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Article de méthode

Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

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DOI :

10.3791/59800

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31 août 2019

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1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Résumé

La culture neuronale primaire est une technique essentielle dans le domaine des neurosciences. Pour obtenir des connaissances mécanistes plus approfondies dans le cerveau, il est essentiel d'avoir un modèle in vitro robuste qui peut être exploité pour diverses études de neurobiologie. Bien que les cultures neuronales primaires (c.-à-d., les cultures hippocampales à long terme) aient fourni aux scientifiques des modèles, il ne représente pas encore complètement la complexité du réseau cérébral. Dans le sillage de ces limitations, un nouveau modèle a émergé en utilisant des neurosphères, qui ressemble plus étroitement au tissu cérébral. Le protocole actuel décrit le placage des densités élevées et basses des neurones corticaux et hippocampal mélangés isolés de l'embryon des rats embryonnaires de jour 14-16 de Sprague Dawley. Cela permet la génération de neurosphères et la culture neuronale primaire à long terme comme deux plates-formes indépendantes pour mener d'autres études. Ce processus est extrêmement simple et rentable, car il minimise plusieurs étapes et réactifs précédemment jugés essentiels pour la culture neuronale. Il s'agit d'un protocole robuste avec des exigences minimales qui peuvent être effectuées avec des résultats réalisables et encore utilisé pour une diversité d'études liées aux neurosciences.

Introduction

Le cerveau est un circuit complexe de cellules neuronales et non neuronales. Pendant des années, les scientifiques ont essayé d'obtenir un aperçu de cette machinerie complexe. Pour ce faire, les neuroscientifiques ont d'abord eu recours à diverses lignées cellulaires à base de nerfs transformées pour des enquêtes. Cependant, l'incapacité de ces lignées cellulaires clonales à former de fortes connexions synaptiques et des axones ou dendrites appropriés ont déplacé l'intérêt scientifique vers les cultures neuronales primaires1,2. L'aspect le plus excitant de la culture neuronale primaire est qu'il crée une occasion d'observer et de manipuler les neurones vivants3. En outre, il est moins complexe par rapport au tissu neural, ce qui en fait un candidat idéal pour étudier la fonction et le transport de diverses protéines neuronales. Récemment, plusieurs développements dans les domaines de la microscopie, de la génomique et de la protéomique ont généré de nouvelles opportunités pour les neuroscientifiques d'exploiter les cultures neuronales4.

Les cultures primaires ont permis aux neuroscientifiques d'explorer les mécanismes moléculaires derrière le développement neuronal, d'analyser diverses voies de signalisation neuronale et de développer une compréhension plus cohérente de la synapse. Bien qu'un certain nombre de méthodes aient rapporté des cultures des neurones primaires (principalement de l'origine hippocampique5,6,7), un protocole unifié avec un milieu chimiquement défini qui permet la culture à long terme des neurones est encore nécessaire. Cependant, les neurones plaqués à une faible densité sont le plus souvent observés, qui ne survivent pas à long terme, probablement en raison du manque de soutien trophique8 qui est fourni par les neurones adjacents et les cellules gliales. Certaines méthodes ont même suggéré la co-culture des neurones primaires avec des cellules gliales, dans laquelle les cellules gliales sont utilisées comme couche d'alimentation9. Cependant, les cellules gliales posent beaucoup de problèmes en raison de leur surcroissance, qui l'emportent parfois sur la croissance neuronale10. Par conséquent, compte tenu des problèmes ci-dessus, un protocole de culture neuronale primaire plus simple et plus rentable est nécessaire, qui peut être utilisé par les neurobiologistes et les neurochimistes pour les enquêtes.

Une culture neuronale primaire est essentiellement une forme de culture 2D et ne représente pas la plasticité, l'intégrité spatiale ou l'hétérogénéité du cerveau. Cela a donné lieu à la nécessité d'un modèle 3D plus crédible appelé neurosphères11,12. Les neurosphères présentent une nouvelle plate-forme aux neuroscientifiques, avec une ressemblance plus étroite avec le cerveau réel, in vivo13. Les neurosphères sont des grappes 3D non adhérentes de cellules riches en cellules souches neurales (NSC), en cellules progénitrices neurales (NPC), neurones et astrocytes. Ils sont une excellente source pour l'isolement des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales, qui peuvent être utilisées pour étudier la différenciation en diverses lignées neuronales et non neuronales. Encore une fois, la variabilité au sein des cultures de neurosphère produite à l'aide des protocoles précédemment rapportés présente un obstacle à la formulation d'un protocole unifié de culture de neurosphère14.

Ce manuscrit présente un protocole dans lequel il est possible de générer des plates-formes 2D et 3D en alternant les densités de placage cellulaire à partir d'une culture corticale et hippocampal mixte. On observe que dans un délai de 7 jours, des neurosphères flottantes sont obtenues à partir de neurones plaqués à haute densité isolés de l'embryon de rat E14-E16 Sprague Dawley, qui, sur une autre culture, forment des ponts et des interconnexions par des extensions gliales radiaux. De même, dans les neurones plaqués de faible densité, une culture neuronale primaire qui peut être maintenue jusqu'à 30 jours est obtenue en changeant le milieu d'entretien deux fois par semaine.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique animale institutionnelle du CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1. Réagent et préparation des médias

  1. Solution de poly-d-lysine (PDL) : préparer des solutions PDL à des concentrations de 0,1 mg/mL dans de l'eau déionisée et stocker à 4 oC jusqu'à utilisation.
  2. Moyen de dissociation : À 1 L d'eau déionisée stérile et filtrée, combinez les composants suivants dans les concentrations respectives : chlorure de sodium (8 mg/ml), chlorure de potassium (0,4 mg/ml), phosphate de potassium monobasic (0,06 mg/ml), D-glucose (1 mg/ml), dibasic de phosphate de sodium (0.479 mg/mL), et 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide; 10 mM]. Vortex tous les composants pour faciliter le mélange approprié et stocker dans 4 oC jusqu'à l'utilisation.
    REMARQUE : Utilisez le milieu de dissociation sous forme de glace froide pendant la dissociation, mais à température ambiante (RT) pour le lavage et à d'autres fins.
  3. Milieu de placage : milieu de placage se compose du milieu essentiel minimum (MEM) Eagle avec la solution de sel équilibré d'Earle (BSS ; 88,4%), D-glucose (0,6%), le sérum de cheval (10%), et la pénicilline/streptomycine (1%). Combinez les composants dans les ratios respectifs et effectuez la procédure à l'intérieur d'une hotte dans des conditions stériles.
    REMARQUE : Utilisez toujours un milieu de placage fraîchement préparé pour éviter la dégradation de tout composant.
  4. Milieu d'entretien : préparer le milieu d'entretien en combinant ce qui suit dans les ratios respectifs : milieu neurobasal (97 %), 0,5 mM échantillon de glutamine obtenu commercialement, supplément sans sérum B27 (2 %) et pénicilline/streptomycine (1 %). Combinez les composants dans les ratios respectifs et effectuez la procédure à l'intérieur d'une hotte dans des conditions stériles. Assurez-vous que tous les composants sont fraîchement préparés.

2. Préparation des couvertures

  1. Prenez un couvercle en verre rond de 12 mm de diamètre et trempez-le dans 1 M d'acide chlorhydrique (HCl) pendant 4 h.
  2. Transférer les couvercles dans de l'eau distillée à l'aide d'une paire de forceps et les faire tourbillonner doucement pour se débarrasser complètement de l'acide.
  3. Transférer les feuilles de couverture lavées pour un tour supplémentaire de nettoyage dans un bécher contenant 100% d'éthanol.
  4. Avant d'utiliser les feuilles de couverture, séchez-les bien dans le capot laminaire en les gardant sur du papier de soie.

3. Préparation des plaques enduites de poly-D-lysine pour la culture de neurone

  1. Prenez deux plaques de 24 puits : l'une pour le placage à haute densité et l'autre pour le placage de faible densité. Ouvrez les paquets stériles uniquement à l'intérieur du capot laminaire.
  2. Transférer les 12 mm de couvercles en verre stériles dans les 24 plaques de puits.
  3. Verser 300 oL de solution PDL (0,1 mg/mL dans de l'eau déionisée) dans chaque puits afin qu'il recouvre entièrement la surface des couvercles.
  4. Envelopper les assiettes de papier d'aluminium pour éviter le séchage et les garder dans l'incubateur CO2 pendant la nuit.
  5. Le lendemain (avant le placage), aspirez la solution PDL et lavez-les correctement avec 300 ll d'eau déionisée stérile deux à trois fois.
  6. Ajouter 200 l de milieu de placage fraîchement préparé et remettre les assiettes dans l'incubateur jusqu'à ce qu'elles placage.

4. Enlèvement et décapitation du fœtus

REMARQUE : Stérilisez tous les instruments chirurgicaux emballés dans du papier d'aluminium dans un autoclave à 121 oC (15 psi) pendant 30 min. Cela comprend une paire de ciseaux émoussés, forceps, forceps fines, deux ciseaux fins, et un forceps d'artère pour l'ensemble de la procédure.

  1. Pour générer des neurones et des neurosphères, utilisez un rat Sprague Dawley, enceinte chronométrée, et marquez la journée avec la détection vaginale des prises en tant qu'E0.
    REMARQUE : La culture doit être réalisée entre l'E14-E16.
  2. Le jour de la culture, placez une assiette de Petri en verre stérile sur la glace et remplissez-la de la solution de sel équilibrée (HBSS) froide de Hank.
  3. Anesthésiez un rat enceinte E14-E16 avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de 90 mg de kétamine/kg de poids corporel et de 10 mg de xylazine/kg, puis sacrifice en effectuant une luxation cervicale.
    REMARQUE : Les rats peuvent également être euthanasiés par une surdose de pentobarbital ou une surdose de kétamine avec de la xylazine ou du diazépam.
  4. Stérilisez l'abdomen du barrage en pulvérisant 70 % d'éthanol et faites une coupe en forme de V dans la région abdominale à l'aide de forceps stériles et d'une paire de ciseaux émoussés.
  5. Prenez soigneusement les sacs embryonnaires sur la plaque Petri avec la solution HBSS froide.
    REMARQUE: N'utilisez pas les mêmes forceps et ciseaux qui ont été juste utilisés pour la peau, car cela va contaminer les organes internes. Utilisez un ensemble différent de ciseaux/forceps pour les organes internes.
  6. Sortir les embryons des sacs embryonnaires dans le HBSS frais et froid.
  7. Décapiter la tête avec des ciseaux stériles.

5. Enlèvement du cerveau et dissection du cortex avec hippocampe

  1. Avant de commencer, remplissez les plats petri stériles de 90 mm de HBSS froid et stérile.
  2. Transférer les têtes dans les plats stériles à l'aide de forceps de pansement stériles et émoussés.
  3. Sous le stéréomicroscope, tenez la tête de la région du museau avec des forceps stériles et dentelés et enlevez le cerveau en coupant la peau et le crâne ouverts.
  4. Recueillir tous les cerveaux d'embryons de la même manière dans la solution HBSS.
  5. Enlever toutes les méninges des hémisphères et du cerveau moyen en tenant le tronc cérébral.
  6. Enlevez soigneusement les hémisphères intacts ressemblant à des chapeaux de champignon qui contiennent l'hippocampe et le cortex.
  7. Recueillir les hémisphères contenant le cortex et l'hippocampe intact dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de milieu de dissociation.

6. Dissociation du tissu cortical et hippocampal en neurones simples

  1. Laissez les tissus recueillis s'installer et aspirer le milieu de dissociation, laissant 5%-10% du milieu en elle.
  2. Ajouter 10 ml de milieu de dissociation fraîche au tissu, et répéter l'étape 6.1 deux fois.
  3. Ajouter 4,5 mL de moyen de dissociation et 0,5 ml de 0,25% (1x) trypsin edTA (tétraacée de diamine d'éthylène).
  4. Maintenir le tissu dans l'incubateur à 37 oC pendant 20 min pour que la digestion se poursuive.
  5. Aspirer le milieu et ajouter 10 ml de dissociation et de placage consécutif aux tissus digérés.
  6. Laisser les tissus digérés s'installer et aspirer le milieu de dissociation. Ajouter 2,5 ml de milieu de placage et verser dans la base d'un plat stérile de 90 mm.
  7. Trituratez les tissus digérés dans la base d'angle du plat à l'aide d'une pointe de pipette de 1 000 l pour occuper le volume minimal.
  8. Passez la suspension cellulaire obtenue à travers la passoire cellulaire de 70 m, à l'exclusion de tout morceau de tissu.
  9. Déterminez la densité des cellules viables à l'aide de la méthode d'exclusion du colorant bleu trypan et comptez le nombre de cellules dans un compteur cellulaire automatisé.
    1. Pour la méthode d'exclusion de colorant bleu trypan, prendre 10 l de la suspension cellulaire et 10 l de 0,4% de tache bleu trypan, mélanger soigneusement, et ajouter 10 L du mélange dans l'une des deux chambres fermées des glissières de chambre jetables.
    2. Insérez la diapositive contenant le mélange dans le compteur cellulaire et obtenez la lecture.
      REMARQUE : La méthode d'exclusion de colorant bleu trypan est basée sur le principe que les cellules vivantes (en raison de leurs membranes intactes) excluront le colorant bleu trypan et montreront donc un cytoplasme clair, comparé à une cellule non viable qui prendra facilement le bleu de trypan et apparaîtra bleu dans couleur15.
  10. Diluer le nombre de cellules obtenues pour plaquer 1,5 x 105 cellules/mL pour une densité élevée et 20 000 cellules/mL pour une faible densité dans deux tubes distincts contenant 30 ml chacun du milieu de placage.
  11. Aspirez le milieu de placage précédemment ajouté de chaque puits et de la plaque 500 l de cellules dispersées dans le milieu de placage dans chaque puits.
  12. Après cela, retour des plaques à l'incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 4 h.
  13. Examiner les cellules pour l'adhérence sous le microscope 4 h après le placage.
  14. S'il y a une bonne adhérence des cellules dans les deux plaques, remplacez le milieu de chaque puits par 500 l de milieu d'entretien frais et incubez à 37 oC.
  15. Culture ces neurones cultivés à faible densité pendant 30 jours en changeant le milieu d'entretien 2x par semaine.
  16. Culture les neurosphères obtenues à partir des neurones plaqués à haute densité dans le même milieu d'entretien en les transférant aux plaques d'attachement ultra-faibles.
  17. Caractériser les neurones et les neurosphères en les immunostaining avec des marqueurs importants. Pour l'immunocytochimie, fixer d'abord les cellules/neurosphères en utilisant 4% de formaldéhyde pendant 30 min sur la plaque elle-même, puis perméabiliser les cellules avec 0,1% de détergent non ionique pendant 10 min.
  18. Ajouter des anticorps primaires pour les neurones (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) et les neurosphères (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) dans la saline tamponnée en phosphate (PBS) à 1:300 concentrations et incuber pendant la nuit à 4 oC16.
    REMARQUE : Le Tuj1 (classe III - tubulin) et le tau sont des marqueurs positifs pour les neurones primaires, tandis que le GFAP (protéine acide fibrillaire glial) et l'O4 (marqueur d'oligodendrocyte) sont des marqueurs négatifs pour les neurones primaires17,18. Dans le cas des neurosphères, Tuj1, GFAP et Nestin servent tous de marqueurs positifs19,20.
  19. Le lendemain, lavez les cellules avec du PBS une ou deux fois et ajoutez des anticorps secondaires appropriés dans le PBS à 1:600 concentrations à RT pendant 2 h.
    REMARQUE : Les anticorps secondaires anti-souris ou anti-Lapin sont sélectionnés en fonction de l'espèce hôte de l'anticorps primaire ajouté. Il faut garder à l'esprit que les anticorps secondaires doivent être conjugués à des dérivés de fluorescence adaptés à la microscopie de fluorescence.
  20. Laver les cellules à nouveau avec PBS une ou deux fois.
    1. Effectuer la coloration nucléaire des cellules avec Hoechst 33258 (1 mg/mL solution de stock dans l'eau déionisée). Préparer 0,1% de solution Hoechst dans PBS à partir de la solution stock et l'ajouter aux cellules.
    2. Incuber les cellules avec une solution Hoechst de 0,1 % pendant 30 min, puis laver à nouveau avec du PBS.
  21. Ajouter 20 L PBS (ou milieu de montage) sur la glissière et monter lentement la glissière contenant les cellules tachées sur la zone de la diapositive contenant du PBS. Scellez les marges de la couverture avec du polystyrène xylène dibutylphthalate (DPX).
  22. Effectuer l'imagerie des cellules fixes au microscope à 10x et 40x grossissement.

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Résultats

Dans ce protocole, une stratégie simple a été élucidée dans laquelle des densités variables de placage cellulaire de deux plates-formes différentes de criblage neural sont obtenues. Figure 1A,B illustre l'adhérence des cellules après 4 h de placage des neurones dans les cellules plaquées à haute et faible densité, respectivement. En observant la bonne adhérence des neurones comme indiqué à la figure 1, le milieu ...

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Discussion

Ce protocole décrit comment en modifiant les densités de placage cellulaire des neurones primaires, deux plates-formes neuronales variables sont obtenues. Bien qu'il s'agisse d'une méthode simple, chaque étape doit être méticuleusement effectuée pour obtenir les résultats souhaités. D'autres méthodes précédentes ont rapporté des cultures primaires à long terme de neurone ou des cultures de neurosphère. La plupart des protocoles de culture neuronale primaire ont impliqué la culture des neurones hippocampiques pendant 3-5 ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions l'installation animale du CSIR-IICB. G. D. remercie ICMR, J. K. et V. G. remercient DST Inspire, et D. M. remercie DBT, India pour leurs bourses. S. G. reconnaît avec bienveillance serb (EMR/2015/002230) inde pour fournir un soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-GFAPAbcamAB7260
Anti-NestinAbcamAB92391
Anti-O4MilliporeMAB345
Anti-TauAbcamAB76128
Anti-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 Supplément Sans Sérum  ;Gibco17504-044
Compteur de cellulesLife technologiesCountess II FL
Incubateur de CO2EppendorfGalaxy 170 R
D-glucose  ;SDFCL38450-K05
ÉthanolMerck Millipore100983
Microscope à fluorescenceOlympusIX83 Modèle
FormaldéhydeSigma Aldrich47608
GlutaMax-I SupplémentGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Sérum pour chevaux  ;HiMediaRM10674
Acide chlorhydriqueRankemH0100
Capot laminaireBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle' s avec Earle' s BSS  ;Sigma AldrichM-2279
MicroscopeDewinterVictory Modèle
Neurobasal Medium  ;Gibco21103-049
Vaisselle en plastique (plaque à 24 puits, crépines à cellules et plaques à faible adhérence)BD Falcon353047, 352350 et 3471
90 mm PétridosesHimediaPW001
Pénicilline/Streptomycine  ;Gibco15140-122
Poly-D-LysineMilliporeA.003.E
Chlorure de potassium  ;Fisher ScientificBP366-500
Phosphate de potassium monobasiqueMerckMI6M562401
Chlorure de sodium  ;Qualigem15918
Phosphate de sodium dibasiqueMerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar Modèle
Triton-X 100SRL2020130
Trypan Blue SolutionGibco15250-061
0,25 % Trypsine-EDTAGibco25200-072

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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