Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Summary

Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.

Abstract

Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l'utilisation d'expériences de fermentation par lots qui permettent d'évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l'aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l'analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d'acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d'autres endobiotiques et le microbiote intestinal.

Introduction

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l'hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies¹. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l'hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision^2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel c....

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan (Hunan, Chine) et de l'Université Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chine).

1. Préparation des bactéries

1. Préparation du bouillon bifidobacterium moyen
   1. Mélanger les composants suivants dans 950 ml d'eau distillée : extrait de viande, 5 g/L; extrait de levure, 5 g/L; peptone de caséine, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K₂HPO₄, 2,04 g/L; MgSO₄7H₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Entre-4 80, 1 ml; solution de sel, 40 mL (CaCl

Results

La production d'EPS mucoid a pu être observée dans les cultures De B. longum sur les plaques PYG après incubation anaérobie pendant 72 h (figure 1A). La centrifugation des égratignures de culture, suivie des précipitations et du séchage de l'éthanol, a donné lieu à la collecte d'EPS semblables à la cellulose (figure 1B). L'EPS séché et l'amidon soluble ont ensuite été utilisés comme sources de carbone pour les cultures de fermentation. TLC a été utilisé.......

Discussion

Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal^19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-organismes

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 et micro ; m filtres à membrane	Millipore	SLGP033RB	Utiliser pour filtrer des échantillons
0,4 mm Tamis	Thermo Fischer	308080-99-1	Utiliser pour préparer des échantillons de matières fécales humaines
5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta ;-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Utiliser pour préparer une plaque couleur
	Acetic Sigma-Aldrich	71251	Échantillon standard pour
gélose	Solarbio	YZ-1012214	Le composant de
la chambre anaérobie	Electrotek  ;	AW 400SG	Culture bactérienne et fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Utilisation pour autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	Le composant du
milieu Four	de cuisson Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Utiliser pour chauffer et cuire l’extrait
bœuf	Solarbio	G8270	Le composant du milieu
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® ; 51870&trade ;	bactéries
Sels biliaires	Solarbio	YZ-1071304	Le composant du milieu
Butyrique	Sigma-Aldrich	19215	Échantillon étalon pour SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Solution saline de
colonne capillaire	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm & fois ; 30 m & fois ; 0,25 &mu ; m)	Utilisé pour la détection des AGCC
Caséine Peptone	Sigma-Aldrich	39396	Le composant du milieu
Centrifugeuse	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Utilisation pour la centrifugation
CoSO4.7H2	O Solarbio	C7490	Le composant du milieu
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	Le composant du milieu
Cystéine-HCl	Solarbio	L1550	Le composant du moyen
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7023	Utiliser pour préparer la vitamine K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	Le composant du milieu
Acide Formique	Sigma-Aldrich	399388	Utilisé pour la
chromatographie en phase gazeuse	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Utilisé pour la détection SCFA
Bécher en verre	Fisher Scientific	FB10050	Utilisé pour la préparation de boue
Glucose	Solarbio	G8760	Le composant du milieu
Haemin	Solarbio	H8130	Le composant du milieu
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Solution basique utilisée pour ajuster le pH des tampons
Isobutyrique	Sigma-Aldrich	46935-U	Échantillon étalon pour
isovalériques	Sigma-Aldrich	129542	Échantillon étalon pour SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Solution saline de
KCl	moyen Solarbio	P9921	Le composant du milieu
KH2PO4	Solarbio	P7392	Solution saline du milieu
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Utiliser pour préparer une plaque de couleur
Extrait de viande	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	Le composant du milieu
Acide métaphosphorique	Sigma-Aldrich	B7350	Échantillon étalon pour SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	Le composant du moyen
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Solution saline du
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE	Séquençage de l’ADN
MnSO4. H20	Sigma-Aldrich	M8179	Solution saline de
moyen Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotique
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Solution saline de
moyen NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Solution saline de milieu
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Déterminer les concentrations d’ADN
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Solution basique utilisée pour ajuster le pH des tampons
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Utilisé pour TLC
NiCl2	Solarbio	746460	Composant du milieu
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Utilisé pour préparer les réactifs
d’orcinolPropionic	Sigma-Aldrich	94425	Échantillon standard pour SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extrait d’ADN génomique bactérien
Poudre PBS prête à l’emploi	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Utilisé pour préparer la suspension lipidique
Resazurin	Solarbio	R8150	Équipement anaérobie
Concentrateur de vide rapide	LABCONCO	CentriVap	Utilisé pour préparer les EPS
Amidon	Solarbio	YZ-140602	Utilisation pour la source de carbone
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	150692	Utilisé pour préparer les réactifs
T100 PCR	BIO-RAD		Amplification
PCR Feuilles d’aluminium TLC	MerckMillipore	116835	Utilisé pour TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	Le composant du milieu
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	Le composant du milieu
Tween 80	Solarbio	T8360	Solution saline du milieu
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Échantillon étalon pour SCFA
Vitamine K1	Sigma-Aldrich	V3501	Le composant de l’oscillateur
vortex	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Utilisation pour vortex
Extrait de levure	Sigma-Aldrich	Y1625	Le composant du milieu
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	Le composant du milieu