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Article de méthode

Utilisation de l'invertébré Galleria mellonella comme modèle d'infection pour étudier le complexe mycobacterium de tuberculose

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DOI :

10.3791/59703

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30 juin 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Pediatric Infectious Diseases and Allergy, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Pharmacy, National University of Singapore, 3MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Department of Medicine, Imperial College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Galleria mellonella a été récemment établi comme un modèle d'infection reproductible, bon marché et éthiquement acceptable pour le complexe de mycobacterium tuberculosis. Ici nous décrivons et démontrons les étapes prises pour établir l'infection réussie de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux.

Résumé

La tuberculose est la principale cause mondiale de mortalité par maladie infectieuse et environ un quart de la population mondiale serait infectée par Mycobacterium tuberculosis. Malgré des décennies de recherche, de nombreux mécanismes à l'origine du succès de M. tuberculosis en tant qu'organisme pathogène restent à étudier, et le développement de médicaments antimycobactériens plus sûrs et plus efficaces est nécessaire de toute urgence pour faire face à la hausse et la propagation de la tuberculose pharmacorésistante. Cependant, la progression de la recherche sur la tuberculose est en proie à des modèles traditionnels d'infection des mammifères qui sont coûteux, longs et éthiquement difficiles. Auparavant, nous avons établi les larves de l'insecte Galleria mellonella (plus grand papillon de cire) comme un nouveau modèle d'infection reproductible, à faible coût, à haut débit et éthiquement acceptable pour les membres du complexe M. tuberculosis. Ici nous décrivons l'entretien, la préparation, et l'infection de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux. À l'aide de ce modèle d'infection, la virulence dépendante de la dose mycobactérienne peut être observée, et une lecture rapide de la charge mycobactérienne in vivo à l'aide de mesures de bioluminescence est facilement réalisable et reproductible. Bien qu'il existe des limites, comme l'absence d'un génome entièrement annoté pour l'analyse transcriptomique, une analyse ontologique contre des insectes génétiquement similaires peut être effectuée. Comme modèle à faible coût, rapide et éthiquement acceptable pour la tuberculose, G. mellonella peut être utilisé comme pré-écran pour déterminer l'efficacité et la toxicité des médicaments, et pour déterminer la virulence mycobactérienne comparative avant l'utilisation de mammifères conventionnels Modèles. L'utilisation du modèle G. mellonella-mycobacteriapermettra de réduire le nombre important d'animaux actuellement utilisés dans la recherche sur la tuberculose.

Introduction

La tuberculose est une menace majeure pour la santé publique mondiale avec 9 millions de nouveaux cas par an et 1,5 million de décès1. En outre, on estime qu'un quart de la population mondiale est infectée par l'agent causal de la maladie, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Parmi la population infectée, 5 à 10 % développeront une tuberculose active au cours de leur vie. En outre, l'émergence et la propagation de MTB multirésistants (MDR) et résistants aux médicaments (XDR) constitue une menace sérieuse pour la lutte contre la maladie, 123 pays signalant au moins un cas de XDR1. Le traitement de la tuberculose nécessite un cocktail d'au moins quatre médicaments antimycobactériens, dont l'isoniazide et la rifampicine sont prescrites pour une durée minimale de six mois; le traitement est souvent associé aux effets secondaires et aux toxicités complexes. La protection contre le seul vaccin homologué contre la tuberculose, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), est variable2. Une compréhension incomplète de la pathogénie de la tuberculose entrave considérablement l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques et de vaccination.

Pendant des décennies, les modèles d'infection animale ont été essentiels pour la recherche sur la tuberculose afin de comprendre la pathogénie de base et la réponse de l'hôte à l'infection, et d'évaluer de nouveaux agents antimycobactériens, immunothérapeutiques et de nouveaux vaccins candidats3, 4. Cependant, la recherche utilisant des modèles d'infection animale de la tuberculose est notoirement difficile car la pathogénie et la progression de l'infection à tuberculose sont complexes, et il n'existe pas de modèle animal unique qui imite le spectre complet et les caractéristiques importantes de la maladie5 ,6. En outre, les expériences sur les animaux sont coûteuses, prennent beaucoup de temps à entreprendre et nécessitent une justification éthique complète. Néanmoins, des modèles d'infection animale de la tuberculose ont été décrits chez des primates non humains (p. ex. macaques), des cobayes, des lapins, des bovins, des porcs, des souris et des poissons zèbres, chacun ayant ses limites3,4. Le modèle murine est le modèle le plus couramment utilisé en raison du coût, de la disponibilité des lignées consanguines, de la reproductibilité de l'infection et de l'abondance des réactifs immunologiques. Cependant, ils ne forment généralement pas de granulomes associés à des zones d'hypoxie qui sont caractéristiques de l'infection tuberculeuse latente (LTBI)6. Les cochons d'Inde sont très sensibles à l'infection à Mtb, avec une pathologie et une formation précoce de granulomes semblables à ceux chez l'homme, et sont largement utilisés dans les tests de vaccination; pourtant, l'absence de réactifs immunologiques entrave leur utilisation comme modèle d'infection7. Les poissons zèbres conviennent au dépistage à grande échelle dans les études précliniques à un stade précoce en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leurs outils génétiques avancés, mais ils sont anatomiquement et physiologiquement différents des humains et ne sont Mycobacterium marinum infection3. Les modèles animaux qui ressemblent le plus étroitement à l'infection humaine de Mtb sont les primates non humains (par exemple, le macaque), mais ils sont chers et ont des considérations éthiques et pratiques importantes qui limitent considérablement leur utilisation8.

La larve d'insecte de la plus grande teigne de cire ou papillon de nuit nid d'abeilles,Galleria mellonella, sont devenus de plus en plus populaires comme modèle d'infection pour une variété d'agents pathogènes bactériens et fongiques9, et comme un écran pour les nouveaux candidats aux médicaments antimicrobiens 10. G. mellonella est un modèle d'invertébré réussi en raison de son système immunitaire inné sophistiqué (composé de défenses cellulaires et humoristiques) qui partage un degré élevé de similitude structurale et fonctionnelle à celle des vertébrés11 . Cela comprend les mécanismes immunitaires tels que la phagocytose des agents pathogènes par les hémocytes (fonctionnellement similaires aux macrophages et aux neutrophiles des mammifères)12,13, la production et la circulation de peptides antimicrobiens (AMP) et protéines de type complément dans l'hémolymphe (analogue au sang de mammifères) de G. mellonella11. D'autres avantages9,14,15 de larves de G. mellonella comme modèle comprennent 1) leur grande taille (20-30 mm) qui permet une manipulation facile et l'infection, ainsi que la collecte de tissus et hémolymphe pour les analyses, 2) entretien facile à 37 oC, compatible pour l'étude des agents pathogènes humains, 3) infection précise par injection sans besoin d'anesthésie, 4) l'efficacité des agents antimicrobiens peut être évaluée en utilisant moins de médicament pour l'évaluation, 5) l'absence de contraintes éthiques par rapport à l'utilisation des mammifères, 6) grandes tailles de groupe peuvent être utilisés par rapport aux modèles animaux permettant une plus grande reproductibilité, et 7) des temps plus courts pour les expériences d'infection sont nécessaires.

Dans une étude récente, nous avons démontré que G. mellonella peut être utilisé comme un nouveau modèle d'infection pour étudier la pathogénie de l'infection par bioluminescent M. bovis BCG lux, une version génétiquement modifiée de la souche vaccinale et membre du complexe Mtb (MTBC)16. Alors que G. mellonella a déjà été utilisé comme modèle d'infection pour les mycobactéries non tuberculeuses (NTM), principalement M. marinum et Mycobacterium abcès17,18, les études utilisant MTBC sont limitées à celle de Li et coll.16. Les souches mycobactériennes bioluminescentes non pathogènes, qui peuvent être utilisées au niveau de confinement (CL) 2 comme substitut pour Mtb, offrent les avantages de la sécurité et de la praticité par rapport aux mycobactéries pathogènes. Après l'infection par le BCG lux, les larves commencent à développer des structures précoces ressemblant à des granulomes, ce qui pourrait fournir un aperçu précieux du rôle de l'immunité innée dans l'établissement de l'infection tuberculeuse16. En outre, ce modèle simple d'infection des invertébrés a le potentiel de fournir une évaluation rapide, peu coûteuse et fiable de la pathogénie de tb(e) incorporant le défi contrôlé et les répétitions multiples pour la reproductibilité. En outre, le modèle a le potentiel d'être utilisé pour dépister les nouveaux médicaments antituberculeux et les candidats vaccins dans le développement précoce, réduisant le nombre global d'animaux dans l'expérimentation. La capacité de mesurer les changements dans la structure de l'hôte et des agents pathogènes, le transcriptome et le protéome pour déterminer les cibles des médicaments et évaluer les mécanismes d'action des nouveaux médicaments et des vaccins thérapeutiques, sont également avantageuses.

Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux pour la préparation d'un bioluminescent M. bovis BCG lux inoculum et les larves de G. mellonella pour l'infection mycobactérienne, ainsi que la détermination des larves et mycobactériennes survie en réponse à l'infection.

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Protocole

REMARQUE : Tous les travaux décrits ci-dessous doivent être effectués dans un laboratoire CL2 dans un cabinet de sécurité microbiologique de classe 2 (MSC) suivant les directives locales en matière de santé et de sécurité.

1. Préparation de M. bovis BCG lux pour l'infection

  1. Dégeler un glycérol congelé de 1,2 ml (15 %) stock de M. bovis BCG lux, la souche vaccinale de Montréal transformée avec le plasmide de la navette pSMT1 portant les gènes luxAB de Vibrio harveyi codant l'enzyme de la luciferase19.
  2. Inoculer 15 ml de bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2 % de glycérol, 10 % d'albumine, dextrose, de catalase (ADC) d'enrichissement et 50 g/mL d'hygromycine avec un aliquot décongelé de 1,2 mL de BCG lux, dans un flacon Erlenmeyer étiqueté de 250 mL.
  3. Placer le flacon dans un contenant de biosécurité scellé et couver à 37 oC dans un incubateur de shaker orbital à 220 tr/min pendant 72 h (ou jusqu'à ce que la culture atteigne la phase de croissance à mi-log).
  4. Vérifiez la croissance de la culture bcG lux en préparant 1:10 dilutions de la culture dans des tubes luminomètres à l'aide de phosphate tamponné saline (PBS, pH 7,4, 0,01 M tampon de phosphate, 0,0027 M chlorure de potassium et 0,137 M de chlorure de sodium) en double. Vortex, et charger les tubes de luminomètre dans le luminomètre et mesurer la bioluminescence (unité de lumière relative [RLU]/mL) en utilisant l'aldéhyde n-decyl comme substrat (1% v/v dans l'éthanol absolu)20.
    REMARQUE: Le rapport des unités de formation de RLU/colonie (CFU) a été précédemment déterminé pour être 3:1 quand le lux de BCG a été cultivé in vitro dans le bouillon 7H9 de Middlebrook20.
  5. Centrifuger la culture à 2 175 x g pendant 10 min à température ambiante pour granuler les cellules et jeter le supernatant dans un désinfectant approprié avec l'activité mycobactéricale connue. Éliminer tous les déchets de culture avec des désinfectants appropriés pour les mycobactéries selon les directives locales.
  6. Laver la pastille cellulaire deux fois en PBS contenant 0,05% polysorbate 80 (PBS-T) pour prévenir l'agglutination bactérienne.
  7. Après le lavage final, décanter supernatant de déchets, resuspendre le granule de cellules mycobactériennes dans PBS-T et diluer la suspension mycobactérienne à la densité cellulaire désirée à l'aide de mesures RLU.
  8. Préparer des dilutions en série décuplées de l'inoculum dans des plaques de 24 puits à l'aide de PBS-T. Déposer 10 l sur les plaques d'agar Middlebrook 7H11 (0,5 % de glycérol, 50 g/mL d'hygromycine, 10 % d'acide oléique, d'albumine, de dextrose, de catalase [OADC]) en double pour énumérer les comptes de cFU d'inoculum.

2. Préparation des larves de G. mellonella

  1. Achetez les dernières larves instar de sources appropriées et maintenez les larves dans l'obscurité à 18 oC à l'arrivée et utilisez-les dans la semaine suivant l'achat. Alternativement, les larves peuvent être auto-enlevées selon le protocole de Jojoo et coll.21. Pour les larves achetées, jetez les larves mortes, décolorées ou puantes avant l'entreposage.
    REMARQUE: Les larves puantes se distinguent morphologiquement des dernières larves instar.
  2. Identifier et sélectionner des larves saines pour l'expérimentation, en fonction de la couleur crème uniforme avec peu ou pas de décoloration (mélanisation), la taille (2-3 cm de longueur), le poids (environ 250 mg), affichant un niveau élevé de motilité, et possédant la capacité de redresser eux-mêmes lorsqu'ils sont retournés.
  3. Compter soigneusement les larves saines (minimum de 20 à 30 par groupe) dans un plat Petri (94/15 mm) tapissé d'une couche de papier filtre (94/15 mm) à l'aide d'une pince à bout émoussé pour minimiser la contamination et ranger à température ambiante dans l'obscurité jusqu'à l'utilisation.

3. Infecter G. mellonella avec bcG lux

  1. Réduire au minimum l'encombrement au sein du SMC afin de réduire le risque de contamination et de blessures par tige d'aiguille.
  2. Préparer la plate-forme d'injection en scotchant un papier filtre circulaire (94 mm) sur une surface plane surélevée. Les surfaces molles ou dures peuvent être utilisées et dépendent entièrement de la préférence de l'utilisateur, par exemple, des couvercles de boîte de pipette ou une éponge de récurage en nylon.
  3. Stériliser une microseringue de 25 l (25 G) en aspirant 3 volumes d'éthanol à 70 % et rincer davantage avec 3 volumes de PBS-T stérile.
  4. Aspirez 10 l d'inoculum BCG lux (préparé à la section 1) ou PBS-T dans la microseringue stérilisée de 25 l.L. Utilisez une seringue séparée pour le contrôle négatif PBS-T.
    REMARQUE: Resuspendre l'inoculum BCG lux après 10 injections pour assurer une suspension cellulaire uniforme.
  5. Utilisez une pince à épiler pour ramasser une larve et placez-la sur la plate-forme d'injection.
  6. Sur la plate-forme, retourner la larve sur son dos et immobiliser en fixant la tête et la queue avec la pince à épiler. Localisez le dernier proleg gauche à rebours à partir de la tête de la larve et insérez soigneusement l'extrémité de l'aiguille (5 à 6 mm) à un angle de 10 à 20 degrés par rapport au plan horizontal.
    REMARQUE: Les pinces courtes et étroites permettent une immobilisation facile avec un minimum de stress larvaire. Faites attention à ne pas trop pénétrer qui peut perforer l'intestin et causer non-BCG lux mélanisation spécifique ou la mort.
  7. Comptez les larves infectées dans un plat Petri tapissé d'une couche de papier filtre, un seul plat Petri de 90 mm peut accueillir jusqu'à 30 larves.
  8. Conserver le plat Petri contenant les larves dans une boîte noire ventilée ou nonscellée à l'intérieur d'un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO 2.

4. Surveillance de la survie de G. mellonella après l'infection

  1. Au fil du temps, surveiller la survie des larves tous les 24 h. Les larves sont considérées comme mortes lorsqu'elles ne se déplacent pas en réponse au toucher.

5. Mesurer le fardeau in vivo du bcG lux dans G. mellonella

  1. À chaque moment, sélectionnez au hasard cinq larves infectées préalablement préparées à la section 3 et stérilisez délicatement les surfaces larvaires à l'aide d'écouvillons de coton imbibés d'éthanol à 70 %.
    REMARQUE: Cette étape est importante lorsque le placage homogénéisé larvaire pour l'énumération mycobactérienne de l'UFC, car les larves non stérilisées peuvent entraîner une contamination.
  2. Placer les larves individuellement dans des tubes de matrice de lysing de 2 ml contenant 800 l de PBS stérile.
  3. Homogénéiser les larves à l'aide d'un homogénéisateur pour 60 s à 6,0 m/s.
  4. Centrifuger les tubes de lysing à 3500 x g pour 5 s pour enlever l'homogénéisation des couvercles, et décanter soigneusement l'homogénéiser en tubes de luminomètre stériles individuellement.
    REMARQUE: Pour l'énumération de l'UFC (étape 5.7), assurez-vous de réserver 100 l d'homogénéisation dans un tube de réaction stérile de 1,5 ml.
  5. Récupérer tout homogénéisme restant en lavant les tubes de matrice de lysing avec 1 ml de PBS-T et pipette dans les tubes de luminomètre correspondants.
  6. Vortex les tubes de luminomètre et mesurer la bioluminescence des homogénéates précédemment décrites à l'étape 1.4.
  7. Préparer des dilutions en série décuplées de l'homogénéisme dans des plaques de culture de 24 puits à l'aide de PBS-T. Déposer 10 l l de la dilution sur les plaques d'agar de Middlebrook 7H11 contenant 0,5 % de glycérol, 50 g/mL d'hygromycine, 10 % d'OADC et 20 g/mL de piperacillin, afin de déterminer le ratio RLU/CFU de BCG lux après une infection in vivo.
    REMARQUE: Piperacillin élimine le microbiote g. mellonella indigène avec l'inhibition minimale de croissance de BCG lux16.

6. Analyse statistique

  1. Tracer la courbe de survie Kaplan-Meier à l'aide des données recueillies et effectuer le test Mantel-Cox (Log-rank) pour déterminer l'importance du résultat, où le résultat est le «p 'lt; 0,05, 'p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 'lt, et 'p 'lt; 0.0001.

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Résultats

Nous présentons ici des données représentatives qui peuvent être obtenues à l'aide du modèle d'infection à lux de G. mellonella — BCG et soulignons les avantages de G. mellonella en tant que modèle d'infection pour les membres du MTBC (Figure 1). Les procédures expérimentales avec des points techniques clés sont décrites à la figure 2.

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Discussion

L'utilisation de G. mellonella comme modèle d'infection a été établie pour un certain nombre d'agents pathogènes bactériens et fongiques pour l'étude de la virulence, l'interaction hôte-pathogène, et comme un écran pour les nouvelles thérapeutiques10,22. La discussion suivante est basée sur la procédure expérimentale pour l'utilisation de G. mellonella comme modèle d'infection pour le MTBC.

La santé des larve...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par des subventions du Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC), accordées à PRL et YL (BB/P001262/1), et du National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) décernée à PRL, SMN, BDR et YL (NC/R001596/1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à réaction de 1,5 mL (Eppendorf)Eppendorf22431021
20, 200 et 1 000 & micro ; Pipette L et pointes filtréesTout fournisseurn/a
Plaque de culture 24 puitsGreiner662160
Pipettes 25 mL et pipette boyTout fournisseur n/a
Boîte de Pétri à 3 compartiments (94/15 mm)Centrifugeuse 637102
Toutfournisseurn/a
Armoire de sécurité de classe IITout fournisseurn/ un
erlenmeyer avec bouchon ventilé (250 mL)CorningCLS40183
Ethanol (>99,7 %)VWR208221.321
Galleria mellonella (250 per pk)Livefood Direct UKW250
GlycerolSigma-AldrichG5150
Homogénéisateur (FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Hygromycine BCorning30-240CR
Luminomètre (Autolumat LB 953)Berthold34622
Tubes luminomètresCorning352054
Matrice de lysing (S, 2.0 mL)MP Biomedicals116925500
Micro seringue (25 µ ; L, 25 G)SGE3000
MicrocentrifugeuseN’importe quel fournisseurn/a
Middlebrook 7H11 agarBD Bioscience283810
Middlebrook 7H9 bouillonBD Bioscience271310
Middlebrook ADC enrichissementBD Bioscience212352
Middlebrook OADC enrichissementBD Bioscience212240
Mycobacterium bovis BCG luxDiversn/a
n-décyl aldéhydeSigma-AldrichD7384-100G
Incubateur à agitation orbitaleTout fournisseurn/a
Saline tamponnée au phosphateSigma-AldrichP4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80)Sigma-AldrichP8074-500ml
Petite boîteTout fournisseurn/aboîte ventilée foncée ou non scellée recommandée
Pince à épilerTout fournisseurn/aPince à épiler courte et étroite à pointes courtes/émoussées longues
Winterm (V1.08)Bertholdn/aProgramme LB953. Boîte
Pétri TTB (94/15 mm)Greiner633181
Papier filtre (94 mm)Tout fournisseurn/aCouper sur mesure
Greiner de

Références

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