Nous décrivons une méthode en solution pour appliquer un cisaillement uniforme aux récepteurs de surface plaquettaire à l’aide de la viscosimètre à plaques coniques. Cette méthode peut également être utilisée plus largement pour appliquer le cisaillement à d’autres types de cellules et des fragments de cellules et n’a pas besoin de cibler une paire ligand-récepteur spécifique.
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Article de méthode
Un dosage de cisaillement uniforme pour les récepteurs plaquettaires et de surface cellulaires humains via la viscosimètre à plaques coniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
De nombreuses cellules/tissus biologiques sentent les propriétés mécaniques de leurs environnements locaux via des mécanorécepteurs, des protéines qui peuvent réagir à des forces telles que la pression ou des perturbations mécaniques. Les mécanorécepteurs détectent leurs stimuli et transmettent des signaux via une grande diversité de mécanismes. Certains des rôles les plus communs pour les mécanorécepteurs sont dans les réponses neuronales, comme le toucher et la douleur, ou les cellules capillaires qui fonctionnent dans l’équilibre et l’audition. La mécanosensation est également importante pour les types de cellules qui sont régulièrement exposés à des contraintes de cisaillement telles que les cellules endothéliales, qui alignent les vaisseaux sanguins, ou les cellules sanguines qui subissent un cisaillement en circulation normale. Les viscosimètres sont des dispositifs qui détectent la viscosité des fluides. Les Viscosimètres rotatifs peuvent également être utilisés pour appliquer une force de cisaillement connue aux fluides. La capacité de ces instruments à introduire un cisaillement uniforme aux fluides a été exploitée pour étudier de nombreux fluides biologiques, y compris le sang et le plasma. La viscométrie peut également être utilisée pour appliquer le cisaillement aux cellules dans une solution, et pour tester les effets du cisaillement sur des paires spécifiques de ligands-récepteurs. Ici, nous utilisons la viscométrie à plaques coniques pour tester les effets des niveaux endogènes de contrainte de cisaillement sur les plaquettes traitées avec des anticorps dirigés contre le complexe de récepteurs mécanosensoriaux plaquettaires GPIb-IX.
Introduction
Les mécanorécepteurs sont des protéines qui réagissent aux stimuli mécaniques, tels que la pression ou la perturbation mécanique/déformation. Pour certains mécanorécepteurs, la détection de ces perturbations mécaniques est explicite à la fonction des types de cellules dans lesquels elles sont exprimées. Prenez, par exemple, les récepteurs extensibles dans les neurones barorécepteurs; ces canaux ioniques mécanosensibles régulent la tension artérielle en détectant le «Stretch» vasculaire1,2. Dans l’oreille interne, les canaux ioniques des cellules capillaires détectent les déformations mécaniques causées par les ondes sonores3, et les mécanorécepteurs à faible seuil cutané (LTM) facilitent la transmission d’informations tactiles4. Dans d’autres cas, les mécanorécepteurs fournissent des informations importantes à la cellule pour l’établissement de l’adhérence ou de la croissance. Les cellules peuvent sentir la rigidité de leur environnement local, et peuvent compter sur les forces contractiles par l’intermédiaire du cytosquelette d’actine et des intégrines pour dicter la croissance ou la propagation5,6.
Lors de l’étude des interactions récepteur-ligand dans des modèles cellulaires ou tissulaires, il existe des dosages communs qui peuvent rapidement et précisément rapporter les effets de la modification de la température, du pH, de la concentration du ligand, de la tonicité, du potentiel membranaire et de nombreux autres paramètres qui peuvent varier in vivo. Cependant, ces mêmes dosages peuvent être courts lorsqu’il s’agit de détecter la contribution de la force mécanique à l’activation des récepteurs. Si les cellules détectent leur microenvironnement, détectant des ondes sonores, ou répondant à l’étirement, une chose que les mécanorécepteurs susmentionnés ont en commun est qu’ils participent à des interactions où le ligand, récepteur, ou les deux, sont ancrés à un surface. Les essais mis au point pour tester les effets des forces mécaniques sur les interactions des récepteurs reflètent souvent ce paradigme. Microfluidics et les chambres de débit sont utilisés pour étudier les effets du flux de cisaillement sur les cellules et les récepteurs7,8. Ces types d’expériences ont l’avantage de permettre un réglage précis des taux de cisaillement par des vitesses de débit établies. D’autres techniques emploient des sondes moléculaires fluorescentes pour détecter les forces appliquées par les cellules sur des surfaces riches en ligands, donnant une lecture précise de l’amplitude et des orientations des forces impliquées dans l’interaction9,10.
En plus de la mécanosensation survenant lorsque l’un ou les deux partenaires sont ancrés sur une surface, la contrainte de cisaillement peut affecter les protéines et les cellules en solution. Ceci est souvent observé dans les cellules sanguines/protéines qui sont constamment dans la circulation, et peut se manifester par l’activation des mécanorécepteurs qui sont normalement ancrés en surface11, ou par l’exposition des séquences cibles qui seraient occlus sous conditions statiques12. Cependant, relativement moins de techniques d’essai des effets de la force de cisaillement sur les particules en solution. Certaines approches en solution introduisent le cisaillement par des cellules de Vortex dans la suspension de fluide avec des vitesses et des durées variables, bien que ces approches ne permettent pas une détermination très précise de la contrainte de cisaillement générée. Les Viscosimètres rotatifs mesurent la viscosité en appliquant une force de cisaillement spécifique aux fluides. Nous décrivons ici une méthode appliquée pour déterminer l’effet de taux de cisaillement laminaire spécifiques sur des cellules ou des fragments de cellules en solution.
L’une des protéines les plus fortement exprimées sur la surface plaquettaire est le complexe de glycoprotéine (GP) IB-IX. Le GPIb-IX est le principal récepteur de la protéine plasmatique von Willebrand Factor (VWF). Ensemble, cette paire récepteur-ligand a longtemps été reconnue comme le fondement de la réponse plaquettaire à la contrainte de cisaillement13. En cas de lésion vasculaire, la VWF se lie au collagène exposé dans la matrice Sub-endothéliale14, ce qui permet de recruter des plaquettes sur le site de la lésion par l’intermédiaire de l’interaction vWF-GPIB-IX. L’engagement de VWF sur son site de liaison dans la sous-unité GPIbα si GPIb-IX sous contrainte de cisaillement physiologique induit le déploiement d’un domaine mécanosensoriel membranaire proximal (MSD) qui à son tour active le GPIb-IX15. Dans une étude récente, nous avons montré que les anticorps dirigés contre le GPIbα, comme ceux générés chez de nombreux patients atteints de thrombocytopénie immunitaire (ITP), sont également capables d’induire la signalisation plaquettaire par le déploiement de MSD sous contrainte de cisaillement11. Cependant, contrairement à la VWF, qui facilite l’activation du GPIb-IX induite par le cisaillement en immobilisant le complexe sous une circulation normale, les anticorps bivalents sont capables de relier les plaquettes via GPIb-IX et de déplier les TMS en circulation. De cette façon, un mécanorécepteur qui est normalement activé par l’immobilisation de surface sous cisaillement peut être activé en solution. Dans le présent rapport, nous démontrerons comment un essai de cisaillement uniforme basé sur un viscosimètre a été exploité pour détecter les effets de niveaux spécifiques de contrainte de cisaillement sur l’activation des récepteurs en solution.
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Protocole
Toutes les méthodes utilisant des plaquettes humaines dérivées des donneurs décrites dans les présentes ont été approuvées par le Comité d’examen institutionnel de l’Université Emory/Children’s Healthcare d’Atlanta.
1. prélèvement sanguin et isolement plaquettaire
- Prélever du sang humain de donneurs adultes sains consentants par ponction veineuse le jour de l’expérience en 3,8% de citrate trisodique. Un tube de sang de 4,5 mL est suffisant pour produire suffisamment de plasma riche en plaquettes (PRP) pour 20-25 conditions chez les donneurs dont le nombre de plaquettes est proche de 250 x 103 par μl.
Remarque: Évitez de dessiner du sang par des aiguilles à jauge étroite (inférieures à 21 G). - Préparer la PRP par centrifugation à 22 ° c et 140 x g pendant 12 min avec un long frein. Cela se traduira par deux couches distinctes, avec des globules rouges au fond et le PRP de couleur claire en haut.
- Isolez la couche supérieure, trouble et jaune de PRP par pipetage minutieux à l’aide d’une pointe de pipette coupée à un angle de 45 ° c et obtenez le numération plaquettaire par une numération sanguine complète (CBC).
- Si nécessaire, lavez les plaquettes dans une solution saline tamponnée par les PIPES (150 mM de NaCl, tubes de 20 mM) en présence de prostaglandine E1 (PGE1) et resuspendez dans le tampon de Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM MgCl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) avec 5 mm de glucose, sinon, passez à l’étape 1,5. Les étapes suivantes décrivent le lavage en bref.
- Réglez le volume PRP à 10 mL avec une solution saline tamponnée par PIPES et ajoutez 0,6 μM PGE1.
- Centrifugez pendant 8 min à 1 900 x g, puis jetez le surnageant et laissez la pastille plaquettaire reposer dans 400 μl de solution de Tyrode et de glucose pendant 5 min.
- Résuspendez doucement le culot plaquettaire et maintenez-le intact pendant 30 min.
- Ajuster la numération plaquettaire à ~ 250 x 103 plaquettes par μl avec du plasma humain en commun (PPP) et maintenir la suspension à 22 ° c non perturbée ou en rotation douce.
2. ligand et traitement de cisaillement uniforme
Remarque: toutes les étapes de la section 2 nécessitant un pipetage doivent être faites lentement, afin de ne pas introduire de cisaillement.
- Ajouter l’anticorps ou le ligand désiré au PRP ou aux plaquettes lavées et mélanger doucement en pipetant de haut en bas ou en remuant avec une pointe de pipette. Laissez-le intact à température ambiante pendant 5-10 min. Ajoutez un volume équivalent de PPP ou de tampon de Tyrode à un contrôle négatif.
- Allumez le viscosimètre à plaque conique, réglez la température de la plaque à 22 ° c et laissez le temps de laisser la plaque atteindre cette température.
- Pipetter la PRP traitée ou les plaquettes lavées sur le viscosimètre à plaque conique contrôlé par la température directement au centre de la plaque. S’assurer que tout l’échantillon est déposé entre le cône et la plaque au point de contact, et non à l’extérieur de la jante du cône.
- Cisaillement à un rythme et une durée appropriés.
- Calculez le cisaillement comme indiqué dans le manuel du viscosimètre, ou comme indiqué précédemment15,16.
- Déterminer le taux de cisaillement de la viscosité et la contrainte de cisaillement souhaitée via la Loi de viscosité de Newton;
; la viscosité plasmatique est de 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Par exemple, une plage de cisaillement normale pour la circulation humaine est 5-30 dyn/cm2 et le cisaillement doit être appliqué sur l’échelle de temps de minute à un seul chiffre.
- Soulevez le cône hors de la plaque (~ 2 mm) de sorte que l’échantillon reste en contact avec la plaque et le cône, et utilisez une pointe de gel-chargement ou d’une autre extrémité de pipette longue pour collecter 5-10 μL du centre du volume de l’échantillon.
- Incuber les échantillons cisaillés avec les marqueurs désirés pendant 20 min à température ambiante. Pour les marqueurs de la phosphatidylsérine, du β-galactose et de l’exposition à la P-SELECTINE, utiliser le domaine du Lactadherin C2 (LactC2) à 0,08 μM18, la lectine d’Erythrina cristagalli (ECL) à 6,25 μg/ml et l’anticorps anti-p-selectin (20 μg/ml), respectivement.
- Fixer les échantillons dans 2% de paraformaldéhyde pendant 20 min à RT avant dilution ou entreposage à froid, et passer à l’étape 3,1 ou entreposer les échantillons à 4 ° c pendant plus de 12 h.
3. détection des marqueurs de surface et réticulation par cytométrie en flux
- Analysez l’échantillon par cytométrie en flux, collectant au moins 20 000 événements pour chaque condition.
- Quantiez la force du signal des marqueurs fluorescents en utilisant la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore, ou l’intensité moyenne géométrique de la fluorescence (MFI).
- Si vous visez à détecter la réticulation plaquettaire après un traitement au cisaillement, analysez l’échantillon sur un cytomètre de flux capable d’imagerie et quantiez la réticulation par zone et paramètres de rapport d’aspect.
- Tracer un histogramme de la zone et/ou le ratio d’aspect.
- Utiliser un témoin négatif avec de l’albumine sérique bovine (BSA) ou un véhicule pour tracer une barrière excluant les événements les plus circulaires (cette porte est habituellement dessinée àun rapport d’aspect ~ 0,8) et QUANTITE le pourcentage d’événements à l’intérieur de cette barrière. Les événements avec un ratio d’aspect inférieur sont plus susceptibles d’être réticulé.
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Résultats
La figure 1 décrit comment le modèle déclencheur de l’activation du GPIB-IX, initialement introduit pour expliquer l’activation du récepteur dépendant du cisaillement lorsqu’il est ancré à la paroi du vaisseau, peut également soutenir l’activation de plaquettes croisées par un ligand multivalents. La figure 2 montre les lectures de l’activation plaquettaire humaine traitée par deux anticorps ciblant le domaine N-terminal du GPIB-IX (6B4 et 11A8), et un anticorps...
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Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit permet une évaluation rapide et polyvalente de l’effet du cisaillement laminaire sur les récepteurs des plaquettes et des cellules de surface. Les résultats représentatifs spécifiques présentés ici soulignent comment les effets des ligands multimères ou bivalents peuvent être affectés par le flux de cisaillement. En plus de cette application, un essai de cisaillement uniforme a des applications larges dans l’observation des effets dépendant du cisaillement. En l’absence d’une paire l...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les travaux pertinents à cette étude ont été appuyés en partie par les instituts nationaux de santé (NIH) National Heart, Lung et Blood Institute octroie HL082808, HL123984 (R.L.) et F31HL134241 (M.E.Q.). Financement également fourni par l’Institut national des sciences médicales générales de la NIH Grant T32GM008367 (M.E.Q.); et les fonds de subvention pilote de Children’s Healthcare d’Atlanta et de l’Université Emory cytométrie en flux pédiatrique de base. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Hans Deckmyn pour avoir partagé l’anticorps 6B4 et le centre de cytométrie en flux de l’Emory Children’s pédiatrique Center pour le support technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| APC anti-humain CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Viscosimètre Brookfield Cap 2000+ | Brookfield-FITC | ||
| conjugué à lectine d’Erythrina cristagalli (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Citrate de sodium) | BD | 369714 | |
| Kit de prélèvement sanguin Vacutainer, 21G x ¾ ; " Aiguille | BD | 367287 |
Références
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Réimpressions et autorisations
