Article de méthode

Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

DOI :

10.3791/59759

⸱

22 juillet 2019

 , 
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit un test de coincubation fondé sur la culture pour détecter et caractériser les interactions concurrentielles entre deux populations bactériennes. Cette méthode utilise des plasmides stables qui permettent à chaque population d'être étiquetée différemment avec des capacités distinctes de résistance aux antibiotiques et des protéines fluorescentes pour la sélection et la discrimination visuelle de chaque population, respectivement. Ici, nous décrivons la préparation et la coincubation des souches concurrentes de Vibrio fischeri, l'imagerie par microscopie de fluorescence et l'analyse quantitative des données. Cette approche est simple, donne des résultats rapides, et peut être utilisée pour déterminer si une population tue ou inhibe la croissance d'une autre population, et si la concurrence est négociée par une molécule diffusible ou nécessite un contact direct cellule-cellule. Parce que chaque population bactérienne exprime une protéine fluorescente différente, l'épreuve permet la discrimination spatiale des populations concurrentes au sein d'une colonie mixte. Bien que les méthodes décrites soient effectuées avec la bactérie symbiotique V. fischeri en utilisant des conditions optimisées pour cette espèce, le protocole peut être adapté pour la plupart des isolats bactériens culturables.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit une méthode basée sur la culture pour déterminer si deux isolats bactériens sont capables d'interactions concurrentielles. Lors de l'étude des populations mixtes, il est important d'évaluer dans quelle mesure les isolats bactériens interagissent, en particulier si les isolats sont directement en concurrence par des mécanismes d'interférence. La concurrence d'interférence se rapporte aux interactions où une population inhibe directement la croissance ou tue une population concurrente1. Ces interactions sont importantes à identifier car elles peuvent avoir des effets profonds sur la structure et la fonction d'une communauté microbienne2,3.

Des mécanismes de concurrence microbienne ont été découverts largement dans les génomes de bactéries provenant d'environnements divers, y compris les bactéries associées à l'hôte et les bactéries vivant librement4,5,6,7, 8,9. Diverses stratégies de concurrence ont été décrites10,11 comprenant des mécanismes diffusibles, tels que les produits chimiques bactéricides1,12 et les peptides antimicrobiens sécrétés13 , ainsi que les mécanismes dépendants du contact qui nécessitent un contact cellule-cellule pour transférer un effecteur inhibiteur dans les cellules cibles9,14,15,16,17 ,18.

Bien que les coincubations basées sur la culture soient couramment utilisées en microbiologie5,8,19, ce manuscrit décrit comment utiliser le résultat pour caractériser le mécanisme de la concurrence, ainsi que des suggestions pour adapter protocole d'utilisation avec d'autres espèces bactériennes. En outre, cette méthode décrit de multiples approches pour analyser et présenter les données pour répondre à différentes questions sur la nature des interactions concurrentielles. Bien que les techniques décrites ici aient été utilisées précédemment pour identifier le mécanisme de mise à mort interbactérienne sous-jacent à la concurrence intraspécifique entre les souches symbiotiques des bactéries coisolées de Vibrio fischeri 19,elles conviennent de nombreuses espèces bactériennes, y compris les isolats environnementaux et les agents pathogènes humains, peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes concurrentiels dépendants du contact et les mécanismes de concurrence diffusibles. Les étapes du protocole peuvent nécessiter une optimisation pour d'autres espèces bactériennes. Étant donné que plus de systèmes modèles élargissent leurs études au-delà de l'utilisation d'organismes isogéniques pour inclure différents génotypes10,16,20,21, cette méthode sera une ressource précieuse chercheurs qui cherchent à comprendre comment la concurrence a un impact sur les systèmes multi-souches ou multi-espèces.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparer des souches pour la coincubation

  1. Choisissez une souche de référence appropriée qui servira de cible pour la compétition bactérienne pendant l'épreuve de coincubation. Voir Discussion pour les meilleures pratiques lors de la sélection d'une souche de référence et comment la souche de référence aura un impact sur les résultats. Dans ce protocole, la souche V. fischeri ES114 servira de souche de référence.
  2. Déterminer quelles méthodes de sélection et de dépistage seront utilisées pour distinguer les isolats en coincubation
    1. En règle générale, transformer les souches avec des plasmides stables contenant différents gènes de résistance aux antibiotiques (p. ex. kanamycine ou chloramphenicol) pour sélectionner pour chaque souche, ainsi que des gènes codant avec différentes protéines fluorescentes (p. ex. GFP ou DP) pour un distinguer les types de souches en coculture.
      REMARQUE: L'utilisation de plasmides stables est nécessaire parce que si une souche perd le plasmide en l'absence de sélection, alors les nombres de cette souche seront sous-estimés lorsqu'ils seront quantifiés, et ne seront pas visuellement détectables à l'aide de la microscopie à fluorescence.
    2. Tag ventcubated V. fischeri souches différentiellement telle qu'une souche contient le plasmide pVSV102, qui exprime une protéine fluorescente verte (GFP) et la résistance à l'antibiotique kanamycine (KanR), et la deuxième souche contient plasmid pVSV208, qui exprime une protéine fluorescente rouge (dsRed) et une résistance à l'antibiotique chloramphenicol (CmR)22.
      REMARQUE: D'autres sélections différentielles peuvent être utilisées pour distinguer les souches de coincubating. Voir Discussion pour d'autres méthodes.
    3. Inclure le contrôle suivant lors de l'optimisation initiale de l'examen de coincubation pour s'assurer que la sélection est robuste. Plaquez chaque souche qui est marquée différemment sur des plaques d'agar contenant l'antibiotique qui devrait choisir contre elle (c.-à-d., souche de plaque 1 sur les médias qui sélectionne ntre pour la souche 2, et vice versa).
  3. Deux jours avant l'analyse de coincubation, la souche de référence pVSV102, la souche de référence pVSV208, et chaque souche concurrente pVSV208 à partir de -80 stocks de C sur des plaques d'agar LBS contenant l'antibiotique approprié (p. ex., 100 g/mL de kanamycine ou 2 g/mL chloramphenicol) et incuber pendant la nuit à 24 oC. La sélection d'antibiotiques est nécessaire pour s'assurer que toutes les cellules contiennent le plasmide au début de l'expérience.
  4. Un jour avant l'antest, cueillez et restreak quatre colonies individuelles par type de souche (répliques biologiques) sur des plaques d'agar LBS fraîches avec un antibiotique approprié et incubées pendant la nuit à 24 oC.
    REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation pour d'autres espèces bactériennes, car des temps d'incubation plus ou moins longs peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules en fonction du taux de croissance de l'organisme d'intérêt.

2. Souches bactériennes Coincubate

  1. Préparation de chaque souche bactérienne pour l'incubation (Figure 1A)
    1. À l'aide d'un cure-dent stérile, gratter les cellules de la plaque d'agar (jusqu'à la taille d'un grain de riz) et re-suspendre les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant 1 ml de bouillon LBS. Briser les amas cellulaires en les pressant sur le côté du tube et en faisant monter et descendre vigoureusement.
    2. Cap le tube et le vortex pour 1-2 s. Si les amas cellulaires sont encore visibles, continuez à vortexoutir ou pipette de haut en bas jusqu'à ce que l'échantillon soit visuellement uniforme.
    3. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.2 pour tous les échantillons.
  2. Mesurer et enregistrer la densité optique à 600 nm (OD600) pour tous les échantillons. Les échantillons devront probablement être dilués jusqu'à dix fois à l'aide du bouillon LBS pour obtenir une mesure précise de l'OD. Normaliser chaque échantillon à oD600désiré . Les souches sont généralement normalisées à un OD600 1.0, ce qui se traduit par 106 bactéries/mL pour V. fischeri.
    REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation pour différentes espèces bactériennes car la densité des cellules inoculum a un impact sur les résultats de la coincubation en fonction du mécanisme de compétition. Voir discussion pour l'optimisation.
  3. Souches de coincubating (Figure 1B, C)
    1. Mélanger la souche de référence et la souche concurrente dans un rapport de 1:1 (v/v) en ajoutant 100 ml de chaque souche (normalisée à OD 1,0) à un tube de centrifugeuse étiqueté de 1,5 ml. En tant que contrôle, mélangez la souche de référence avec une version étiquetée différentiellement de lui-même (souche de référence pVSV102 - souche de référence pVSV208). Ce contrôle est nécessaire pour une analyse statistique ultérieure afin de déterminer si la présence d'une souche concurrente a une incidence sur la croissance de la souche de référence. Vortex la culture mixte pour 1-2 s.
      REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation car le ratio de départ peut avoir un impact significatif sur les résultats et peut devoir être ajusté. Voir discussion pour l'optimisation.
    2. Répétez l'étape 2.3.1 pour chaque réplique biologique. Après avoir terminé cette étape, il devrait y avoir un total de huit tubes à souches mixtes : quatre répliques biologiques avec des souches de référence marquées de façon différentielle (contrôle) et quatre répliques biologiques avec des souches de référence et des souches concurrentes marquées différemment ( expérimental).
    3. Spot 10 ml de chaque mélange de commande et d'expérimentation sur des plaques Petri contenant de l'agar LBS; ces taches de culture seront utilisées pour la microscopie à fluorescence après l'incubation.
    4. Laisser sécher complètement les taches sur le banc jusqu'à ce que tout le liquide ait été absorbé dans l'agar et incuber les plaques De Petri à 24 oC pendant 24 h. Un minimum de 15 h est nécessaire pour que les souches de V. fischeri étiquetées avec pVSV102 et pVSV208 atteignent une densité cellulaire suffisamment élevée pour visualiser le PPF et la DP, respectivement, au niveau de la population à l'aide d'un microscope à disséquer la fluorescence. Ici, nous utilisons une incubation de 24 h pour l'imagerie des taches mixtes.
      REMARQUE: Il est important d'utiliser des assiettes qui ne sont pas trop humides ou trop sèches. Si les plaques sont trop humides, les taches de coincubation ne seront pas absorbées dans la plaque d'agar; éviter d'utiliser des plaques versées le même jour. Si les plaques sont trop sèches, de petites vagues ou des fissures peuvent se former sur la surface de l'agar, ce qui rend les taches de coincubation de forme irrégulière.
    5. En utilisant les mêmes suspensions bactériennes que dans l'étape 2.3.3, repérer 10 ml de chaque mélange de contrôle et d'expérimentation dans des plaques de 24 puits contenant 1 ml de lbs agar par puits. Comme dans l'étape 2.3.3, assurez-vous que l'agar dans les plaques de 24 puits a l'humidité appropriée. Laisser sécher complètement les taches et les incuber à 24 oC pendant 5 h. Ces taches de culture seront utilisées pour quantifier les unités de formation de colonies (UFC) pour chaque souche à la fin de l'expérience.
      REMARQUE: Repérer les suspensions bactériennes pour la croissance des puits individuels permet une résuspension plus facile au point de fin. Cette étape peut être accomplie en utilisant des morceaux de filtre stériles carrés comme une approche plus économique à l'utilisation de plaques de 24 puits. Des morceaux de filtre stériles carrés peuvent être placés sur une plaque d'agar et 10 ml de chaque mélange expérimental peuvent être repérés sur ces filtres, plutôt que sur des plaques de 24 puits. Après le temps de coincubation, les filtres peuvent être transférés dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml et la tache de coincubation peut être resuspendue par le vortex ou le tuyautrage de haut en bas. Un temps d'incubation de 5 h est suffisant pour détecter la mise à mort interbactérienne entre les isolats De V. fischeri 19,cependant, ce temps de coincubation peut devoir être plus court ou plus long pour d'autres espèces ou mécanismes concurrentiels. Voir la discussion pour plus de détails.
  4. Dilution en série pour le démarrage de l'inoculum
    1. Pour effectuer une dilution en série des mélanges de coincubation de départ, faites pivoter une plaque de 96 puits de 90 degrés afin qu'il y ait huit colonnes et douze rangées. Chaque rangée contiendra un échantillon du mélange non dilué dans la première colonne, suivi de sept dilutions en série décuplée sur les puits restants de la rangée (figure 2A).
    2. Étiquetez chaque ligne avec l'ID de contrainte, le nombre de répliques et l'heure (démarrage de l'inoculum t0). Étiqueter les plaques d'agar LBS complétées par l'antibiotique approprié sur lequel repérer la série de dilution. Assurez-vous d'identifier la souche pour laquelle chaque plaque antibiotique est sélectionnée.
    3. À l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 180 ml de bouillon LBS à chaque puits, en laissant la première colonne vide pour le mélange de coincubation non dilué.
      REMARQUE: Les chercheurs peuvent choisir d'utiliser la saline tamponnée par phosphate (PBS) pour resuspendre les taches de coincubation et effectuer une dilution en série si vous travaillez avec une espèce bactérienne à croissance particulièrement rapide ou si elle effectue constamment de grandes expériences où des dilutions en série peuvent prendre longtemps à effectuer. L'utilisation de PBS dans ces cas empêchera la prolifération significative des bactéries pendant le processus d'exécution des dilutions sérielles. Cependant, il est important d'être cohérent avec la solution utilisée (p. ex., PBS ou LBS) dans toutes les expériences, quelle que soit leur taille ou leur durée.
    4. À l'aide d'une pipette à canal unique de 200 ml, transférer 100 ml du mélange de coincubation du tube au puits de la première colonne. Jeter la pointe et répéter pour tous les mélanges de coincubation.
    5. À l'aide d'une pipette multicanal, transférer 20 ml de la colonne 1 à 2 et mélanger en pipetting de haut en bas. Jetez les pointes et répétez pour chaque colonne de sorte qu'à la fin, chaque ligne contient une dilution sériedée décuplée du mélange initial de coincubation.
      REMARQUE: Soyez cohérent avec le nombre de fois que les dilutions sont pipetted de haut en bas. Par exemple, appuyez cinq fois sur la poignée de pipette pour que chaque dilution soit cohérente dans toute la série de dilution.
    6. À l'aide d'une pipette multicanal munie de huit pointes, aspirez 5 ml de chaque puits dans une série de dilution (c.-à-d. une rangée de huit puits) et repérez-la sur la plaque d'agar LBS qui sélectionne la souche de référence (complétée par de la kanamycine). Répétez cette étape de repérage sur la plaque en sélectionnant pour la souche concurrente (complétée par du chloramphenicol) (Figure 2B). Laisser sécher complètement les taches avant de les placer dans l'incubateur.
      REMARQUE: Les mêmes pointes peuvent être utilisées pour repérer une série de dilution de repli sur les plaques de sélection pour la souche de référence et concurrente, mais doivent être modifiées entre les répliques. Évitez de toucher l'extrémité de la pointe de pipette aux plaques d'agar LBS car cela peut créer une dépression qui peut ressembler à une colonie bactérienne et fausser les résultats pendant le comptage des plaques. Si la pointe touche la plaque, prenez une note et n'incluez pas la dépression dans le nombre de colonies.
  5. Prendre des mesures finales T
    1. Une fois que les taches de coincubation dans les plaques de 24 puits ont été incubées pendant 5 h à 24 oC, ajouter 1 ml de bouillon LBS à chaque puits et resuspendre les taches de coincubation en faisant monter et descendre jusqu'à ce que toutes les cellules soient remises en suspension. Soyez compatible avec la vigueur dans laquelle les cellules sont suspendues à travers toutes les répliques. Par exemple, appuyez huit fois sur la poignée de pipette pour resuspendre complètement chaque échantillon.
    2. Une fois que chaque tache de coincubation est suspendue, préparer une plaque de 96 puits pour une dilution sérielle et des plaques d'agar LBS avec les antibiotiques appropriés sur lesquels repérer la dilution de la même manière que l'étape 2.4.1.
    3. Effectuer des étapes 2.4.2-2.4.6 pour compléter la dilution en série pour les mesures finales T.
      REMARQUE: Un contrôle important devrait être inclus lors de l'optimisation initiale de l'évaluation de la coincubation. À la fin de la période de coincubation, plaquez les souches mélangées sur les médias qui comprend les deux antibiotiques. Ni l'une ni l'autre souche ne devrait pouvoir se développer à moins que 1) une mutation spontanée se produise, ou 2) marqueurs sélectionnables soient échangés entre les souches.

3. Visualiser coincubations à l'aide de la microscopie à fluorescence

  1. Imagez chaque tache de coincubation sur les plaques de Petri d'agar LBS des étapes 2.3.3 et 2.3.4 à l'aide d'un microscope stéréo équipé pour la détection de fluorescence verte et rouge, qui correspond aux protéines de fluorescence exprimées sur les plasmides stables.
  2. Commencez par prendre des images du spot de coincubation témoin (souche de référence pVSV102 et souche de référence pVSV208).
    1. Ajuster le grossissement de sorte que l'endroit est au point.
    2. En utilisant la lumière d'excitation et le filtre appropriés pour observer le GFP, ajustez le temps d'exposition de sorte que seule la fluorescence de la tache de coincubation est détectable et toute fluorescence de fond du milieu est faible ou non visible.
    3. Modifier la lumière d'excitation et le filtre pour observer la DP, en ajustant le temps d'exposition pour minimiser l'arrière-plan du milieu.
  3. Pour chaque tache de coincubation des traitements expérimentaux, image de la souche de référence à l'aide du filtre GFP et temps d'exposition déterminé à l'étape 3.2.2.
  4. Imagez la souche concurrente à l'aide du filtre de la DP, en ajustant le temps d'exposition de sorte que la fluorescence ne soit observée qu'à partir de la tache de coincubation et la fluorescence de fond du milieu est minime. Enregistrez les deux images et nommez-les pour inclure les deux ID de contrainte, le numéro de répétition, le temps d'incubation lorsque l'image a été prise (par exemple, 24 h). Répétez l'opération pour toutes les répliques.
    REMARQUE: Le temps de coincubation peut devoir être ajusté pour différentes plasmides ou espèces bactériennes. Voir discussion pour l'optimisation.

4. Analyse des données

  1. Calcul des UFC pour chaque traitement de contrôle et d'expérimentation à chaque point temporel (t start et T final)
    1. Une fois que les colonies sont visibles sur des plaques de dilution en série (p. ex., 24 h à 24 oC pour V. fischeri), identifiez le facteur de dilution où les colonies individuelles peuvent être comptées et n'ont pas grandi ensemble en grands groupes multi-colonies (figure 2B). Pour chaque réplique, comptez et enregistrez le nombre de colonies individuelles pour une dilution donnée. Ce nombre représente les UFC pour cette réplique.
    2. Convertir les UFC pour la dilution en UFC totale pour chaque souche de la coincubation en utilisant la formule ci-dessous :
      [ CfUs (facteur de dilution x vol. de la tache de dilution)] x vol. de l'échantillon non dilué - Total des UFC
      Exemple : T0 : [(6 UFC) (10 à 6 x 0,005 ml)] x [0,01 ml] - 1,2E7 Total des UFC de la souche 1 dans la tache mixte au début de l'expérience
      T5 : [(4 UFC) (10 à 3 x 0,005 mL)] x [1,0 ml] - 8,0E5 Total des UFC de la souche 1 dans la tache mixte après 5 h de coincubation
      Les valeurs cFU pour chaque souche à chaque moment sont les données brutes qui peuvent être utilisées pour plusieurs analyses et tests statistiques différents (voir la section 4.2 ci-dessous).
  2. Effectuer les transformations de données suivantes pour déterminer si une souche concurrente surpasse la souche de référence en : (i) en déterminant si la proportion de la souche de référence diminue en présence de la souche concurrente, ou (ii) en calculant le l'indice relatif de la concurrence (RCI). Ces analyses convertissent les données brutes en ratios et peuvent être utiles pour déterminer le résultat concurrentiel d'une interaction, mais ne peuvent pas déterminer le mécanisme de la concurrence (c.-à-d. tuer vs inhibition de la croissance).
    1. Calcul de la proportion de chaque souche pour chaque point de temps pendant la coincubation
      1. Convertir les données de l'UFC à la proportion de chaque souche dans un traitement. Pour la souche de référence (RS) à T0, diviser le total des UFC pour la souche de référence à T0 par la somme du total des UFC pour la souche de référence et le concurrent (CS) à T0 :
        RST0 CfUs (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Proportion de souche de référence à T0.
        Effectuez le même calcul pour déterminer la proportion de la souche concurrente à T0 :
        CST0 CUS (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Proportion de souche de référence à T0
        Répétez ce processus pour chaque point de temps et reproduisez-le pour le traitement expérimental et le traitement témoin (coincubation de souche de référence marquée de façon différentielle).
      2. Graphiquez la proportion moyenne de chaque type de souche à T0 et T5 dans un graphique à barres empilés (figure 3A).
      3. Assurez-vous que le rapport de départ souhaité des souches a été obtenu. Pour les coincubations où les souches ont été initialement mélangées 1:1, chaque type de souche devrait comprendre 0,5 de la population à T0 et ne devrait pas être statistiquement différent les uns des autres en utilisant un test de t-test de l'étudiant (P -gt; 0,05). Si la proportion d'une souche est significativement plus grande que celle de l'autre souche à T0, alors répétez l'expérience jusqu'à ce qu'un rapport de départ de 1:1 soit atteint.
      4. Déterminer si la souche concurrente représente une proportion significativement plus importante de la population après 5 h. Effectuer un test de dépistage d'un étudiant en comparant la proportion de chaque souche dans le traitement expérimental à T0 et T5. Si la proportion de souche concurrente est significativement différente de celle de la souche de référence à T5 (P et 0,05), ce résultat suggère que la concurrence de souche peut avoir eu lieu. Passez à l'étape 4.2.1.5.
      5. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a réduit la proportion de la souche de référence après 5 h, effectuez le test t de l'étudiant en comparant la proportion de la souche de référence dans le contrôle avec la proportion de la souche de référence dans le traitement expérimental (souche de référence v souche concurrente).
        REMARQUE : Si la proportion de la souche de référence est statistiquement plus faible dans le traitement expérimental par rapport au contrôle (P -lt; 0,05), la souche concurrente a considérablement réduit la proportion de la souche de référence après 5 h et surpassés la souche de référence.
    2. Calcul de la valeur RCI journal pour chaque traitement (y compris le contrôle)
      REMARQUE: L'indice concurrentiel relatif, ou RCI, est une valeur unique qui compare la façon dont le rapport de fin des types de souches diffère du ratio de départ. La valeur RCI est transformée en rondins de telle sorte qu'une valeur RCI de journal supérieure à zéro indique que la souche concurrente (CS) a surpassé la souche de référence (RS), une valeur RCI de journal inférieure à zéro indique que la souche de référence a surpassé la souche concurrente, et un journal RCI valeur de zéro indique qu'aucune des deux souches n'a été surencoutée.
      1. Calculez les valeurs RCI journal pour chaque traitement de contrôle et expérimental en utilisant l'équation suivante:
        Log [(CST5 CFU - RST5 CFUs) (CST0 CFU - RST0 CFUs)] - journal RCI
      2. Graphique des valeurs RCI à l'aide d'une boîte séparée et de moustaches tracer où les données sont graphiques dans la direction horizontale (Figure 3B).
      3. Déterminer si chaque traitement était significativement différent de zéro en effectuant le test t d'un élève comparant les valeurs RCI journal de chaque traitement (y compris le contrôle) à un ensemble de données comparant le même nombre de répliques toutes avec une valeur nulle. Si les valeurs RCI journal pour le traitement expérimental sont statistiquement supérieures à zéro (P lt; 0,05), alors la souche concurrente a surpassé la souche de référence.
        REMARQUE: Le contrôle ne doit pas être statistiquement différent de zéro (P 'gt; 0.05), parce que les souches de référence marqués différemment sont isogéniques.
      4. Effectuez le test t d'un étudiant pour déterminer si les valeurs RCI journal pour le traitement expérimental étaient significativement plus grandes que le contrôle (P lt; 0,05). Si les valeurs RCI journal du traitement expérimental sont statistiquement plus grandes que le traitement de contrôle, alors la souche concurrente a surpassés la souche de référence.
  3. Effectuer l'analyse statistique suivante pour déterminer le mécanisme par lequel la souche concurrente surpasse la souche de référence : (i) analyser les données brutes totales de l'UFC, ou (ii) examiner la récupération en pourcentage de la souche de référence. Ces analyses peuvent être plus lourdes à voir par rapport à celles de l'étape 4.2, mais détermineront si la souche concurrente surpasse la souche de référence en la surpassant, en inhibant la croissance de la souche de référence ou en éliminant activement la souche de référence.
    1. Analyse des données brutes totales de l'UFC
      1. Graphiquez les données brutes totales de l'UFC pour les deux souches à l'aide d'une parcelle de diffusion entrelacée, où les répliques sont affichées sous forme de points de données individuels (Figure 4A). Affichez les données sur une échelle de journal et ajoutez une ligne horizontale indiquant les UFC T0 moyens pour les deux souches.
      2. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence, effectuez le test t de référence d'un étudiant comparant les UCF de souche de référence pour les traitements de contrôle et d'expérimentation à T5. Si les UFC de la souche de référence dans le traitement expérimental sont statistiquement inférieurs à ceux du contrôle (Pet lt; 0,05), la présence de la souche concurrente a eu une incidence importante sur la souche de référence.
      3. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a inhibé la croissance ou éliminé la souche de référence, effectuez le test t d'un étudiant en comparant la souche de référence DESFc à T0 et T5 pour les traitements de contrôle et d'expérimentation.
        REMARQUE: En l'absence d'un concurrent, la souche de référence devrait montrer une augmentation significative de cFU en comparant T0 et T5 pour le traitement de contrôle. Lors de l'analyse du traitement expérimental, si la souche de référence CFUs à T5 ne sont pas statistiquement différents par rapport à T0 (P 'gt; 0,05), puis la souche concurrente inhibé la croissance de la souche de référence. Si la souche de référence T5 CFUs est significativement inférieure à t0 CFUs (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a tué la souche de référence.
    2. Calcul de la récupération en pourcentage de la souche de référence
      1. Transformez les données totales de l'UFC pour la souche de référence (RS) en données de récupération en pourcentage à l'aide de l'équation ci-dessous :
      2. (RST5 CFUs - RST0 CFUs) x 100 % de récupération de la souche de référence
      3. Afficher le pourcentage de récupération de la souche de référence à l'aide d'un graphique à barres séparé où chaque barre représente soit le traitement de contrôle, soit le traitement expérimental (figure 4B). Ajouter une ligne pointillée à 100 euros pour indiquer une récupération de 100 % de la souche de référence (pas d'augmentation ou de diminution des UFC de la souche de référence de 0 h à 5 h).
      4. Pour déterminer si la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence, effectuez le test t d'un étudiant comparant le rétablissement de la souche de référence pour le traitement témoin au traitement expérimental. Si la récupération en pourcentage est significativement inférieure à la commande (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence.
      5. Pour déterminer si la souche concurrente a inhibé la croissance de la souche de référence ou en a éliminé, effectuez le test t d'un étudiant comparant la récupération de la souche de référence pour le traitement expérimental et un ensemble de données avec le même nombre de répliques valeur de 100.
        REMARQUE: Si le traitement expérimental n'est pas statistiquement différent de 100 (P 'gt; 0.05), alors la souche concurrente a inhibé la croissance de la souche de référence. Si la récupération de la souche de référence pour cent dans le traitement expérimental est significativement inférieure à 100 (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a tué la souche de référence.
    3. Interprétation des images de microscopie à fluorescence
      1. Une fois que les images de microscopie de fluorescence sont prises, déterminez si chaque souche est visiblement détectable dans le point de coincubation. Pour la coincubation de contrôle (souche de référence pVSV102 - souche de référence pVSV208), le GFP et la DP doivent être visibles à partir d'un point de coincubation. Si ce n'est pas le cas, configurez à nouveau l'expérience en veillant à ce que les souches soient correctement étiquetées et inventées sur des plaques exemptes d'antibiotiques.
      2. Pour chaque point de coincubation expérimental, vérifiez les résultats possibles.
        REMARQUE: Si la souche concurrente est visible, mais que la souche de référence n'est pas détectée, cela suggère que la souche concurrente a tué ou inhibé la croissance de la souche de référence. Si les deux souches sont présentes et uniformément mélangées (GFP et DP présents dans tout le spot de coincubation), ces données suggèrent que la souche concurrente n'est pas en concurrence avec la souche de référence et que les deux souches coexistent. Si les deux souches sont présentes mais sont séparées spatialement (des microcolonies de PPF ou de DP sont présentes tout au long du spot de coincubation), cela suggère que la souche de référence et la souche concurrente peuvent s'engager dans des interactions concurrentielles et des modifications à la souche de référence ou le rapport initial de coincubation peuvent être nécessaires. Voir la discussion pour plus de détails.

5. Déterminer si l'interaction dépend du contact

REMARQUE: Si vous constatez qu'une souche tue ou inhibe la souche de référence, l'interaction peut être diffusable ou dépendante du contact. Pour déterminer si l'interaction dépend du contact cellule-cellule, effectuez un récarquille de coincubation comme décrit ci-dessus pour les étapes 1-2 avec les modifications suivantes.

  1. Effectuer des étapes 1.1-2.2.
  2. Une fois les souches normalisées, les souches séparées physiquement à l'aide d'un filtre à nitrocellulose d'une taille de 0,22 mm pore. Cette taille de pores permet la diffusion d'antimicrobiens et de petites molécules, mais empêche le contact physique entre les cellules de V. fischeri.
    REMARQUE: Si l'interaction dépend du contact cellule-cellule, la séparation de la souche de référence de la souche concurrente avec le filtre devrait abroger le phénotype de mise à mort ou inhibiteur et la souche de référence n'aurait pas dû réduire les UFC. Si l'interaction n'est pas dépendante du contact cellule-cellule, et est un mécanisme diffusible, la séparation des souches ne devrait pas empêcher la souche concurrente de tuer la souche de référence.
    1. Spot 5 mL de la souche de référence sur le centre d'un filtre et repérer 5 ml de la souche concurrente sur le centre d'un filtre différent. Placez le filtre contenant la souche de référence sur la surface d'une plaque d'agar LBS. Placez le filtre contenant la souche concurrente directement sur le dessus du filtre avec la souche de référence.
      REMARQUE: Chaque souche est repérée sur des filtres plutôt que la souche inférieure repérée directement sur la plaque d'agar afin que les souches peuvent être plus facilement placées directement les unes sur les autres.
    2. S'il est inquiétant que les souches ne sont pas empilées directement les unes sur les autres, diminuer le volume d'inoculum souche de référence repéré sur le filtre. Cela permettra de s'assurer que la zone de la tache de contrainte de référence est plus petite et entièrement au-dessus ou sous la souche concurrente. Alterner quelle souche est sur le dessus et sur le fond pour tenir compte des différences dans la diffusion des nutriments du milieu de l'agar.
    3. Pour s'assurer que le filtre permet la diffusion de petites molécules, inclure un traitement de contrôle où la souche de référence est repérée sur un filtre et un antibiotique qu'il est sensible à (chloramphenicol) est repéré sur l'autre. Empilez les filtres directement les uns sur les autres et placez-les sur une plaque d'agar LBS. L'antibiotique doit pouvoir se diffuser à travers le filtre et doit tuer la souche de référence.
  3. Incuber les plaques avec des filtres à 24 oC pendant 5 h. Ne pas inverser la plaque d'agar lors de l'incubation pour éviter de déplacer les filtres.
  4. Effectuer des dilutions en série pour l'inoculum de départ selon l'étape 2.4.
  5. Prendre des mesures finales T
    1. À l'aide d'une pince stérile, transférer chaque ensemble de filtres dans un tube Falcon de 50 ml contenant 5 ml de bouillon LBS. Assurez-vous que les filtres sont physiquement séparés dans le tube pour permettre une résuspension complète de chaque type de souche.
    2. Resuspendre les souches des filtres en faisant monter et descendre jusqu'à ce que les filtres soient dégagés de toutes les cellules. Utilisez une pince à épiler pour faire pivoter les filtres et effacer le matériel cellulaire des deux côtés. Stériliser les pinces à éthanol entre les échantillons.
    3. Effectuer la dilution en série pour la finale T selon l'étape 2.5. Lors du calcul du total des UFC pour la finale T, ajustez le « volume total de l'échantillon non dilué » de 1 ml à 5 ml.

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Résultats

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Afin d'évaluer les interactions concurrentielles entre les populations bactériennes, un protocole d'analyse de coincubation a été développé et optimisé pour V. fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent les gènes de résistance aux antibiotiques et les protéines fluorescentes, permettant une sélection différentielle et la discrimination visuelle de chaque souche. En analysant les données recueillies à partir de l'analyse de coincubation, le résultat concurren...

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Discussion

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Le résultat coincubation décrit ci-dessus fournit une méthode puissante pour découvrir la concurrence interbactérienne. Cette approche a permis d'identifier la concurrence intraspécifique entre les isolats de V. fischeri et de caractériser le mécanisme concurrentiel19. Bien que la méthode décrite ait été optimisée pour la bactérie marine V. fischeri, elle peut être facilement modifiée pour accueillir d'autres espèces bactériennes, y compris des isolats cliniques et environnementa...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier les évaluateurs pour leurs commentaires utiles. A.N.S. a reçu le soutien de la Fondation Gordon et Betty Moore par l'entremise de Grant GBMF 255.03 à la Life Sciences Research Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mLFisher05-408-129
10 &mu ; L pipette
100 &mu ; L pipette
300 &mu ; L pipette
10 &mu ; L pipette
20 &mu ; L pipette
200 &mu ; L pipette
1 000 &mu ; L pipette
24 puitsFisher07-200-84stérile avec couvercle
96 puits plaquesVWR10062-900stérile avec couvercle
Calculatrice
ChloramphénicolSigmaC0378stock (20 mg/mL dans l’éthanol) ; concentration finale dans le milieu (2 &mu ; g/mL LBS)
Microscope à dissection de fluorescence avec caméra et logiciel
ForcepsFisher08-880
Sulfate de kanamycineFisherBP906-5stock (100 mg/mL dans l’eau, stériliser par filtre) ; concentration finale dans le milieu (1 &mu ; g/mL LBS)
Membrane de nitrocellulose (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 &mu ; m membrane nitrocellulosique (pk de 100)
Plaquesde Pétri FisherFB0875713stériles avec couvercle
Spectrophotomètre
Cuvettes semi-microVWR97000-586
TipOne 0.1-10 &mu ; L système de démarrageUSA Scientific1111-350010 racks
TipOne 200 &mu ; L système de démarrageUSA Scientific1111-50010 racks
TipOne 1000 &mu ; L starter systemUSA Scientific1111-252010 racks
Vortex
NameCompanyNuméro de catalogueComments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5)50 mL 1 M de tampon d’enrobé (62 mL HCl, 938 mL d’eau DI, 121 g de base Trizma)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Ajouter uniquement pour les plaques)
Eau950 mL
Chlorure de sodiumFisherS640-320 g
TryptoneFisherBP9726510 g
Extrait de levureFisherBP9727-25 g
multicanauxmulticanauxmulticanauxmonocanalmonocanalmonocanalmonocanald’imagerie DI

Références

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Mots-clés

Vibrio fischeriCoincubation AssayFluorescent ProteinsAntibiotic ResistanceFluorescence MicroscopySerial DilutionColony Forming UnitsCompetitive InteractionsBacterial StrainsLBS Broth

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