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml. Placer le tube sur de la glace humide et couver pendant 30 min.
  6. Placer le tube dans le microcentrifuge et faire tourner pendant 10 min à 845 x g et 4 oC. Après l'achèvement, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml; il s'agit de la Fraction Cytoplasmique, qui peut être stockée sur la glace ou à 4 oC jusqu'à la section 2.9.
  7. Ajouter 50 lde de tampon d'extraction à la pastille résultante et le suspendre à nouveau par tuyauterie. Ne pas vortexlant la pastille. Placer le tube contenant le granule rechargé sur la glace et couver pendant 30 min.
  8. Placer le tube dans le microcentrifuge et faire tourner pendant 20 min à 21 456 x g, 4 oC. Après l'achèvement, retirer soigneusement le supernatant par pipetting et placer dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml; c'est la Fraction Nucléaire. Le granule peut maintenant être jeté.
  9. Mesurer la concentration en protéines des extractions cytoplasmiques et nucléaires à l'aide de l'analyse des protéines Dc (selon les instructions du fabricant), ou de tout essai équivalent pour les échantillons prélevés à l'aide de détergents non ioniques. Procédez immédiatement à l'exemple d'activité protéasome (section 4) ou au ballonnement occidental (section 5). Alternativement, les échantillons peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.

3. Collection Fraction Synaptic

REMARQUE: Ce protocole utilise des solutions de stock préfabriquées de produits chimiques de laboratoire courants, y compris 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl et 10% SDS. Si le point final est utilisé dans les tests d'activité protéasome, le glycérol et l'ATP peuvent être ajoutés à tous les tampons pour aider à empêcher le démontage des complexes protéasome pendant la lyse

  1. Préparer le tampon TEVP avec un saccharose de 320 mM. Ajouter 60 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) à un bécher propre de 100 ml.
    1. Au bécher, ajouter 1 300 l de 1 M Tris (pH 7,5), 260 oL de 0,5 M EDTA, 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase, 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase et 10,944 g de saccharose. Mélanger avec une barre d'agitation jusqu'à ce que le saccharose soit complètement dissous.
    2. Amenez le pH à 7,4 euros en ajoutant de l'acide chlorhydrique (HCl) à la solution à l'aide d'une pipette.
    3. Transférer la solution dans un flacon volumétrique de 100 ml. Porter le volume à 100 ml en ajoutant de l'eau ultrapure. Refroidir la solution finale sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Préparer le tampon d'homogénéisation. Ajouter 60 ml d'eau ultrapure (déionisée et distillée) à un bécher propre de 100 ml.
    1. Au bécher, ajouter 5 000 l de 1 M Tris (pH 7,5), 3 000 l de 5 M NaCl, 100 l de cocktail inhibiteur de la protéase, 100 l de cocktail inhibiteur de la phosphatase et 2 000 l de 10 % de SDS. Mélanger avec une barre à remuer.
      REMARQUE: Les détergents ioniques peuvent interférer avec les essais d'activité protéasome en ayant pour résultat la dénaturation du complexe protéasome. Le volume de SDS pourrait être abaissé pour aider à préserver la fonction protéasome si désiré.
    2. Amenez le pH à 7,4 euros en ajoutant HCl dropwise à la solution à l'aide d'une pipette.
    3. Transférer la solution dans un flacon volumétrique de 100 ml. Porter le volume à 100 ml en ajoutant de l'eau ultrapure. Conserver la solution finale à température ambiante; ne pas refroidir que SDS va précipiter hors de la solution.
  3. Retirer la centrifugeuse de 1,5 ml contenant un hémisphère du retour sur investissement du congélateur de -80 oC. Veiller à ce que l'hémisphère utilisé soit contrebalancé par les conditions d'extraction de chaque groupe expérimental. Par exemple, dans une expérience en deux groupes, utilisez l'hémisphère gauche pour les deux premiers animaux de chaque groupe et l'hémisphère droit pour les deux échantillons suivants, etc.
  4. À l'aide d'un scalpel, transférer le tissu cérébral congelé dans un homogénéisateur de téflon en verre de 2 ml. Ajouter 500 l de tampon TEVP au tube de téflon.
    1. À l'aide du pilon B, homogénéiser le même tissu à l'aide de 15 coups jusqu'à ce qu'aucun transfert visible de matière solide ne soit présent. Utilisez un mouvement tournant (dans le sens des aiguilles d'une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) pendant chaque course.
  5. À l'aide d'une pipette de 1 000 l, transférer l'échantillon homogénéisé dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifuger l'échantillon à 1 000 x g pendant 10 min, 4 oC.
  6. Recueillir le supernatant et transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml à l'aide d'une pipette de 1 000 l. Centrifuger l'échantillon à 10 000 x g pendant 10 min, 4 oC. La pastille d'origine (P1) contient des noyaux et les gros débris et peut être jetée.
  7. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml. C'est une Fraction Cytosolique. Ajouter 50 l de tampon d'homogénéisation au granule (P2) et le suspendre à nouveau par tuyauterie jusqu'à ce qu'aucun matériau solide ne soit visible.
  8. Centrifuger l'échantillon à 20 000 x g pendant 10 min, 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml; il s'agit de la fraction de la membrane synaptosomique brute (synaptique). Le granule peut être jeté.
  9. Mesurer la concentration protéique de la fraction synaptique à l'aide de l'analyse de la protéine Dc (selon les instructions du fabricant), ou tout autre analyse équivalente pour les échantillons recueillis à l'aide de détergents ioniques. Procédez immédiatement à l'exemple d'activité protéasome (section 4) ou au ballonnement occidental (section 5). Alternativement, les échantillons peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.

4. Test d'activité de protéasome

REMARQUE: L'activité protéasome peut être mesurée dans le tissu cérébral homogénéisé à l'aide d'une version légèrement modifiée de la trousse d'activité protéasome 20S. Cet exemple ne mesure pas directement l'activité des complexes protéasomes complets de 26S. Il mesure plutôt l'activité du noyau 20S, ce qui signifie qu'il ne peut servir que de substitut pour comprendre l'activité du noyau lui-même par opposition à l'ensemble du complexe protéasome 26S. Le succès de cet essai diminue avec des cycles de gel-dégel répétés et/ou des niveaux croissants de détergents, particulièrement ioniques, et nécessite l'utilisation d'un lecteur de plaque avec un ensemble de filtre s'énervois 360/460 (excitation/émission) et des capacités de chauffage jusqu'à 37 oC.

  1. Paramètres de lecteur de plaque : Pré-chaud à 37 oC et maintenez la course.
    1. Définir l'excitation à 360 et l'émission à 460. Si la plaque de puits 96 utilisée est claire, placez la position optique vers le bas. Si une plaque de puits 96 foncée/noire est utilisée, placez la position optique top.
    2. Définir les anciens modèles de lecteurs de plaques sur Auto-Gain sous les options de lecture fluorescente; de nouveaux modèles sont préréglés pour cela. Programmez une course cinétique avec un temps de 2 h, en scannant (lecture) toutes les 30 min.
  2. Reconstituer le tampon d'assay 10x fourni dans le kit avec 13,5 ml d'eau ultrapure. Ajouter 14 L de 100 mM ATP au tampon maintenant 1x; ceci améliore considérablement l'activité de protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité d'analyse. Le tampon d'analyse final 20S peut être stocké sur la glace ou à 4 oC jusqu'à ce que nécessaire et soit stable pendant plusieurs mois.
  3. Reconstituer la norme AMC fournie en kit avec 100 L de DMSO. Effectuez cette étape dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car la norme est sensible à la lumière.
  4. Créez une courbe de support d'AMC en utilisant la norme reconstituée, dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité.
    1. Dans les tubes de microcentrifuge distincts de 0,5 mL, ajouter 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 et 0 L de la norme AMC, ce qui correspond à 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0 M de concentration AMC.
    2. À ces tubes, dans le même ordre, ajoutez 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 et 100 l de tampon d'essai 20S. Cela crée une série de concentrations élevées à faibles AMC, qui seront utilisés pour l'étalonnage des lecteurs de plaques et l'analyse de l'activité protéasome dans les échantillons homogénéisés.
    3. Conservez toutes les normes diluées sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que nécessaire.
  5. Reconstituer le substrat protéasome (Suc-LLVY-AMC) fourni en kit avec 65 l de DMSO. Effectuez cette étape dans l'obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car le substrat est sensible à la lumière. Créer une dilution de 1:20 du substrat protéasome dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml à l'aide d'un tampon d'analyse 20S. Conserver le substrat dilué sur la glace dans l'obscurité jusqu'à ce que nécessaire.
    REMARQUE: Par exemple, si la plaque aura 10 échantillons et 1 blanc, vous aurez besoin d'un substrat dilué suffisant pour 22 puits (avec des doublons) à 10 l par puits. Cela équivaut à 220 'L besoin de '30 'L pour les erreurs de pipetting, nécessitant 12,5 'L de substrat et 237,5 'L de 20S Assay tampon.
  6. Décongeler les échantillons désirés (s'ils sont congelés) et ajouter une quantité normalisée à une assiette de 96 puits. Exécutez chaque échantillon en doublons. La quantité d'échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. En général, 10-20 g est suffisant pour n'importe quelle fraction subcellulaire.
  7. Porter le volume du puits d'échantillon à 80 L avec de l'eau ultrapure. La quantité ajoutée dépend du volume d'échantillon ajouté. Par exemple, si l'échantillon 1 était de 4,5 l de protéines et l'échantillon 2 était de 8,7 l, la quantité d'eau nécessaire sera de 75,5 l et de 71,3 l, respectivement. Dans deux puits distincts, ajouter 80 l'eau seule; ce seront les Assay Blanks.
    REMARQUE: Afin de limiter les changements dans le volume de protéines en raison d'erreurs de pipetage, les concentrations de protéines peuvent être normalisées à l'échantillon le moins concentré. Cela permettra l'utilisation du même volume d'échantillon dans toutes les conditions.
  8. Ajouter 10 l de tampon d'assay 20S à chaque puits, y compris les blancs d'assay. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume d'analyse uniforme dans les puits.
  9. En option: À ce stade, introduire des manipulations in vitro si désiré; cela exigera que chaque échantillon dispose de 2 puits supplémentaires par traitement, y compris le véhicule. Si c'est le cas, ajouter de 5 à 10 L de médicaments/composés d'intérêt à 2 des puits de l'échantillon et un volume équivalent de contrôle/véhicule à 2 autres puits. Placer la plaque sur le lecteur de plaque préréchauffé ou dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min.
  10. Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre. Ajouter les 100 l de normes AMC diluées à un nouveau puits; chaque norme aura un seul puits.
  11. Dans l'obscurité, ajouter 10 l de substrat protéasome dilué aux puits contenant des échantillons et des extraits, mais pas à la norme AMC. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume d'analyse uniforme dans les puits.
  12. Placez la plaque dans le lecteur de plaque et commencez la course cinétique.
    REMARQUE: La plaque n'a pas besoin d'être sous agitation constante pendant la course cinétique, cependant, l'utilisateur peut choisir de si désiré
  13. À la fin de la course cinétique, exportez des valeurs fluorescentes brutes 360/460 à Microsoft Excel.
    1. Moyenne ensemble des puits en double pour chaque norme, chaque échantillon et le blanc d'analyse pour les 5 scans. Les valeurs fluorescentes brutes devraient augmenter d'un balayage à l'autre des échantillons, mais rester stables (ou diminuer légèrement) pour les normes et les extraits.
    2. Prenez la moyenne de puits la plus haute norme AMC et divisez-la par la concentration connue (20 M). Divisez cette valeur par la concentration d'échantillon utilisée dans l'analyse pour obtenir une valeur AMC normalisée. Pour chaque échantillon et la moyenne d'analyse, divisez par la valeur AMC standardisée.
    3. Prenez cette valeur finale et divisez par la concentration d'échantillon utilisée dans l'analyse pour obtenir la valeur normalisée pour chaque échantillon et le vide d'analyse. Faites ceci pour tous les 5 balayages.
    4. Soustrayez la valeur normalisée de l'Analyse Blank de chaque valeur d'échantillon normalisée pour les 5 scans.

5. Quantification de l'ubiquitination des protéines spécifique à Linkage

  1. La quantification de diverses étiquettes de polyubiquitine dans différentes fractions subcellulaires rassemblées du tissu de cerveau de rongeur devrait être faite utilisant une série de protocoles occidentaux standard de blotting en combination avec les anticorps polyubiquitin uniques, linkage-spécifiques.
    1. Pour dénaturation, mélanger les échantillons normalisés avec un volume égal de tampon d'échantillon Deemmli complété par du mercaptoéthanol à un pourcentage de 5 % en volume, selon l'instruction du fabricant.
    2. Pour quantifier toutes les modifications de monoubiquitination et de polyubiquitination indépendamment du lien, utilisez un anticorps pan-ubiquitine.
    3. Pour reconnaître toutes les protéines polyubiquitinated, utilisez un anticorps ubiquitine qui ne réagit pas avec la monoubiquitination.
    4. Pour la polyubiquitination spécifique au lien, utilisez des anticorps qui peuvent détecter lysine-27, Lysine-48, Lysine-63 et la polyubiquitination linéaire (M1).
  2. Pour prévenir la contamination croisée entre les développements, ce qui pourrait entraîner un faux positif ou interférer avec l'imagerie d'une modification différente de l'ubiquitine, les membranes de bande entre les développements en utilisant 0,1 M NaOH pendant 10 min.
    1. Laver les membranes dans le SCT avec 0,1% d'entre-deux pendant 10 min et rebloquer (en utilisant tout agent de blocage est préféré dans le protocole western blot utilisé).
    2. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire et le réaménager afin de confirmer que la membrane a été dépouillée des anticorps primaires et secondaires correctement.
    3. Recommandé: Pour le développement réussi de différents anticorps d'ubiquitine sans contamination, utilisez des systèmes d'imagerie fluorescents ou proches infrarouges. Cela peut souvent empêcher le report entre les anticorps.
  3. Certaines images de taches de l'ouest ubiquitine fourniront des colonnes de bandes distinctes (comme M1) tandis que d'autres produisent un motif de frottis avec peu ou pas de lignes claires (commune avec K48). Pour la quantification des taches occidentales d'ubiquitine d'image, dessinez une boîte autour de la colonne qui étend l'échelle entière de normes moléculaires.
    1. Ajuster la boîte vers le haut (ou vers le bas) si la coloration de l'ubiquitine s'étend à travers toute l'échelle; ceci est commun pour des modifications de Lysine-48 et varie considérablement entre les compartiments subcellulaires.
    2. Soustrayez l'arrière-plan, qui est calculé comme la densité optique moyenne de l'arrière-plan entourant immédiatement la colonne de tous les côtés.

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Résultats

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En utilisant la procédure décrite ici, des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques ont été recueillies à partir de l'amygdale latérale du cerveau du rat (Figure 1). La pureté des fractions individuelles a été confirmée par le ballonnement occidental, sondant avec des anticorps contre des protéines qui devraient être enrichies ou épuisées dans le lysate. Dans le premier hémisphère où une fraction synaptique brute a été recueillie, la protéine de de...

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Discussion

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Ici, nous démontrons une méthode efficace pour quantifier des changements dans l'activité ubiquitine-protéasome à travers différents compartiments subcellulaires dans le même animal. À l'heure actuelle, la plupart des tentatives de mesure des changements subcellulaires dans l'activité du système ubiquitine-protéasome ont été limitées à un seul compartiment par échantillon, ce qui a entraîné la nécessité de répéter des expériences. Cela entraîne des coûts importants et des pertes de vies animales. Notre protocole atténue ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du College of Agricultural and Life Sciences et le College of Science de Virginia Tech. T.M. est soutenu par le programme George Washington Carver de Virginia Tech.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTAFisher15575020Divers autres fournisseurs
20S Proteasome Activity KitMillipore SigmaAPT280D’autres fournisseurs proposent différentes versions
ATP FisherFERR1441Divers autres fournisseurs
Anticorps bêta-actineSignalisation cellulaire4967SDivers autres fournisseurs
Anticorps bêta-tubulineCellule signalisation2128TDivers autres fournisseurs
BioTek Synergy H1 lecteur de plaquesBioTekVATECHH1MT3D’autres fournisseurs proposent différentes versions
B-mercaptoethanol FisherICN19024280Divers autres fournisseurs
Clasto lactacystine b-lactoneMillipore SigmaL7035Divers autres fournisseurs
Coupe cryogéniqueFisher033377BDivers autres fournisseurs
DMSODMSOD8418Divers autres fournisseurs
DTTMillipore SigmaD0632Divers autres fournisseurs
GlycérolMillipore SigmaG5516Divers autres fournisseurs
H3 anticorpsAbcamab1791Divers autres fournisseurs
HEPESMillipore SigmaH3375Divers autres fournisseurs
Acide chlorhydriqueFisherSA48Divers autres fournisseurs
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Divers autres fournisseurs
K48 Anticorps d’ubiquitineAbcamab140601Divers autres fournisseurs
K63 Anticorps d’ubiquitineAbcamab179434Divers autres fournisseurs
KClMillipore SigmaP9541Divers autres fournisseurs
KONTES broyeur de tissusVWRKT885300-0002Divers autres fournisseurs
Tampon d’échantillon LaemmliBio-rad161-0737Divers autres fournisseurs
Capteurs de vied’anticorps d’ubiquitine linéaireAB-0130-0100Uniquement anticorps M1
MgClMillipore Sigma442611Divers autres fournisseurs
MicrocentrifugeuseEppendorf2231000213Divers autres fabricants/modèles
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Porté par Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014Divers autres fournisseurs
Odyssey Fc Imaging SystemLiCor2800-02D’autres fournisseurs proposent différentes versions
Inhibiteur de phosphataseMillipore Sigma524625Divers autres fournisseurs
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373Divers autres fournisseurs
Inhibiteur de protéaseMillipore SigmaP8340Divers autres fournisseurs
Anticorps PSD95Signalisation cellulaire3450TDivers autres fournisseurs
SDSMillipore SigmaL3771Divers autres fournisseurs
Hydroxyde de sodiumFisherSS255Divers autres fournisseurs
SucroseMillipore SigmaS0389Divers autres fournisseurs
TBSAlfa AesarJ62938Divers autres fournisseurs
TrisMillipore SigmaT1503Divers autres fournisseurs
Tween-20FisherBP337-100Divers autres fournisseurs
Ubiquitin AnticorpsEnzo Sciences de la vieBML-PW8810Divers autres fournisseurs

Références

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Mots-clés

Fractionnement subcellulaireDosage du prot asomeWestern BlotFraction synaptiqueFraction nucl aireFraction cytoplasmiqueUbiquitination sp cifique du lienD gradation des prot ines

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