Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

Résumé

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Résumé

Ce manuscrit décrit un test de coincubation fondé sur la culture pour détecter et caractériser les interactions concurrentielles entre deux populations bactériennes. Cette méthode utilise des plasmides stables qui permettent à chaque population d'être étiquetée différemment avec des capacités distinctes de résistance aux antibiotiques et des protéines fluorescentes pour la sélection et la discrimination visuelle de chaque population, respectivement. Ici, nous décrivons la préparation et la coincubation des souches concurrentes de Vibrio fischeri, l'imagerie par microscopie de fluorescence et l'analyse quantitative des données. Cette approche est simple, donne des résultats rapides, et peut être utilisée pour déterminer si une population tue ou inhibe la croissance d'une autre population, et si la concurrence est négociée par une molécule diffusible ou nécessite un contact direct cellule-cellule. Parce que chaque population bactérienne exprime une protéine fluorescente différente, l'épreuve permet la discrimination spatiale des populations concurrentes au sein d'une colonie mixte. Bien que les méthodes décrites soient effectuées avec la bactérie symbiotique V. fischeri en utilisant des conditions optimisées pour cette espèce, le protocole peut être adapté pour la plupart des isolats bactériens culturables.

Introduction

Ce manuscrit décrit une méthode basée sur la culture pour déterminer si deux isolats bactériens sont capables d'interactions concurrentielles. Lors de l'étude des populations mixtes, il est important d'évaluer dans quelle mesure les isolats bactériens interagissent, en particulier si les isolats sont directement en concurrence par des mécanismes d'interférence. La concurrence d'interférence se rapporte aux interactions où une population inhibe directement la croissance ou tue une population concurrente¹. Ces interactions sont importantes à identifier car elles peuvent avoir des effets profonds sur la structure et la fonction d'une communauté mi....

Protocole

1. Préparer des souches pour la coincubation

1. Choisissez une souche de référence appropriée qui servira de cible pour la compétition bactérienne pendant l'épreuve de coincubation. Voir Discussion pour les meilleures pratiques lors de la sélection d'une souche de référence et comment la souche de référence aura un impact sur les résultats. Dans ce protocole, la souche V. fischeri ES114 servira de souche de référence.
2. Déterminer quelles méthodes de sélection et de dépistage seront utilisées pour distinguer les isolats en coincubation
   1. En règle générale, transformer les souches avec des plasmides sta....

Résultats

Afin d'évaluer les interactions concurrentielles entre les populations bactériennes, un protocole d'analyse de coincubation a été développé et optimisé pour V. fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent les gènes de résistance aux antibiotiques et les protéines fluorescentes, permettant une sélection différentielle et la discrimination visuelle de chaque souche. En analysant les données recueillies à partir de l'analyse de coincubation, le résultat concurren.......

Discussion

Le résultat coincubation décrit ci-dessus fournit une méthode puissante pour découvrir la concurrence interbactérienne. Cette approche a permis d'identifier la concurrence intraspécifique entre les isolats de V. fischeri et de caractériser le mécanisme concurrentiel¹⁹. Bien que la méthode décrite ait été optimisée pour la bactérie marine V. fischeri, elle peut être facilement modifiée pour accueillir d'autres espèces bactériennes, y compris des isolats cliniques et environnementa.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Fisher	05-408-129
10 &mu ; L pipette
100 &mu ; L pipette
300 &mu ; L pipette
10 &mu ; L pipette
20 &mu ; L pipette
200 &mu ; L pipette
1 000 &mu ; L pipette
24 puits	Fisher	07-200-84	stérile avec couvercle
96 puits plaques	VWR	10062-900	stérile avec couvercle
Calculatrice
Chloramphénicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL dans l’éthanol) ; concentration finale dans le milieu (2 &mu ; g/mL LBS)
Microscope à dissection de fluorescence avec caméra et logiciel
Forceps	Fisher	08-880
Sulfate de kanamycine	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL dans l’eau, stériliser par filtre) ; concentration finale dans le milieu (1 &mu ; g/mL LBS)
Membrane de nitrocellulose (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0.22 &mu ; m membrane nitrocellulosique (pk de 100)
Plaques	de Pétri Fisher	FB0875713	stériles avec couvercle
Spectrophotomètre
Cuvettes semi-micro	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 &mu ; L système de démarrage	USA Scientific	1111-3500	10 racks
TipOne 200 &mu ; L système de démarrage	USA Scientific	1111-500	10 racks
TipOne 1000 &mu ; L starter system	USA Scientific	1111-2520	10 racks
Vortex
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M de tampon d’enrobé (62 mL HCl, 938 mL d’eau DI, 121 g de base Trizma)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Ajouter uniquement pour les plaques)
Eau			950 mL
Chlorure de sodium	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Extrait de levure	Fisher	BP9727-2	5 g

multicanauxmulticanauxmulticanauxmonocanalmonocanalmonocanalmonocanald’imagerie DI