Quantification de l'activité chimiotactique monocyte in Vivo et caractérisation des macrophages dérivés du monocyte sanguin

Summary

Ici nous présentons un protocole pour quantifier l'activité chimiotactique des monocytes sanguins dans les modèles de souris, pour évaluer les effets des interventions nutritionnelles, pharmacologiques et génétiques sur le monocyte sanguin et pour caractériser les macrophages dérivés des monocytes sanguins dans modèles de souris utilisant des bouchons de gel dérivés de la membrane de membrane de membrane de sous-sol monocyte-chemoattractant-1 (MCP-1).

Abstract

L'homéostasie tissulaire et la réparation dépendent de façon critique du recrutement de macrophages dérivés de monocytes. Le sous-recrutement et le sur-recrutement des macrophages monocyte-dérivés peuvent altérer la cicatrisation de blessure. Nous avons montré que les régimes riches en graisses et en sucre favorisent l'amorçage et le dysfonctionnement de monocyte, convertissant les monocytes sains de sang en un phénotype hyper chimiotaxique prêt à se différencier en macrophages avec des profils d'activation dysregulated et phenoypic altérés Plasticité. Le sur-recrutement des macrophages dérivés de monocytes et le recrutement de macrophages avec des profils d'activation dysrégulés est considéré comme un contributeur majeur au développement de maladies inflammatoires chroniques associées aux troubles métaboliques, l'athérosclérose et l'obésité. Le but de ce protocole est de quantifier l'activité chimiothérapeutique des monocytes sanguins comme biomarqueur pour l'amorçage et le dysfonctionnement de monocyte et de caractériser les monocytes sanguins de phénotype de macrophage sont prêts à se différencier dans ces modèles de souris. À l'aide de l'analyse de tache occidentale de cellule simple, nous montrons qu'après 24 h 33% des cellules recrutées dans les bouchons de gel membranaires de sous-sol chargés de MCP-1 injectés dans les souris sont des monocytes et des macrophages ; 58% après le 3e jour. Cependant, le jour 5, les nombres de monocytes et de macrophages ont été sensiblement diminués. Enfin, nous montrons que cette analyse permet également l'isolement des macrophages vivants des bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol récupérés chirurgicalement, qui peuvent ensuite être soumis à la caractérisation ultérieure par l'analyse de tache occidentale à cellule unique.

Introduction

Le recrutement de macrophages dérivés de monocytes est essentiel pour le développement de maladies inflammatoires chroniques associées aux troubles métaboliques, y compris l'athérosclérose et l'obésité^1,2^{,3, 4}. Le nombre de macrophages monocytes-dérivés aux emplacements des dommages de tissu aussi bien que leur plasticité sont critiques pour l'homéostasie et la réparation de tissu. Le sous-recrutement et le sur-recrutement des macrophages monocyte-dérivés peuvent altérer la cicatrisation des plaies⁵. Déclencher l'inflammation des tissus locaux, par exemple, par l'accumulation et l'oxydation de la lipoprotéine de faible densité (LDL) dans la paroi aortique ou l'activation inflammatoire des adipocytes par les acides gras ou le lipopolysaccharide bactérien qui fuit à travers l'intestin barrière, mène à la libération des médiateurs inflammatoires, y compris des chemokines tels que la protéine chimioattractant de monocyte-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 est un membre de la famille c-C chemokine et un chimioattractant clé responsable du recrutement de macrophages monocytes-dérivés aux emplacements de l'inflammation de tissu et des dommages^{6,7,8, 9,10}. L'activation inflammatoire de l'endothélium vasculaire a comme conséquence l'expression des molécules d'adhérence telles que la molécule intercellulaire d'adhérence 1 (ICAM-1) et la molécule d'adhérence vasculaire de cellules 1 (VCAM-1)^11,12, permettant monocytes circulants activés par MCP-1 pour rouler le long, adhérer fermement et ensuite transmigrer dans l'espace subendothélial¹². Les monocytes infiltrants se différencient en macrophages, qui peuvent être activés dans un phénotype proinflammatoire, conduisant le processus inflammatoire aigu. Poussés par le microenvironnement, les macrophages pro-inflammatoires peuvent se convertir en macrophages résolvant l'inflammation, qui jouent un rôle critique dans le nettoyage des cellules inflammatoires, en supprimant les signaux pro-inflammatoires et en complétant la réparation et la blessure des tissus. guérison^12,13.

Le stress métabolique chronique augmente les monocytes pour une réactivité considérablement améliorée aux chimio-attractants et une augmentation du recrutement de monocytes, et nous avons montré que les monocytes apprêtés donnent lieu à des macrophages avec des programmes d'activation dysrégulés et la polarisation États^14,15,16. L'amorçage de Monocyte favorise l'athérosclérose, l'obésité, et probablement d'autres maladies inflammatoires chroniques liées aux désordres métaboliques tels que la stéatohépatite, les maladies rénales et peut-être le cancer. Pour évaluer et quantifier l'amorçage de monocyte dans les modèles de souris des maladies humaines, nous avons développé une nouvelle technique pour évaluer l'état d'amorçage des monocytes de sang en mesurant l'activité chimiotactique in vivo^{14,15,16, 17}. Notre approche consiste à injecter du gel dérivé de la membrane du sous-sol chargé soit d'un chimioattractant — nous utilisons couramment le MCP-1 — ou d'un véhicule sur le flanc gauche et droit, respectivement, de souris. Lorsqu'il est soigneusement injecté sous-cutanée, le gel dérivé de la membrane du sous-sol formera un seul bouchon, à partir duquel les chimiocines peuvent se diffuser et créer un gradient chimiotaxique défini qui n'est pas affecté par l'état métabolique ou inflammatoire de l'environnement tissu ou la souris receveuse.

Le gel dérivé de la membrane du sous-sol que nous utilisons pour notre essai est une préparation solubilisée de membrane de sous-sol extraite du sarcome de souris d'Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), une tumeur riche en ces protéines extracellulaires de matrice (ECM). Ce mélange complexe de protéines contient de la lamininin (60%), du collagène IV (30%), de l'entactine de la molécule de pontage (8%), et d'un certain nombre de facteurs de croissance. L'assay de la matrice de membrane de sous-sol a été à l'origine développé pour étudier l'angiogenèse en réponse à divers facteurs de croissance^18,19. Cependant, afin d'étudier la chimiotaxie monocyte, il est important d'employer le gel membrane-dérivé de sous-sol facteur de croissance-appauvri pour réduire au minimum le recrutement endothélial de cellules et l'angiogenèse. Ce qui rend Matrigel (appelé gel dérivé de la membrane du sous-sol désormais) unique et particulièrement utile, c'est qu'à des températures inférieures à 10 oC, il se liquéfie, ce qui permet de dissoudre les chimiocines. À des températures supérieures à 22 oC, la solution dérivée de la membrane du sous-sol subit rapidement une transition de phase et forme rapidement un hydrogel. Les bouchons peuvent être excisés chirurgicalement, nettoyés et dissous à l'aide d'un métalloproté neutre dérivé du bacille pour produire des suspensions à cellule unique, qui peuvent être analysées sur un trieur de cellules activé par la fluorescence (FACS), par RNAseq, l'ARN unicellulaire et une variété d'autres techniques d'omique. Ici nous décrivons l'utilisation de l'analyse occidentale de tache unicellulaire pour la caractérisation des populations de cellules recrutées dans les bouchons de gel membrane-dérivés de sous-sol un, trois ou cinq jours après injection.

Protocol

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de la Wake Forest School of Medicine.

1. Préparation de la solution dérivée de la membrane de sous-sol réduite par le facteur de croissance MCP-1-chargé

REMARQUE: C'est une procédure stérile.

1. Capuchon de culture cellulaire propre avec désinfectant avant de préparer la solution dérivée de la membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel).
2. Préparer individuellement emballé seringue stérile 1 mL et essuyer le haut de la membrane du sous-sol flacon de solution dérivée avec un écouvillon d'alcool avant de le charger dans la seringue.
3. Décongeler complètement la solution dérivée de la membrane du sous-sol réduite par facteur de croissance sur la glace.
   MISE EN GARDE: Si la matrice de membrane du sous-sol est décongelée à température ambiante (RT), assurez-vous qu'une petite particule de glace reste pour empêcher la solution de gélifier.
4. Une fois décongelé, ouvrez le flacon et mélangez MCP-1 ou 1xPBS avec 0,1% de BSA dans le capot de culture cellulaire.
5. Préparer une 1 ml de seringue stérile avec une aiguille de 26 G et laisser refroidir sur la glace.
6. Préparer une solution d'actions de MCP-1 en dissolvant MCP-1 à une concentration finale de 50 g/mL en 1x PBS avec 0,1% de BSA.
7. Diluer MCP-1 dans 5 mL de solution froide dérivée de la membrane du sous-sol à une concentration finale de 500 ng/mL. Préparer une quantité égale de solution dérivée de la membrane du sous-sol avec le véhicule seulement (1x PBS contiennent 0,1% de BSA).
8. Chargez 500 l de solution dérivée de la membrane du sous-sol (avec ou sans MCP-1) dans la seringue froide de 1 ml.
9. Retirez toutes les bulles d'air de la seringue chargée de solution dérivée de la membrane du sous-sol avant de faire l'injection pour assurer une formation uniforme de bouchon.

2. Injection de solution dérivée de la membrane de sous-sol

1. Vaporiser 70% d'éthanol autour de la zone de procédure avant et pendant les injections pour désinfecter l'environnement.
2. Pour induire l'anesthésie, placez la souris dans une chambre d'anesthésie et réglez le compteur d'écoulement O₂ à 1 litre/min, puis ajustez le vaporisateur à 2% d'isoflurane.
3. Surveillez la profondeur de l'anesthésie en surveillant la fréquence respiratoire (taux/min), le réflexe cornéen et le mouvement des moustaches.
4. Pendant toute la procédure, maintenir l'anesthésie à l'aide d'un cône nasal.
5. Pendant la procédure, continuez à surveiller la fréquence respiratoire (taux/min), le réflexe cornéen et le mouvement des moustaches pour vérifier la profondeur de l'anesthésie.
6. Après avoir confirmé l'absence de réponse à la pince des orteils, injectez lentement (environ 100 L/s) la solution dérivée de la membrane du sous-sol sous-cutanée dans la droite (pas de MCP-1) et à gauche (avec MCP-1) flanc de la souris, respectivement. Si l'injection est trop lente, les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol peuvent devenir de forme irrégulière, voire fragmentée, et difficiles à enlever.
7. Maintenez la seringue pendant 20-30 s après l'injection pour empêcher la fuite de la solution et pour permettre à un seul gel-plug lisse de se former.
8. Après l'injection, placer la souris sur la plaque chauffante avec surveillance jusqu'à la récupération.
9. Remettre la souris dans la cage d'origine une fois la souris complètement récupérée.

3. Récoltez les bouchons de gel dérivés de la membrane de sous-sol

1. Peser deux tubes de microcentrifuge distincts de 1,5 ml pour chaque souris et les étiqueter.
2. Trois jours après l'injection de la solution dérivée de la membrane du sous-sol, euthanasiez la souris dans la chambre anesthésique à l'aide de 3 % d'isoflurane suivi d'une luxation cervicale.
3. Retirez la fourrure dorsale de la souris à l'aide de tondeuses à cheveux ou appliquez de la crème anticapacune avec des bâtonnets à pointe de coton pendant 5 min, puis essuyez-les.
4. Maintenez la peau de la souris à l'aide de forceps autour de la vertèbre thoracique inférieure et supérieure lombaire et faites une incision de 2 mm de long dans la peau.
5. Couper la ligne médiane de l'arrière de la souris à partir d'une incision faite jusqu'aux vertèbres cervicales et jusqu'à 1 cm au-dessus de la jonction des vertèbres caudale (jonction de queue) à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
6. Séparez la peau de la couche musculaire et épinglez la peau sur une plate-forme en mousse de polystyrène.
7. Tenez soigneusement la capsule fibreuse qui contient le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol à l'aide de forceps fins et retirez la capsule fibreuse à l'aide de ciseaux fins pour nettoyer la fiche.
8. Retirez le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol et transférez-le à 1,5 ml de microcentrifuge (voir 3.1).
9. Pesez le tube de microcentrifuge avec le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol nettoyé et calculez le poids du bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol.

4. Diger les bouchons de gel dérivés de la membrane de sous-sol

1. Dégeler le dépase (10 ml) sur la glace.
2. Émincer le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol dans le tube de microcentrifuge à l'aide de ciseaux fins propres.
3. Ajouter 800 l de dispase dans chaque tube de microcentrifuge contenant un bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol.
4. Vortex avec une vitesse maximale de 10 s pour perturber la prise.
5. Incuber les tubes de microcentrifuge pendant 2 h à 37 oC à 1 400 tr/min dans un thermomélangeur pour dissoudre complètement le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol.
6. Après 2 h, centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min à RT. Retirez soigneusement et jetez le supernatant.
7. Resuspendre la pastille en 1 ml de 1x PBS en inversant ou en tapant.
8. Répéter la centrifugation à 200 x g pendant 10 min à RT. Retirez soigneusement et jetez le supernatant.
9. Resuspendre la pastille dans 300 OL de PBS.
10. Prendre une suspension cellulaire de 50 ll dans un tube de microcentrifuge distinct.
11. Ajouter 0,5 L de calcéinam (1 M) à la suspension cellulaire.
    REMARQUE: Calcein AM est un colorant vert de viabilité de cellules fluorescentes qui s'accumule seulement dans les cellules vivantes.
12. Incuber les cellules dans un incubateur de CO₂ à 37 oC pendant 10 min.
13. Comptez les cellules fluorescentes vertes (vivantes) et non fluorescentes (mortes) à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé.

5. Déterminer la composition cellulaire dans la suspension cellulaire à l'aide d'une analyse de blot occidental à cellule unique (ScWB)

1. Réhydratez la puce scWB avant d'être utilisée dans 15 ml de tampon de suspension 1x dans un plat Petri pendant au moins 10 min à RT.
2. Ajouter 1 ml de suspension à une seule cellule diluée (10 000 à 100 000 cellules/mL) à la puce réhydratée. Mettre la surface sur le fond d'un plat Petri de 10 cm. Assurez-vous que la surface est fixée à plat.
3. Couvrir le plat Petri avec un couvercle pour éviter le séchage et laisser les cellules se contenter de 5-15 min par gradient.
4. Placez la puce sous un microscope à champ lumineux et inspectez les puits à 10x grossissement.
   REMARQUE: Environ 15 à 20 % des micropuits devraient être occupés par une seule cellule, moins de 2 % des puits devraient contenir 2 cellules ou plus.
5. Inclinez le plat Petri de 10 cm contenant la puce de 45 degrés.
6. Laver la puce avec le tampon de suspension 1x pour enlever les cellules non capturées de la surface de la puce par pipetting douce de haut en bas de la puce. Répéter 3 fois.
7. Préparer l'instrument occidental à cellule unique.
8. Définir le temps de lyse, le temps d'électrophorèse et le temps de capture UV. Pour analyser les macrophages recrutés récupérés dans le bouchon de gel dérivé de la membrane du sous-sol, utilisez les paramètres suivants : temps de lyse : 0 s; temps d'électrophoresis : 160 s ; Temps de capture UV 240 s.
9. Chargez soigneusement la puce dans la cellule électrophorose de l'instrument occidental à cellule unique, face au gel. Soyez prudent pour ne pas endommager le côté gel de la puce.
10. Verser la lyse /courant tampon dans la chambre et couvrir complètement l'ensemble de la puce occidentale à cellule unique. Démarrez la lyse cellulaire.
11. Exécutez l'instrument scWB en utilisant le paramètre indiqué dans 5.8.
12. Une fois la course terminée, transférer la puce dans un plat Petri de 10 cm et laver la puce deux fois avec un tampon de lavage 1x pendant 10 min à RT.
13. Préparer les dilutions des anticorps primaires (anti-vinculine: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) dans un volume total de 80 l de diluant d'anticorps (mélange 8 'L d'anticorps 1 plus 8 'L d'anticorps 2 plus 64 'L de diluent).
14. Ajouter 80 L de la solution d'anticorps primaire à la chambre de sondage d'anticorps et abaisser le gel-côté de puce vers le bas de sorte que la solution d'anticorps mèches à travers la puce.
15. Incuber avec la solution d'anticorps primaire pour 2 h à RT.
16. Laver la puce trois fois pendant 10 min dans un tampon de lavage 1x sur le shaker.
17. Laver la puce une fois pendant 10 min dans l'eau sur le shaker pour dessaler le gel.
18. Préparer une dilution de 1:20 d'anticorps secondaires dans un volume total de 80 L (mélange de 2 l d'anticorps secondaires plus 78 l de diluant).
19. Incuber la puce avec un anticorps secondaire pendant 1 h à RT protégé de la lumière.
20. Laver la puce trois fois pendant 10 min avec un tampon de lavage 1x sur le shaker.
21. Faites pivoter la puce à l'aide d'une filature de diapositives pour enlever tout tampon de lavage restant.
22. Scanner la puce sur un scanner à microréseau à double laser à une résolution de 5 m au canal spectral du fluorophore couplé aux anticorps secondaires.
23. Analyser les données à l'aide d'un logiciel spécifique à la ScWB.

6. Dépouillement de la puce scWB

1. Conserver la puce numérisée dans un tampon de lavage jusqu'à ce qu'elle soit prête à se déshabiller.
2. Placez le bain d'eau dans un capuchon de fumée.
3. Placez un support à tube de 50 ml dans le bain d'eau avec l'eau à seulement 1 cm au-dessus du support et placez la température de l'eau à 60 oC.
4. Préparer le tampon de décapage. Pour 1 L de solution tampon de décapage, dissoudre 9,85 g de Tris-HCl (pH 6,8) et 20 g de SDS dans 900 ml d'eau distillée et ajuster le pH. Ensuite, remplissez d'eau distillée à 1L. Ajouter 0,8 % (v/v) de '-mercaptoethanol (ME-ME; 14,3 M) immédiatement avant chaque utilisation.
5. Après l'analyse initiale, placez la puce dans un plat Petri de 10 cm avant de le décaper.
6. Pour chaque puce, prendre 40 ml de tampon de décapage et ajouter 320 'l de 'ME.
   ATTENTION : Le ME est toxique et dangereux pour l'homme et l'environnement. La procédure suivante doit être effectuée dans une hotte de fumée.
7. Placez la puce dans la boîte et scellez la boîte avec du parafilm pour éviter que l'eau ne s'infiltre dans la boîte.
8. Placez la cartouche à l'intérieur de la grille tubulaire dans le bain d'eau pré-chauffé.
9. Incuber 90 min.
10. Retirer délicatement la puce de la boîte et la placer dans un plat Petri frais.
11. Laver brièvement la puce une fois avec 1x tampon de lavage. Ajouter ensuite 15 ml de tampon de lavage 1x au plat Petri.
12. Laver la puce pendant 15 min sur un shaker. Répétez l'étape de lavage quatre fois.
    REMARQUE: Chip est prêt pour le prochain anticorps primaire (voir les étapes 5.12 - 5.21).

Results

Pour accéder à la réactivité des monocytes sanguins aux chimioattractants, nous avons injecté une solution dérivée de la membrane du sous-sol chargée par le véhicule et le MCP-1 dans les flancs gauche et droit de chaque souris. Les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol ont été enlevés 1, 3 et 5 jours après que les injections, dissoutes et les cellules recrutées dans chaque prise aient été comptées (Figure 1A). En soustrayant le nombre de cellules dans le bouchon chargé par le véhicule (barres ouvertes) du nombre de cellules dans le bouchon chargé MCP-1 (barres fermées), nous avons obtenu le nombre de cellules spécifiquement recrutées en réponse au MCP-1 (numéro de cellule, figure 1B). Nous avons observé un recrutement et une accumulation accélérés de cellules spécifiques au MCP-1 au cours de la période de 5 jours, les taux passant de 31 000 cellules par jour (jour 1) à 78 000 cellules/jour (jour 3) et 136 000 cellules/jour au jour 5 (figure1B).

Pour identifier les types de cellules qui sont entrés dans les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol, nous avons soumis les cellules isolées de chaque prise à une seule cellule d'analyse de tache occidentale (ScWB), sonder pour CD45, CD11b et F4/80 expression pour identifier les monocytes (CD11b^-F4/80 ^-), les macrophages (CD11b^etF4/80- plus CD11b^-F4/80⁾et les leucocytes non monocytiques restants (CD45^etCD11b^-F4/80^-) (Figure 2). Les puces scWB ont ensuite été sondées pour la vinculaine afin de déterminer le nombre total de cellules sur chaque gel et de confirmer l'occupation d'une seule cellule des micropuits sur la puce scWB. Le pourcentage de monocytes dans les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol mcP-1 était faible au jour 1, 20 %, a atteint un sommet au troisième jour à 47 %, respectivement, avant de tomber à 14 % au jour 5 (figure 2D). Les nombres de macrophages dans les bouchons de gel munis-1 de la membrane de sous-sol de MCP-1 ont augmenté régulièrement de 13% au jour 1, à 22% le jour 3 et 23% le jour 5. Pour les prises à chargement MCP-1, le pourcentage de monocytes plus de macrophages au sein de la population cellulaire isolée était le plus élevé au jour 3, 31 % dans les bouchons chargés par véhicule (figure 3A) et 58 % dans les bouchons chargés de MCP-1 (figure 3B), ce qui indique qu'après 3 jours la grande majorité des cellules recrutées par les chimiotaxis MCP-1-dépendants sont des monocytes et des macrophages. Même si le nombre total de monocytes plus macrophages était plus élevé au jour 5 par rapport au jour 3 (Figure 3C et D), en raison de la proportion significativement plus élevée de monocytes et de macrophages dans la population cellulaire totale ( Figure3A et B), le nombre de cellules au jour 3 reflète plus exactement la chimiotaxie monocyte sanguin et le recrutement. Nous injectons donc systématiquement la solution dérivée de la membrane du sous-sol trois jours avant de sacrifier les animaux. On n'a pas déterminé si tous les macrophages recrutés par MCP-1 sont des macrophages monocytes ou résidents recrutés à partir de tissus voisins.

L'analyse statistique des données présentées ici a été effectuée à l'aide d'un logiciel d'analyse (p. ex., SigmaPlot 14). ANOVA suivi du test Fischer LSD a été utilisé pour comparer les valeurs moyennes entre les groupes expérimentaux. Toutes les données sont présentées comme moyennes et DD d'au moins 3 expériences indépendantes. Les résultats ont été jugés statistiquement significatifs au niveau De lt; 0,05.

Figure 1 : Quantitation des cellules recrutées dans les bouchons de gel dérivés de la membrane sous-cutanée du sous-sol. (A) Numéros de cellules absolues pour les bouchons de gel (barres fermées) chargés par le véhicule et mcP-1 à membrane de sous-sol (barres fermées). (B) Le nombre de cellules recrutées dans les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol par MCP-1 a calculé comme la différence dans les nombres cellulaires entre les bouchons chargés par MCP-1 et les bouchons chargés par le véhicule. Les résultats sont affichés comme moyen - SD (n 4) S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 2 : Analyse des populations cellulaires recrutées dans les bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol par analyse de tache occidentale à cellule unique. (A-B) Des exemples représentatifs sont présentés pour l'analyse scWB d'un véhicule chargé (Contrôle) et d'une prise à tête MCP-1 (MCP-1) isolée d'une souris trois jours après l'injection. Les puces étiquetées avec des anticorps dirigés contre CD45, CD11b et F4/80 suivies d'anticorps secondaires fluorescents tels que décrits dans le Protocole. L'intensité de fluorescence de la bande étiquetée pour chaque cellule individuelle est indiquée comme zone de pointe. (C-D) Les populations cellulaires ont été identifiées comme des monocytes (CD11b^-F4/80^-, ), des macrophages (CD11b^-F4/80^- plus CD11b^-F4/80^,, ou comme des leucocytes non monocytiques (CD45 , ). Les cellules restantes ont étéétiquetées « autres » ( ). Les résultats sont affichés comme moyen de SD (n '3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Figure 3 : Contenu de monocyte et de macrophage des bouchons de gel membranaires de sous-sol. Analyse quantitative de la teneur en monocytes et macrophages recrutés dans les bouchons chargés par véhicule et MCP-1 enlevés au jour 1, 3 et 5 après l'injection. Les valeurs sont indiquées en pourcentage de la population cellulaire totale (A et B) et en nombre séquipandien par prise ( C etD). Les résultats sont affichés comme moyen de SD (n '3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 

Discussion

Nous avons développé un résultat chimiotaxie in vivo, en faisant usage des propriétés physiques uniques de la matrice dérivée de la membrane du sous-sol et de la capacité de charger cette matrice unique de chimiocines et de l'injecter chez la souris. L'essai nous permet d'évaluer chez les souris vivantes la réactivité des monocytes (et des macrophages) aux chimiocines, comme illustré ici pour MCP-1, et les effets de la manipulation génétique ou pharmacologique, diététique et autres expositions environnementales sur les monocytes Chemotaxis. Parce que le gradient chimiokine que nous créons chez ces souris n'est essentiellement pas affecté par l'exposition génétique, pharmacologique, diététique ou environnementale, les changements dans l'activité chimiotactique monocyte reflètent réellement les changements fonctionnels dans ces monocytes et, comme nous l'avons montré précédemment, aussi la reprogrammation à la fois à la protéine et le niveau transcriptionnel^17,20. Nous avons rapporté que le stress métabolique chez les souris augmente la réactivité de monocyte au chimioattractant et que cette activité hyper-chimiotactique corrèle avec la protéine accrue S-glutathionylation, un réversible, redox-dépendant posttranslationnel modification des protéines, qui dans la plupart des cas conduit à la perte de la fonction enzymatique et protéique^21,22, et dans certains cas favorise même la dégradation des protéines^16,23.

Pour exécuter avec succès cette procédure et pour obtenir des résultats optimaux avec cet test, il est essentiel que des volumes précis de solution dérivée de la membrane du sous-sol soient injectés lentement pour créer un bouchon et des capsules fibreuses singulières bien formées. complètement pour obtenir des bouchons propres lors de la récolte des bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol, facilite la dissolution de l'ensemble du bouchon dans la solution de dispase. Nos données montrent que laisser le bouchon dans les animaux pendant trois jours optimise 1) l'intensité du signal, c'est-à-dire le nombre de monocytes et de macrophages recrutés dans chaque prise, 2) la sélectivité du signal, c'est-à-dire le contenu des monocytes et des macrophages au sein de la populations cellulaires totales et 3) la spécificité du signal, c'est-à-dire l'augmentation des monocytes et des macrophages en réponse au MCP-1 par rapport au véhicule. Enfin, nous démontrons comment des approches à base de cellules individuelles de pointe en conjonction avec l'analyse de la fiche de gel dérivée de la membrane du sous-sol peuvent être utilisées pour caractériser les monocytes recrutés dans les bouchons et ainsi obtenir un instantané du phénotype potentiel de les macrophages dérivés du monocyte étant recrutés sur des sites de blessures dans un modèle de souris donné en réponse à des interventions génétiques, pharmacologiques, diététiques ou environnementales spécifiques.

Il y a un certain nombre de limites à considérer. Tout d'abord, la manipulation de la souris, y compris l'anesthésie, l'injection de la solution dérivée de la membrane du sous-sol, et la dissection chirurgicale nécessite la pratique de générer des bouchons uniques et des données reproductibles. Deuxièmement, alors que la plupart des cellules recrutées dans les bouchons chargés MCP-1 sont des monocytes et des macrophages, un nombre important ne le sont pas. Cela peut affecter l'interprétation d'autres essais analytiques non à cellule unique effectués sur cette population cellulaire. Enfin, puisque les conditions de lyse cellulaire pour scWB sont douces, les distances de migration des protéines peuvent différer de wb standard et ne peuvent pas corrélé avec la taille des protéines. Par conséquent, la lyse cellulaire et les temps d'exécution doivent être validés pour chaque nouvelle protéine à tester et chaque anticorps primaire utilisé.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm boîte	Pétri broyeur Bio-One	664 160
10x tampon de suspension	Proteinsimple	R101
15 cm Boîte de Pétri	Falcon	353025
2-Mercaptoethanol	MP BIOMEDICALS	2194705
5 % tampon de lavage	proteinsimple	R252
Protéine diluante d’anticorpssimple		042-203
Centrifugeuse de paillasse	Beckman Coulter		Microfuge 22R Centrifugeuse
Serim Albumine bovine	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein AM	ThermoFisher	C3099	1 mL
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) mAb lapin	Cell Signal Technologies	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Cellomètre Vision	Nexcelom
Dispase	BD	354235	100 mL
Sissor
Donkey anti-Rabbit IgG anticorps secondaire [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 conjugué
Anticorps secondaire anti-Rat IgG (H+L) de l’âne [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 conjugué
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Heat Block	effendorf	22331	Thermomixer
Lysis/Running	proteinsimple	R200
Matrigel Matrix (facteur de Grwoth réduit)	BD	354230	10 ml
Scanner à microréseaux	PerkinElmer	ScanArray Gx
Tube à microcentrifuger	Fisher Scientific	05-408-129
Microscope	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		Single cell
western Needle	BD	305111	26 G
Parafilm
Protéine de la chambre de sondesimple		035-020
Souris recombinante CCL2/JE/MCP-1 protéine	R& D	479-JE-050
scWEST	chip proteinsimple	C300
Shaker	Bioexpress		Gene mate orbital shaker
Single cell western chip canister	proteinsimple	035-118
Slide spinner	Labnet	C1303-T
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
Seringue	BD	309602	1 mL
Tris-Chlorhydrate	Fisher Scientific	BP 153-500
Pince à épiler	proteinsimple	035-020
Bain-marie	ThermoFisher