Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-Dado) et 1,n2- étheno-2 '-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.
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Article de méthode
Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’évaluation de la toxicité des substances qui sont électrophiliques, génèrent des électrophiles réactifs lors de la biotransformation, ou induisent un stress oxydatif. Parmi les nucléobases oxydées, la plus étudiée est la 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou la 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarqueur des lésions de base induites oxydativement dans l’ADN. Les aldéhydes et les époxyaldéhydes résultant du processus de peroxydation lipidique sont des molécules électrophiles capables de former des adduits d’ADN exocyclique mutagènes, tels que les adduits d’étheno 1,n2-étheno-2'-désoxyguanosine (1,n2- εdGuo) et 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-εdado), qui ont été suggérés comme biomarqueurs potentiels dans la pathophysiologie de l’inflammation. Des méthodes sélectives et sensibles pour leur quantification dans l’ADN sont nécessaires à l’élaboration de stratégies préventives pour ralentir les taux de mutation cellulaire et le développement des maladies chroniques (p. ex. cancer, maladies neurodégénératives). Parmi les méthodes sensibles disponibles pour leur détection (chromatographie liquide à haute performance couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse électrochimique ou tandem, essai de comète, immunodosages, 32P-post-étiquetage), les plus sélectifs sont ceux basés sur chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La sélectivité est un avantage essentiel lors de l’analyse d’échantillons biologiques complexes et de HPLC-ESI-MS/MS évolué comme étalon-or pour la quantification des nucléosides modifiés dans les matrices biologiques, comme l’ADN, l’urine, le plasma et la salive. L’utilisation de normes internes étiquetées isotopiquement ajoute l’avantage de corrections pour les pertes de molécules au cours de l’hydrolyse de l’ADN et des étapes d’enrichissement de l’analyte, ainsi que pour les différences de l’ionisation de l’analyte entre les échantillons. Il aide également à identifier le pic chromatographique correct lorsque plus d’un pic est présent.
Nous présentons ici des méthodes de HPLC-ESI-MS/MS validées, précises et précises, qui ont été appliquées avec succès pour la quantification du 8-oxodGuo, 1,n6-Dado et 1,n2-dguo dans le poumon, le foie et l’ADN des reins des souris A/J pour l’évaluation des effets de l’exposition aux PM2,5 ambiantes.
Introduction
Certaines espèces d’oxygène réactif (ROS) sont capables d’oxyder des liaisons doubles de carbone de bases d’ADN et de certains carbones dans la portion désoxyribose, générant des bases oxydées et des ruptures de brin d’ADN1. En tant que molécule chargée négativement riche en atomes d’azote et d’oxygène, l’ADN est aussi une cible pour les groupes électrophiles qui réagissent de façon covalente avec les sites nucléophiles (azote et oxygène), donnant des produits qui sont appelés adduits d’ADN2. Ainsi, les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’....
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Protocole
Des souris A/J mâles de quatre semaines, exemptes de pathogènes spécifiques, ont été obtenues du centre d’élevage des animaux de laboratoire de Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brésil, et ont été traitées en conséquence au Comité d’éthique de la faculté de médecine, Université de São Paulo (protocole no 1310/09).
1. ramassage des tissus de souris
- Anesthésier l’animal avec la xylazine et la kétamine. Pour une souris de 30 g de poids corporel, injecter une solution (pas plus de 2 mL) contenant 2,63 mg de kétamine et 0,38 mg de xylazine, intrapéritonéale.
- Prélever du sang (0,5-1,5 mL) pour des ana....
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Résultats
Les concentrations moyennes d’ADN (± SD) obtenues à partir du foie de souris (~ 1 g de tissu), du poumon (~ 0,2 g de tissu) et du rein (~ 0,4 g de tissu) ont été respectivement 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 et 3 223 ± 723 μg/mL dans le volume final de 200 μL. Un chromatogramme représentatif obtenu par HPLC-DAD de l’ADN purifié est illustré à la figure 3. La présence des quatre 2 '-désoxynucléosides, exempts des ribonucléosides d’ARN, qui éluute immédiatement a.......
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Discussion
Un problème majeur trouvé dans les analyses de 8-oxodguo par HPLC méthodes est l’induction possible de sa formation au cours des procédures de travail de l’extraction de l’ADN, l’hydrolyse de l’ADN, et la concentration des hydrolysats d’ADN22,38. Afin de minimiser le problème de la formation artifactuelle 8-oxodGuo, il est recommandé l’addition de la déféroxamine à toutes les solutions d’extraction, de stockage et d’hydrolyse de l’ADN, l’utilisation de la méthode.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 et 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 et 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) et CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira et A. A. F. Oliveira ont reçu des bourses de FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) et CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di mascio, P. H. N. Sa....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2'-désoxyadénosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2'-désoxyguanosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acétonitrile | Carlo Erba Réactifs | 412413000 | |
| alcalins phosphatase de la muqueuse intestinale bovine | Sigma | P5521 | |
| acétate d’ammonium | Merck | 101116 | |
| thymus de veau | Sigma | D1501 | |
| solution de lyse cellulaire | QIAGEN | 158908 | |
| chloroforme | Carlo Erba Réactifs | 412653 | |
| déféroxamine | Sigma | D9533 | |
| désoxyribonucléase I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| éthanol | Carlo Erba Réactifs | 414542 | |
| acide formique | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| Système HPLC-ESI-MS/MS | HPLC : Série Agilent 1200 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ESI-MS/MS : Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC : pompe binaire (G1312B), pompe isocratique (G1310A), four à colonne avec vanne de commutation de colonne (G1316B), détecteur à barrettes de diodes (G1315C), échantillonneur automatique (G1367C). ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ESI-MS/MS : Spectromètre de masse à piège ionique quadripolaire linéaire, modèle 4000 QTRAP. | |
| Système HPLC/DAD | Shimadzu | Deux pompes (LC-20AT), détecteur à photodiodes (DAD-20AV), auto-injecteur (Proeminence SIL-20AC), four à colonne (CTO-10AS/VP) | |
| Colonne HPLC (50 x 2,0 mm i.d., 2,5 & micro ; m, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| Colonne HPLC (150 x 2,0 mm i.d., 3.0 & micro ; m, C18) | Colonne HPLC Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| (250 x 4,6 mm i.d., 5.0 & micro ; m, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| Cartouche d’agent de sécurité HPLC C18 (4,0 x 3,0 mm d.i.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| alcool isoamylique | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| alcool isopropylique (isopropanol) | Carlo Erba Réactifs | A412790010 | |
| kétamine | Ceva | Nom commercial : Chlorure de magnésium Dopalen | |
| Carlo Erba Réactifs | 349377 | ||
| chlorure de magnésium | Sigma | M2393 | |
| méthanol | Carlo Erba Réactifs | L022909K7 | |
| phosphodiestérase I à partir de Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| solution de précipitation de protéines | QIAGEN | 158912 | |
| protéinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonucléase A | Sigma | R5000 | |
| sodium chlorure | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroxyméthyl)-aminométhane | Carlo Erba Réactifs | 489983 | |
| xylazine | Syntec do Brasil | Nom commercial : Xilazin |
Références
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
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