Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires

Résumé

Décrit ici est un protocole pour l'immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l'immunoglobuline G (IgG). Révéler l'apport d'IgG par les myofibres permet l'identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l'état musculaire.

Résumé

La nécrose des fibres musculaires (myonécrose) joue un rôle central dans la pathogénie de plusieurs affections musculaires, y compris les dystrophies musculaires. On s'attend à ce que les options thérapeutiques s'attaquant aux causes de la pathogénie de dystrophie musculaire soulagent la dégénérescence de muscle. Par conséquent, une méthode pour évaluer et quantifier l'étendue de la mort cellulaire dans les biopsies musculaires est nécessaire. Les méthodes conventionnelles pour observer la dégénérescence myofibre in situ sont soit mal quantitatives, soit reposent sur l'injection de colorants vitaux. Dans cet article, un protocole d'immunofluorescence est décrit qui tache les myofibers nécrotiques en ciblant l'adoption d'immunoglobuline G (IgG) par myofibers. La méthode d'utilisation d'IgG est basée sur des dispositifs cellulaires caractérisant la disparition nécrotique, y compris 1) la perte de l'intégrité de membrane de plasma avec la libération des modèles moléculaires dommages-associés et 2) l'utilisation des protéines plasmatiques. Dans les coupes murines, la co-immunoétiquetage des myofibres, des protéines de matrice extracellulaire et de la souris IgG permet d'identifier proprement et simplement les myofibres avec le destin nécrotique. Cette méthode simple convient à l'analyse quantitative et s'applique à toutes les espèces, y compris les échantillons humains, et ne nécessite pas l'injection de colorant vital. La coloration des myofibres nécrotiques par l'utilisation d'IgG peut également être jumelée à d'autres co-immunoétiquetage.

Introduction

Le muscle squelettique strié se compose principalement de fibres musculaires (myofibers), qui sont responsables de la fonction contractuelle volontaire caractéristique. Ces cellules sont des structures post-mitotiques multinuclées qui soutiennent le stress mécanique pendant la contraction. La stabilité structurale de la membrane de myofiber (sarcolemma) et de sa matrice extracellulaire sont cruciales pour l'homéostasie de tissu. Les cellules satellites constituent la population principale d'ancêtres musculaires dans le muscle squelettique mature et existent dans un état quiescent dans les muscles sains. Après la mort de myofiber, la régénération de muscle est soutenue....

Protocole

Les expériences ont été menées conformément à la législation Français et communautaire européenne (numéro de licence 11-00010).

1. Préparation de gomme de Tragacanth

1. Dans un bécher en verre, dissoudre 6 g de poudre de tragacanth dans 100 ml d'eau déionisée. Couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer au moins 3 h. Parfois, remuer manuellement à l''œil d'une spatule métallique au fur et à mesure que le mélange devient visqueux.
2. Laisser le mélange de tragacanth à 60 oC toute la nuit dans un bain d'eau ou au four. Scellez soigneusement le bécher pour éviter le séchage. Remuer au moins une fois avant de l'aliquiser.

Résultats

Les myofibres sont entourées d'une matrice extracellulaire contenant de la laminin. La coloration rouge délimite la périphérie des myofibres et permet leur identification. IgG est affiché en vert. Les noyaux sont tachés de DAPI et se trouvent en bleu sous le microscope. Cependant, les noyaux sont représentés en blanc ici (Figure 1). Une faible immunoréactivité IgG est prévue dans le compartiment extracellulaire, qui peut être augmenté en cas d'inflammation. L.......

Discussion

La nécrose de myofiber est une conséquence commune de l'exercice traumatique dans les muscles normaux. Il est bien compensé par une puissante capacité régénératrice des ancêtres musculaires locaux. Cependant, dans plusieurs conditions musculaires telles que dans les MD, la capacité régénératrice des cellules satellites est compromise par la myonécrose chronique et la fibrose excessive. Des résultats récents montrent que les fibres musculaires peuvent mourir par nécroptose, une forme réglementée de nécrose. Plus préciséme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disques circulaires en liège	Pyramid Innovation	R30001-E	N’oubliez pas d’étiqueter clairement le bouchon afin que l’ID de l’échantillon puisse être déterminé après congélation
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	La cryosection musculaire doit être effectuée entre -20 et -25° ;C. Épaisseur : 7-10 micromètres.
Dakopen	Dako	S2002	Une barrière hydrophobe autour des sections musculaires. Il empêche la dislocation du milieu pendant l’incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Anticorps anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution : 1/500
Anticorps IgG (H+L) anti-Lapin de chèvre Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution : 1/500
Sérum de chèvre	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	À l’étape de blocage, utiliser une dilution de 10 % dans du PBS. Pour l’incubation des anticorps, utiliser une dilution à 5 % dans le
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	. Doit être refroidi dans un bécher placé dans de l’azote liquide.
souris mdx	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	souris Mdx sont mutées pour le gène de la dystrophine. À partir de l’âge de trois semaines, les muscles sont caractérisés par une dégénérescence chronique
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Matrice d’enrobage
PFA (Paraformaldéhyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Utilisé pour la fixation de la cryosection (2 % ou 4 % de PFA peuvent être utilisés)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Milieu de dilution pour immunomarquage
Ciseaux de précision	FST	fst 14001-12 et fst 14001-14	Utilisé pour le prélèvement musculaire
Anticorps de lapin contre la pan-laminine de souris	Sigma Aldrich L9393		Dilution : 1/1000
Tragacanthe	Sigma Aldrich	G1128	Aliquotes à maintenir à +4° ; L

milieu de congélation PBS Les