Article de méthode

Évaluation des interactions protéines-protéines à l'aide d'une technique de digestion on-Membrane

DOI :

10.3791/59733

⸱

19 juillet 2019

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1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons un protocole pour une technique de digestion on-membrane pour la préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse. Cette technique facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nombreuses protéines intracellulaires interagissent physiquement en fonction de leurs circonstances intracellulaires et extracellulaires. En effet, les fonctions cellulaires dépendent en grande partie des interactions protéines intracellulaires. Par conséquent, la recherche concernant ces interactions est indispensable pour faciliter la compréhension des processus physiologiques. La co-précipitation des protéines associées, suivie de l'analyse de la spectrométrie de masse (SP), permet d'identifier de nouvelles interactions protéiques. Dans cette étude, nous avons fourni des détails de la nouvelle technique de l'analyse immunoprécipitation-chromatographie liquide (LC)-MS/MS combinée à la digestion on-membrane pour l'analyse des interactions protéines-protéines. Cette technique convient aux immunoprécipitants bruts et peut améliorer le débit des analyses protéomiques. Les protéines recombinantes marquées ont été précipitées à l'aide d'anticorps spécifiques; ensuite, les immunoprecipitants effacés sur les morceaux de membrane de difluorure de polyvinylidene ont été soumis à l'alkylation réductrice. Après la trypsinisation, les résidus de protéines digérées ont été analysés à l'aide de LC-MS/MS. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier plusieurs protéines associées candidates. Ainsi, cette méthode est pratique et utile pour la caractérisation de nouvelles interactions protéines-protéines.

Introduction

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Bien que les protéines jouent un rôle constitutif dans les organismes vivants, elles sont continuellement synthétisées, traitées et dégradées dans l'environnement intracellulaire. En outre, les protéines intracellulaires interagissent fréquemment physiquement et biochimiquement, ce qui affecte la fonction d'un ou des deux1,2,3. Par exemple, la liaison directe de l'homolog de protéine spliceosome-associé CWC22 avec le facteur d'initiation de traduction eucaryotique 4A3 (eIF4A3) est nécessaire pour l'assemblage du complexe de jonction d'exon4. Conformément à cela, un mutant eIF4A3 qui manque d'affinité pour CWC22 ne parvient pas à faciliter l'épissage de l'ARNm à jonction exon complexe-conduit4. Ainsi, l'étude des interactions protéiques est cruciale pour la compréhension précise de la régulation physiologique ainsi que des fonctions cellulaires.

Des progrès récents dans la spectrométrie de masse (SeP) ont été appliqués à l'analyse complète des interactions protéines-protéines. Par exemple, la co-précipitation de protéines endogènes ou de protéines étiquetées introduites exogènement avec leurs protéines associées, suivie s'il y a une analyse de la SP, permet d'identifier de nouvelles interactions protéiques5. Cependant, un goulot d'étranglement majeur de l'analyse de la SP/SP est la récupération médiocre des digests tryptiques des échantillons de protéines. Pour effectuer des analyses protéomiques sur les lysates cellulaires, des techniques de digestion en gel et à la membrane sont généralement utilisées pour préparer des échantillons de SP/SP. Nous avons précédemment comparé une procédure de digestion dans-gel avec une technique de digestion sur-membrane6, et a montré que ce dernier a été associé à une meilleure couverture de séquence. La membrane du difluorure de polyvinylidene (PVDF) peut convenir à cette fin parce qu'elle est mécaniquement robuste et résistante aux fortes concentrations de solvants organiques7,8, permettant la digestion enzymatique des immobilisés protéines en présence de 80% d'acétonitrile9. En outre, l'immobilisation sur une membrane peut induire des changements conformationnels dans les protéines cibles, conduisant à des améliorations de l'efficacité de la digestion tryptique10. En conséquence, dans cet article, nous avons décrit l'utilisation de l'analyse immunoprécipitation-LC/MS/MS des interactions de protéine utilisant une technique de digestion sur-membrane. Cette méthode simple facilite l'analyse pratique des interactions protéines-protéines, même dans les laboratoires non spécialisés.

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Protocole

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1. Immunoprécipitation

REMARQUE : Nous avons utilisé le tampon de lyse et d'élution de lyse de dodecyl de non-sodium (SDS), tel que décrit dans les sections suivantes. Cependant, l'utilisation d'une autre technique interne d'immunoprécipitation peut également être applicable pour la préparation d'échantillons de LC-MS/MS.

  1. Cellules cultivées transfect avec des vecteurs codant une étiquette d'épitope seule ou une protéine de fusion. Pour l'acquisition de données représentatives, transférez les cellules J774 (1 x 106) avec des vecteurs codant seuls les protéines fluorescentes vertes (GFP) ou le Capn6 (gène calpain-6) à l'aide de liposomes cationiques.
  2. Conjuguer les anticorps aux perles magnétiques.
    1. À cette fin, mélanger l'anticorps anti-GFP (2 l/réaction) avec des perles magnétiques (25 l/réaction) dans 500 l de tampon de phosphate de citrate (24,5 mM d'acide citrique, 51,7 mM de phosphate de sodium dibasic; pH 5,0) dans un tube à essai de 1,5 mL.
    2. Faire pivoter le mélange à 50 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, lavez les perles conjuguées à l'IgG trois fois avec un tampon de phosphate de citrate contenant 0,1 % de polyoxyéthylène (20) monolaurate sorbiten.
  3. Lyse les cellules transfectées à l'aide d'un tampon de lyse approprié. Pour l'acquisition de données représentatives, lysez les cellules transfectées pendant 30 min sur la glace dans un tampon de lyse de 400 l (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5 % poly (oxyethelène) éthorique d'octylphéyle) contenant 40 'mol/L le fluorure de phénylmethylsulfonyl, 50 'g/mL leupeptin, 50 'g/ mL d'aprotinin, d'orthovanadate de sodium de 200 'mol/L'et de 1 mM d'acide tétraacétique à l'éthylène glycol (EGTA) dans des tubes à essai de 1,5 mL 24 h après la transfection.
  4. Effacer le lysate en centrifuge à 15 000 x g pendant 5 min et recueillir le supernatant.
  5. Présaminer le lysate. Ajouter des perles magnétiques non étiquetées (25 l/réaction) dans un tube à essai de 1,5 ml. Laver les perles trois fois avec 500 ll de tampon de phosphate de citrate. Après l'enlèvement du tampon de phosphate de citrate dans le lavage final, ajouter le lysate de cellule au-dessus des perles magnétiques. Faire pivoter le mélange à l'aide d'un rotateur à 50 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
  6. Placez le tube à essai sur un support magnétique pendant 5 minutes pour la séparation magnétique, et collectez le lysate cellulaire. L'utilisation du support magnétique désigné par le fabricant est recommandée.
  7. Lier les protéines cibles aux perles conjuguées. Placer les perles conjuguées à l'immunoglobuline (Ig)G sur un support magnétique pendant 5 minutes pour la séparation magnétique, jeter le tampon de citrate, puis ajouter le lysate cellulaire aux perles séparées.
  8. Faire pivoter le mélange à 50 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
  9. Séparez les protéines cibles des protéines non ciblées libres. Laver les perles trois fois à l'aide de 500 l de tampon de phosphate de citrate contenant 0,1% de polyoxyéthylène (20) monolaurate sorbitane. Après le lavage final, ajouter 30 l de tampon de citrate (pH 2-3), et couver pendant 5 minutes à température ambiante pour éliper les protéines cibles.
    REMARQUE : Si le rétablissement de l'immunoprécipitation est insuffisant, l'utilisation des étiquettes alternatives d'épitope, telles que FLAG ou HIS, peut améliorer l'efficacité. Si l'efficacité de l'élution est insuffisante, l'utilisation d'autres échappés, comme une solution basée sur le SDS, peut améliorer l'efficacité.

2. Digestion on-membrane des protéines

REMARQUE : L'utilisation de matériaux et d'équipements sans protéines est nécessaire pour éviter la contamination par des protéines exogènes. En outre, il est recommandé que l'opérateur porte un masque chirurgical et des gants pour éviter la contamination par les protéines humaines.

  1. Couper les membranes PVDF en morceaux de 3 mm x 3 mm à l'aide de ciseaux chirurgicaux qui ont été essuyés avec du méthanol et séchés immédiatement avant l'utilisation.
  2. Ajouter 2 à 5 l d'éthanol sur les morceaux de membrane PVDF sur du papier d'aluminium propre.
  3. Avant de sécher complètement, ajouter l'élunement (2 à 5 l chacun, 4 à 6 pièces par échantillon) sur les membranes photovoltaïques PVDF, puis sécher à l'air les membranes jusqu'à ce que la surface de la membrane devienne mate. Les membranes séchées peuvent être stockées à 4 oC.
  4. Transférer toutes les membranes dans des tubes en plastique de 1,5 ml, ajouter 20 à 30 l d'éthanol pour rendre les membranes hydrophiles, puis retirer l'éthanol à l'aide d'une pipette.
  5. Avant que la membrane ne s'assèche complètement, ajouter 200 l de solution de réaction à base de dithiothreitol (TNT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT, et 20 % d'acétonitrile) et l'incuber à 56 oC pendant 1 h.
  6. Remplacez la solution de réaction par une solution de 300 oL d'iodoacetamide (80 mN NH4HCO3, 55 mM d'iodoacétamide et 20 % d'acetonitrile), et incubez 45 min à température ambiante dans l'obscurité.
  7. Laver les membranes deux fois avec 1 ml d'eau distillée et une fois avec 1 ml d'acétonitrile de 2% par le mélange de vortex pour 'gt;10 s.
  8. Dissoudre la trypsine lyophilisée de catégorie MS (tableaudes matériaux)directement dans la solution de réaction (30 mM NH4HCO3 contenant 70 % d'acétonitrile). Ajouter 100 l de la solution de réaction contenant 1 g de trypsine (tableaudes matériaux)(30 mM NH4HCO3 contenant 70 % d'acétonitrile) et couver à 37 oC pendant la nuit.
  9. Transférer la solution de réaction contenant les digestes tryptiques dans un tube à essai propre de 1,5 ml à l'aide d'une pipette.
  10. Ajouter 100 ll de solution de lavage (70 % d'acétonitrile/1 % d'acide trifluoracetic) à la membrane et l'incuber à 60 oC pendant 2 h. Recueillir la solution de lavage et la mélanger avec la solution de réaction. Ajouter 100 l de plus de la solution de lavage à la membrane et la sonicate pendant 10 min. Ensuite, recueillir la solution de lavage et mélanger avec la solution de réaction.
  11. Couvrir le tube à essai avec un morceau de film de laboratoire et faire quelques petits trous avec une aiguille. Séchez la solution à l'aide d'un concentrateur à vide.
  12. Dissoudre les résidus dans 10 'L de 0,2% d'acide formique. Après centrifugation (12 000 g, 3 min à température ambiante), transférer le supernatant dans un tube d'échantillon.
    REMARQUE : Les lavages sont les étapes critiques de cette section. Pendant la digestion des protéines à la membrane, le lavage des membranes contenant les protéines immobilisées après réduction et alkylation avec de l'eau distillée, suivi de 2% d'acétonitrile, pendant plus de 10 secondes chacun, est essentiel pour l'enlèvement des réactifs.

3. Analyse de l'ionisation de LC-électrospray (ESI)-MS/MS

  1. Activer un instrument ESI-MS/MS (Table of Materials) couplé à un système nano-LC HPLC ( Tableau desMatériaux). Lier une pré-colonne (Tableau des matériaux) et une colonne analytique (Tableau des matériaux).
  2. Avant l'analyse, calibrer le spectromètre de masse à l'aide de digests tryptiques de l'albumine de sérum bovin dissous en acide formique de 0,2 %, qui fournit des peptides standard.
  3. Analyser les échantillons en utilisant le mode ion positif et une plage de masse de 400 à 1 250 m/z; puis acquérir jusqu'à 10 spectres MS/MS (100 ms chacun) avec une plage de masse de 100 à 1 600 m/z et un gradient linéaire de 2 % à 80 % d'acétonitrile et 0,2 % d'acide formique pendant 80 min à un débit de 300 nL/min.
  4. Analyser les données de sortie à l'aide d'un logiciel d'identification des protéines (Tableau des matériaux) afin d'identifier les protéines associées au candidat. Pour l'identification positive d'une protéine candidate, la détection d'au moins un fragment de peptide haute fidélité est nécessaire.
  5. Omettre les protéines qui sont également précipitées dans les lysates exprimant le GFP (transfection du vecteur exprimant une étiquette GFP seule) de la liste des protéines candidates.
    REMARQUE : Si peu de protéines sont identifiées dans l'analyse de la base de données, la modification des conditions d'acquisition de la SP/SP (p. ex., le fait de changer le temps de 100 ms chacune à 50 ms chacune) peut augmenter le nombre de protéines identifiées.

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Résultats

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Au moyen de la procédure décrite ci-dessus, les immunoprécitants ont été analysés à l'aide de LC-MS/MS (figure 1). Après l'exclusion des protéines exogènes dérivées (protéines d'autres espèces et IgG), 17 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au calpain-6 (tableau 1) et 15 protéines ont été identifiées chez des immunoprecipitants associés au GFP ( Tableau 2). Parmi les protéines associées au calpa...

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Discussion

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Nous avons précédemment décrit une analyse des modifications oxydatives de l'apolipoprotéine B-100 dans la lipoprotéine de basse densité oxydée utilisant LC-MS/MS précédée d'une technique de digestion on-membrane6. Dans la présente étude, nous avons combiné cette technique avec l'immunoprécipitation et avons identifié plusieurs protéines calpain-6-associées. Cette nouvelle technique représente une méthode pratique de dépistage des protéines associées aux candidats. Calpain-6 est un membre non-prot...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue en partie par la Société japonaise pour la promotion de la science KAKENHI Grant Number 17K09869 (à AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), une subvention de recherche de Kanehara Ichiro Medical Science Foundation et une subvention de recherche de la Suzuken Memorial Foundation (tous à TM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétonitrileWako014-00386
Acide citriqueWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.chromatographie liquide haute performance à nanoflux
DiNa AIKYA Tech Co.Chromatographie liquide haute performance nanoflow équipée d’un passeur d’échantillons
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads protéine GThermo Fisher Scientific10003D
Acide formiqueWako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000.10mmID * 100mmL
IodoacétamideWako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.v. Anticorps monoclonal (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507poly(oxyéthylène) octylphényléther (n=9)
peptide standardKYA Tech Co.tBSA-04digestions tryptiques de l’albumine sérique bovine
Flacon PP KYATech Co.03100Stube d’échantillon en plastique
Cooctail inhibiteur de protéaseSigmaP8465
Logiciel ProteinPilot LogicielSciex5034057pour l’identification
des protéines Séquençage Grade Trypsinemodifiée PromegaV5111trypsine
Orthovanadate sodiqueSigmaS6508
Phosphate dibasique dihydratéSigma71643
TFAWako206-10731
colonne de piègeKYA Tech Co.A03-05-0010.5mmID * 1mmL
Système TripleTOF 5600Sciex4466015Spectromètre de masse tandem quadripolaire hybride à temps de vol
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211

Références

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Mots-clés

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