Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Stefan Ilic; Shira Cohen; Ariel Afek; Raluca Gordan; David  B. Lukatsky; Barak Akabayov

doi:10.3791/59737

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Article de méthode

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

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DOI :

10.3791/59737

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8 octobre 2019

Stefan Ilic¹ , Shira Cohen¹ , Ariel Afek² , Raluca Gordan² , David B. Lukatsky¹ , Barak Akabayov¹

¹Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, ²Center for Genomic and Computational Biology, Department of Biostatistics and Bioinformatics, Duke University

Dans cet article

Résumé

Les expériences de microréseau de liaison protéique (PBM) combinées à des essais biochimiques relient les propriétés de liaison et catalytiques de la primase de l'ADN, une enzyme qui synthétise les amorces d'ARN sur l'ADN modèle. Cette méthode, désignée comme profilage primase à haut débit (HTPP), peut être utilisée pour révéler les modèles de liaison de l'ADN d'une variété d'enzymes.

Résumé

La primase d'ADN synthétise les amorces courtes d'ARN qui initient la synthèse d'ADN des fragments d'Okazaki sur le brin lanel par la polymérase d'ADN pendant la réplication d'ADN. La liaison des primases procaryotes de DnaG-comme à l'ADN se produit à une séquence spécifique de reconnaissance de trinucleotide. C'est une étape charnière dans la formation des fragments d'Okazaki. Les outils biochimiques conventionnels qui sont utilisés pour déterminer la séquence de reconnaissance de l'ADN de la primase de l'ADN ne fournissent que des informations limitées. À l'aide d'un test de liaison à haut débit à base de microarray et d'analyses biochimiques consécutives, il a été démontré que 1) le contexte de liaison spécifique (séquences de liaison du site de reconnaissance) influence la force de liaison de la primase de l'ADN à son modèle L'ADN, et 2) la liaison plus forte de primase à l'ADN donne des amorces plus longues d'ARN, indiquant une plus grande processivité de l'enzyme. Cette méthode combine PBM et primase activity test et est désigné comme profilage primase à haut débit (HTPP), et il permet la caractérisation de la reconnaissance de séquence spécifique par primase de l'ADN dans un temps et une évolutivité sans précédent.

Introduction

Le HTPP utilise la technologie de microréseau de liaison de l'ADN combinée à l'analyse biochimique (Figure 1) pour identifier statistiquement les caractéristiques spécifiques des modèles d'ADN qui affectent l'activité enzymatique de la primase de l'ADN. Par conséquent, HTPP fournit une plate-forme technologique qui facilite un saut de connaissances dans le domaine. Les outils classiques utilisés pour déterminer les sites de reconnaissance primase n'ont pas la capacité de produire une quantité massive de données, alors que le PTDH le fait.

LE PBM est une technique couramment utilisée pour déterminer les préféren....