Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.
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Article de méthode
Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l'utilisation d'expériences de fermentation par lots qui permettent d'évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l'aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l'analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d'acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d'autres endobiotiques et le microbiote intestinal.
Introduction
Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l'hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies1. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l'hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel considérable pour influencer la composition bactérienne et la diversité du microbiote intestinal. Ainsi, les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ont attiré l'attention croissante de la recherche4,5,6,7,8,9.
Il est difficile d'évaluer in vivo les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. Par exemple, des expériences sur les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ne peuvent être réalisées sans la permission de la Food and Drug Administration, et le recrutement de volontaires coûte cher. Par conséquent, les modèles animaux sont souvent utilisés pour de telles enquêtes. Cependant, l'utilisation de modèles animaux est limitée en raison de différentes compositions de microbiotes et de la diversité dans les communautés associées aux animaux par rapport à l'homme. Une autre méthode in vitro pour explorer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain est l'utilisation d'expériences de culture par lots.
Les exopolysaccharides (EPS) sont des prébiotiques qui contribuent de manière significative au maintien de la santé humaine10. Les EPS distincts qui se composent de différentes compositions et structures monosaccharides peuvent présenter des fonctions distinctes. Des analyses antérieures ont déterminé la composition des EPS Bif, qui sont le xénobiotique représentatif visé dans la présente étude11. Cependant, les effets métaboliques associés à l'hôte n'ont pas été pris en considération en ce qui concerne la composition et la diversité de l'EPS.
Le protocole décrit ici utilise le microbiote fécal de 12 volontaires pour fermenter les EPS Bif. La chromatographie à couches minces (TLC), le séquençage à haut débit du gène 16S rRNA et la chromatographie gazeuse (GC) sont ensuite utilisés en combinaison pour étudier les interactions entre les SPE et le microbiote intestinal humain. Les avantages distincts de ce protocole par rapport aux expériences in vivo sont son faible coût et l'évitement des effets d'interférence du métabolisme de l'hôte. En outre, le protocole décrit peut être utilisé dans d'autres études qui étudient les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain.
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Protocole
Ce protocole suit les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan (Hunan, Chine) et de l'Université Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chine).
1. Préparation des bactéries
- Préparation du bouillon bifidobacterium moyen
- Mélanger les composants suivants dans 950 ml d'eau distillée : extrait de viande, 5 g/L; extrait de levure, 5 g/L; peptone de caséine, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Entre-4 80, 1 ml; solution de sel, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); et la résine, 0,4 ml (2,5 mg/L). Ajuster le pH à 6,8 avec 2 M NaOH.
- Autoclave à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir le bouillon à température ambiante (RT) dans des conditions anaérobies (10 % H2, 10 % CO2, 80 % N2). Ajouter la cystéine-HCl stérilisée par filtre (0,5 g/L) et la mupirocine (5 mg/L) au milieu.
- Ajouter un aliquot (50 l) de Bifidobacterium longum congelé à un tube de culture avec 5 ml de bouillon bifidobacterium moyen dans des conditions anaérobies, puis la culture dans un incubateur anaérobie pendant 24 h à 37 oC.
2. Préparation des EPS bifidobactériens
- Préparation du milieu d'agar PYG
- Combiner ce qui suit : peptone, 20 g/L; extrait de levure, 10 g/L; glucose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Ajuster le pH à 7,2 à l'aide de 10 M NaOH.
- Autoclave zèle le support à 121 oC pendant 15 min et refroidissez-le à 50 oC. Puis, par 1 L de milieu, ajouter 0,5 mL de vitamine K1 stérolisée par filtre (1 g de vitamine K1 dissous en 99 ml d'éthanol à 99 %), 5 mL de solution d'hémin (0,5 g d'hémindin dissous en 1 ml de 1 mol/L NaOH , a ensuite apporté jusqu'à 100 ml avec de l'eau distillée), et 0,5 g de cystéine-HCl.
- Avant de verser les plaques PYG, ajouter les plaques PYG stérilisées 5-bromo-4-chloro-3-indolylMD-D-galactopyranoside (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) et mupirocin (5 mg/L) au milieu.
REMARQUE : X-Gal et LiCl.3H2O permettent l'identification des colonies de Longum de B. sur des plaques par des changements de coloration.
- Inoculer 20 oL de souches de B. longum (étape 1.2) aux plaques PYG et placer dans un incubateur anaérobie à 37 oC pendant 72 h.
- Recueillir les colonies bactériennes mucoïdes des plaques PYG à l'aide d'une pelle de pesage, puis resuspendre complètement dans 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS) à l'aide d'un oscillateur vortex.
REMARQUE : Les mélanges bactériens et EPS doivent être complètement suspendus par le vortex ingou vers le haut ou le tuyautt de haut en bas à plusieurs reprises jusqu'à ce que les fibres soient complètement dissous dans PBS. - Centrifugelant la suspension à 6 000 x g pendant 5 min.
- Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse et mélanger complètement avec trois volumes d'éthanol froid à 99 % par inversion et mélange répétés.
- Centrifuger le mélange à 6 000 x g pendant 5 min et retirer complètement les supernatants.
- Retirer les précipités des tubes de centrifugeuse en grattant et en séchant les extraits d'EPS pendant la nuit à l'aide d'un aspirateur de vitesse.
3. Préparation du milieu de fermentation
- Préparation de la culture de base moyen VI
- Combiner ce qui suit : peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; extrait de levure, 4,5 g/L; mucine, 0,5 g/L; sels de bile no 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl26H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO47H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl2H2O, 0,1 g/L; ZnSO47H2O, 0,18 g/L; CuSO45H2O, 0,01 g/L; et NiCl2x 6H2O, 0,092 g/L. Ajuster le pH à 6,5 avec 1 M HCl.
- Préparer l'hémine et la cystéine comme fait dans la section 2.1 et ajouter après l'autoclacage et le refroidissement.
- Préparer des supports culturels qui contiennent différentes sources de carbone avec un média de base VI. Avant l'autoclacnage, ajouter 8 g/L de fibres Bif EPS à un VI moyen, comprenant le groupe VI-Bif. De plus, ajoutez 8 g/L d'amidon à un ive moyen pour représenter le groupe VI-Starch. Enfin, le moyen VI sans ajout d'une source de carbone est utilisé comme contrôle (groupe VI).
REMARQUE : Le Bif EPS et l'amidon sont d'abord dissous dans l'eau chaude à l'aide d'un agitateur magnétique, puis mélangés à un milieu VI préparé. - Autoclave tous les médias à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir à RT.
- Transférer un sous-échantillon (5 ml) de chaque milieu dans des tubes de culture dans un incubateur anaérobie, et conserver le support restant à 4 oC.
4. Préparation d'échantillons fécaux humains
- Recueillir des échantillons de matières fécales fraîches immédiatement après la défécation fraîche de volontaires humains adultes en bonne santé à l'aide de récipients d'excréments, et ensuite utiliser pour la préparation de boue.
REMARQUE : Avant la collecte de l'échantillon, tous les volontaires devraient subir un dépistage afin de s'assurer qu'ils ne reçoivent pas d'antibiotiques, de probiotiques ou de traitements prébiotiques pendant au moins 3 mois avant de donner des échantillons. De plus, tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé et écrit. - Transférer un échantillon fécal frais (1 g) à 10 ml de 0,1 M DE PBS anaérobie (pH 7,0) dans des béchers en verre, puis utiliser des tiges de verre pour préparer une boue de 10 % (w/v).
- Utilisez un tamis de 0,4 mM pour filtrer la boue fécale. Ensuite, utilisez un sous-échantillon de la boue filtrée pour inoculer les expériences de fermentation de la culture par lots, et entreposez le reste à -80 oC pour d'autres analyses.
REMARQUE : Les étapes 4.2-4.3 sont effectuées dans une chambre anaérobie.
5. Fermentation par lots in vitro
- Ajouter la boue fécale filtrée (500 l) au milieu de fermentation préparé à l'étape 3.2 dans une chambre anaérobie, puis incuber à 37 oC.
- Recueillir 2 ml d'échantillons fermentés à 24 h et 48 h dans la chambre anaérobie, puis centrifuger à l'extérieur de la chambre à 6 000 x g pendant 3 min.
- Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse qui sera utilisé pour l'analyse de la dégradation des polysaccharides et les mesures des acides gras à chaîne courte (SCFA).
- Entreposer les granulés de centrifugation à -80 oC et les utiliser par la suite pour l'extraction de l'ADN génomique bactérien.
6. Dégradation de l'EPS par le microbiote fécal humain
- Chargez 0,2 L de supernatants fermentés sur des plaques d'aluminium en silice pré-enduite 60 TLC, puis séchez à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Développer les plaques dans 20 ml d'un acide formique / n-butanol / eau (6:4:1, v:v:v) solution et sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Faire tremper les assiettes dans le réactif orcinol pour les colorer, puis sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Préparer les réactifs orcinol en dissolvant 900 mg de Lichenol dans 25 ml d'eau distillée, puis en ajoutant 375 ml d'éthanol. Par la suite, l'acide sulfurique concentré devrait être lentement ajouté et la solution complètement mélangée.
- Chauffer les plaques à 120 oC pendant 3 min dans un four à pâtisserie et évaluer la dégradation de l'EPS en mesurant les bandes de TLC.
7. Effets de l'EPS sur le microbiote intestinal humain
- Décongeler-décongeler les échantillons fécaux originaux préparés à l'étape 4.3 et les échantillons fermentés préparés à l'étape 5.4.
- Extraire l'ADN génomique bactérien (ADNG) de tous les échantillons à l'aide d'une trousse d'extraction d'ADN génomique bactérien des selles suivant les instructions du fabricant.
- Déterminer les concentrations d'ADN, les intégrosités et les distributions de taille à l'aide d'un micro-spectrophotomètre et d'une électrophorèse de gel d'agar.
- Conduisez PCR des gènes bactériens 16S rRNA de l'ADNc extrait à l'aide des amorces avant et inverses décrites précédemmentprécédemment 12:
- Amorce avant (amorce à code à barres 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCACA
-amorce inversée (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Utilisez les conditions suivantes :- 94 oC pendant 5 min.
- 94 oC pour 30 s.
- 55 oC pour 30 s.
- 72 oC pour 1 min.
- Répéter 2 à 4 pendant 35 cycles
- 72 oC pendant 5 min.
- 4 oC jusqu'à l'enlèvement du cycleur thermique.
- Effectuer un séquençage à haut débit des produits PCR dans une entreprise de séquençage de l'ADN à l'aide d'une analyse communautaire microbienne à très haut débit.
- Obtenir des séquences propres et de haute qualité à l'aide du pipeline d'analyse de séquences13.
- Définir les unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) pour les séquences de gènes 16S rRNA avec plus de 97% de similitude nucléotide à l'aide d'outils bioinformatiques tels que la suite logicielle Mothur14.
- Choisissez une séquence représentative de chaque OTU et utilisez le classificateur RDP avec la base de données taxonomique SILVA pour classer les séquences représentatives15.
- Calculer la couverture de Good, les mesures de la diversité alpha (y compris l'indice Simpson et Shannon) et la richesse (nombre observé d'OTUs) à l'aide d'outils de bioinformatique16.
8. Effets de l'EPS sur la production de SCFA par microbiote intestinal humain
- Ajouter les supernatants fermentés (1 ml) préparés à l'étape 5,3 à 2 ml de tubes centrifugeurs.
- Ajouter 0,2 ml d'acide métaphosphorique de 25 % (w/v) à chacun des échantillons et mélanger soigneusement les solutions par vortex.
- Centrifuger les mélanges à 13 000 x g pendant 20 min et transférer les supernatants dans des tubes frais.
- En même temps, préparez des solutions de 120 mM d'acides acétiques, propioniques, butyriques, isobutyriques, valeriques et isovaleric. Ensuite, ajouter 1 ml de chaque acide préparé à 1,2 ml de 25 % (w/v) d'acide métaphosphorique et utiliser comme cocktails standard.
- Filtrer les échantillons à l'aide d'une membrane de 0,22 M.
- Détecter les concentrations de SCFA à l'aide d'une chromatographie gazeuse de haute performance selon les protocoles précédemment décrits11,17.
REMARQUE : Une colonne InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 M) est utilisée pour la chromatographie gazeuse (GC). Les concentrations de SCFA sont ensuite quantifiées en fonction des zones de pointe en utilisant la méthode standard interne à un seul point dans le logiciel GC Solution.
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Résultats
La production d'EPS mucoid a pu être observée dans les cultures De B. longum sur les plaques PYG après incubation anaérobie pendant 72 h (figure 1A). La centrifugation des égratignures de culture, suivie des précipitations et du séchage de l'éthanol, a donné lieu à la collecte d'EPS semblables à la cellulose (figure 1B). L'EPS séché et l'amidon soluble ont ensuite été utilisés comme sources de carbone pour les cultures de fermentation. TLC a été utilisé...
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Discussion
Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-organismes
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflits d'intérêts. Les chiffres ont été cités dans Yin et al. 11.
Remerciements
Cette étude a été financée par la National Nature Science Foundation of China (no 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (no 2018JJJ300) et le programme de construction de la discipline caractéristique appliquée à l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 et micro ; m filtres à membrane | Millipore | SLGP033RB | Utiliser pour filtrer des échantillons |
| 0,4 mm Tamis | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Utiliser pour préparer des échantillons de matières fécales humaines |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta ;-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Utiliser pour préparer une plaque couleur |
| Acetic Sigma-Aldrich | 71251 | Échantillon standard pour | |
| gélose | Solarbio | YZ-1012214 | Le composant de |
| la chambre anaérobie | Electrotek ; | AW 400SG | Culture bactérienne et fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Utilisation pour autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | Le composant du |
| milieu Four | de cuisson Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Utiliser pour chauffer et cuire l’extrait |
| bœuf | Solarbio | G8270 | Le composant du milieu |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® ; 51870&trade ; | bactéries |
| Sels biliaires | Solarbio | YZ-1071304 | Le composant du milieu |
| Butyrique | Sigma-Aldrich | 19215 | Échantillon étalon pour SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Solution saline de |
| colonne capillaire | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0,25 mm & fois ; 30 m & fois ; 0,25 &mu ; m) | Utilisé pour la détection des AGCC |
| Caséine Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | Le composant du milieu |
| Centrifugeuse | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Utilisation pour la centrifugation |
| CoSO4.7H2 | O Solarbio | C7490 | Le composant du milieu |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | Le composant du milieu |
| Cystéine-HCl | Solarbio | L1550 | Le composant du moyen |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Utiliser pour préparer la vitamine K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | Le composant du milieu |
| Acide Formique | Sigma-Aldrich | 399388 | Utilisé pour la |
| chromatographie en phase gazeuse | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Utilisé pour la détection SCFA |
| Bécher en verre | Fisher Scientific | FB10050 | Utilisé pour la préparation de boue |
| Glucose | Solarbio | G8760 | Le composant du milieu |
| Haemin | Solarbio | H8130 | Le composant du milieu |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Solution basique utilisée pour ajuster le pH des tampons |
| Isobutyrique | Sigma-Aldrich | 46935-U | Échantillon étalon pour |
| isovalériques | Sigma-Aldrich | 129542 | Échantillon étalon pour SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Solution saline de |
| KCl | moyen Solarbio | P9921 | Le composant du milieu |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Solution saline du milieu |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Utiliser pour préparer une plaque de couleur |
| Extrait de viande | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | Le composant du milieu |
| Acide métaphosphorique | Sigma-Aldrich | B7350 | Échantillon étalon pour SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | Le composant du moyen |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Solution saline du |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE | Séquençage de l’ADN |
| MnSO4. H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Solution saline de |
| moyen Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotique |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Solution saline de |
| moyen NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Solution saline de milieu |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Déterminer les concentrations d’ADN |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Solution basique utilisée pour ajuster le pH des tampons |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Utilisé pour TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | Composant du milieu |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Utilisé pour préparer les réactifs |
| d’orcinolPropionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Échantillon standard pour SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extrait d’ADN génomique bactérien |
| Poudre PBS prête à l’emploi | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Utilisé pour préparer la suspension lipidique |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Équipement anaérobie |
| Concentrateur de vide rapide | LABCONCO | CentriVap | Utilisé pour préparer les EPS |
| Amidon | Solarbio | YZ-140602 | Utilisation pour la source de carbone |
| Acide sulfurique | Sigma-Aldrich | 150692 | Utilisé pour préparer les réactifs |
| T100 PCR | BIO-RAD | Amplification | |
| PCR Feuilles d’aluminium TLC | MerckMillipore | 116835 | Utilisé pour TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | Le composant du milieu |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | Le composant du milieu |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Solution saline du milieu |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Échantillon étalon pour SCFA |
| Vitamine K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | Le composant de l’oscillateur |
| vortex | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Utilisation pour vortex |
| Extrait de levure | Sigma-Aldrich | Y1625 | Le composant du milieu |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | Le composant du milieu |
Références
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