Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

Résumé

Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.

Résumé

En plus des ARM linéaires, de nombreux gènes eucaryotes génèrent des ARN circulaires. La plupart des ARN circulaires sont générés en rejoignant un site d’épissage 5' avec un site d’épissage en amont 3' dans un pré-mRNA, un processus appelé back-splicing. Cette circularisation est probablement facilitée par des structures secondaires dans le pré-mRNA qui amènent les sites d’épissage à proximité. Dans les gènes humains, les éléments Alu sont pensés pour promouvoir ces structures secondaires d’ARN, car les éléments d’Alu sont abondants et présentent des complémentarités de base les unes avec les autres lorsqu’ils sont présents dans des directions opposées dans l’ARN pré-m. Ici, nous décrivons la génération et l’analyse de grand élément Alu contenant des gènes de reporter qui forment des ARN circulaires. Grâce à l’optimisation des protocoles de clonage, des gènes reporter avec jusqu’à 20 kb de longueur d’insertion peuvent être générés. Leur analyse dans les expériences de co-transfection permet d’identifier les facteurs réglementaires. Ainsi, cette méthode peut identifier les séquences d’ARN et les composants cellulaires impliqués dans la formation circulaire d’ARN.

Introduction

Arn circulaires
Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN échoués isolés fermés covalentement qui sont exprimés dans la plupart des organismes. Ils sont générés en rejoignant un site d’épissage en aval 5' à un site d’épissage en amont 3', un processus appelé back-splicing (Figure 1A)¹. Les séquences de l’ARNM pré-mRNA qui présentent une base complémentaire aussi courte que 30-40 nt apportent des sites d’attelle arrière dans un alignement approprié pour la formation d’ARN². Chez l’homme, les éléments Alu ¹, représentant e....

Protocole

1. Conception des constructions

1. Utilisez le navigateur²⁴ du génome de l’UCSC pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire d’ARN et les incorporer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs.
2. Coller la séquence circulaire d’ARN(figure supplémentaire 1 est une séquence d’essai) en https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start et sélectionnez le bon organisme. Soumettez la séquence et rendez-vous sur la vue du navig....

Résultats

Les gènes de reporter permettent la détermination des facteurs réglementaires qui influencent la formation circulaire d’ARN. Cependant, ces gènes de reporter sont grands et contiennent des éléments répétitifs qui rendent souvent les constructions d’ADN instables. En raison de leur grande taille, il est souvent nécessaire de supprimer des parties des introns, qui est atteint en amplifiant les pièces génomiques contenant les exons et les parties introniques flanquantes plus petites. Ces morceaux d’ADN sont assemblés enzyma.......

Discussion

En général, les ARN circulaires sont faibles abondants¹, ce qui complique l’étude de leur fonction et de leur formation. Semblable aux ARN linéaires¹³, l’utilisation de minigènes reporter permet l’identification des cis et des facteurs trans-acteurs qui régulent la formation d’ARN circulaires. Ainsi, cette approche génère des hypothèses qui peuvent être testées plus en utilisant les gènes endogènes.

L’étape la plus critique est la conception du g.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(PEI) Chlorhydrate	Polysciences	24765-1
Outil de construction	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.	Clare Chemical Research
Kit d’assemblage d’ADN enzymatique	NEB	E2621S
Kit de nettoyage sur gel et PCR	Promega	A9282
Glyco Blue	Thermo Fisher	AM9516
pcDNA3.1 site de clonage	Site de polyclonage		https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymérase 1	NEB	M0491L	Q5 ADN polymérase
Polymérase 2	Biorad	1725310	Polymérase à longue portée (NEB), iproof (BioRad)
Polymérase 2	Qiagen	206402	Qiagen kit polymérase longue portée
Transcriptase inverse	Thermo Fisher	18080044
kit d’isolement d’ARN	Life Technologies	12183025	Ambion by Life Technologies
RNAse R	Lucigen	RNR07250	Epicenter/Lucigen
Cellules compétentes stables	NEB	C3040H	Cellules stables NEB
Bactéries clonantes standard	NEB	C2988J	NEB5-alpha outil
Web compétent pour la conception d’amorces	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Calculs de température basés sur le Web	NEB		https://tmcalculator.neb.com/#!/main