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Article de méthode

Purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans

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DOI :

10.3791/59804

⸱

14 septembre 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

Dans cet article

Résumé

Décrit ici est une méthode simple pour la purification d'un produit génique dans Streptococcus mutans. Cette technique peut être avantageuse dans la purification des protéines, en particulier les protéines membranaires et les protéines de masse moléculaire élevée, et peut être utilisée avec diverses autres espèces bactériennes.

Résumé

L'élucidation de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches et souches de type sauvage dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. La perte de fonction à la suite d'une perturbation génétique est ensuite rétablie par l'ajout exogène du produit du gène perturbé. Cela aide à déterminer la fonction du gène. Une méthode précédemment décrite consiste à générer une souche de Streptococcus mutans perturbée par le gène gtfC. Ici, une méthode peu exigeante est décrite pour purifier le produit de gène de gtfC de la souche nouvellement produite de S. mutans suivant la perturbation de gène. Il s'agit de l'ajout d'une séquence de codage de polyhistidine à l'extrémité 3 du gène d'intérêt, ce qui permet une simple purification du produit génique à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée. Aucune réaction enzymatique autre que PCR n'est requise pour la modification génétique de cette méthode. La restauration du produit génique par ajout exogène après la rupture des gènes est une méthode efficace pour déterminer la fonction génique, qui peut également être adaptée à différentes espèces.

Introduction

L'analyse de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches de type sauvage aux souches dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. Une fois que la souche perturbée par le gène est produite, l'ajout exogène du produit génique permet une restauration fonctionnelle.

La méthode la plus courante pour obtenir les produits géniques purifiés requis pour les essais de restauration ultérieures est en effectuant l'expression hétérologue dans Escherichia coli1. Cependant, l'expression des protéines membranaires ou des protéines de masse moléculaire élevée est souvent difficile à l'aide de ce système1. Dans ces cas, la protéine cible est habituellement isolée des cellules qui synthétisent la protéine par une série complexe d'étapes, qui peuvent mener à la perte du produit génique. Pour surmonter ces problèmes, une procédure simple a été développée pour la purification des produits géniques à la suite d'une méthode de perturbation génétique2, pcR à base de méthode d'épissage de l'ADN3 (désigné en deux étapes de fusion PCR), et l'électroporation pour la génétique transformation dans Streptococcus mutans. L'ajout d'une étiquette de polyhistidine (His-tag) au c-terminus du produit génique facilite sa purification par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).

Pour isoler la souche His-tag-expressing, l'ADN génomique entier du gène d'intérêt (dans cette souche son-étiquette-exprimant gène-perturbé) est remplacé par un gène de marqueur antibiorésistant. La procédure pour générer la souche His-tag-exprimant est presque identique à celle pour générer une souche gène-perturbée comme décrit précédemment4,5. Par conséquent, les méthodes de perturbation génétique et d'isolement des produits géniques devraient être effectuées en série d'expériences pour l'analyse fonctionnelle.

Dans le présent travail, une séquence de codage de polyhistidine est attachée à l'extrémité 3 du gène gtfC (GenBank locus tag SMU 1005), codant la glucosyltransferase-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Ensuite, des études d'expression chez une espèce streptococcique ont été réalisées. Il est difficile d'atteindre l'expression hétérologue de la gtfC par E. coli, probablement en raison de la masse moléculaire élevée de GTF-SI. Cette souche est nommée S. mutans His-gtfC. Une illustration schématique représentant l'organisation de la cassette de gène de résistance à la gtfC et à la spectinomycine (spcr)7 loci dans le type sauvage S. mutans (S. mutans WT) et ses dérivés est montrée dans Figure 1. Le GTF-SI est une protéine sécrétrice qui contribue au développement du biofilm dentaire cariogénique6. Sous la présence du saccharose, un biofilm adhérent est observé sur une surface de verre lisse dans la souche WT S. mutans, mais pas dans la souche S. mutans gtfC-perturbée (S. mutans 'gtfC)2,5 . La formation de biofilms est restaurée dans S. mutans -gtfC après l'ajout exogène du GTF-SI recombinant. La souche, S. mutans His-gtfC, est ensuite utilisé pour produire le GTF-SI recombinant.

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Protocole

REMARQUE: Génération de S. mutans gtfC, dans lequel toute la région de codage du gène gtfC est remplacée par spcr, doit être complétée avant d'effectuer ces protocoles. Consultez l'article publié pour plus de détails sur la génération5.

1. Conception d'apprêt

  1. Préparer les amorces pour la construction de S. mutans His-gtfC.
    REMARQUE: Les séquences d'amorce utilisées dans ce protocole sont indiquées dans le tableau 1. La méthode PCR de fusion en deux étapes pour la génération de S. mutans His-gtfC est schématiquement illustrée dans la figure 2.
    1. Amorces de conception(gtfC-reverse et spcr-forward)pour l'attachement de sa séquence de codage de tag, intervenant entre le gène gtfC et spcr (Figure 2A).
      1. Inclure le lien GS et la séquence de codage His-tag dans les deux amorces gtfC-reverse et spcr-avant,dans lesquelles 24 bases aux régions de 5' sont complémentaires les unes aux autres.
        REMARQUE : La séquence d'acides aminés du lien GS et de son étiquette (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His) est attachée au terminus C de GTF-SI par la traduction de gènes.
      2. Concevoir une amorce gtfC-avantpour cibler le gène gtfC dans le génome de S. mutans WT en aval du gène et l'amorce spcr-reversepour cibler la région de flanc en aval de spcr dans le S. mutans -gtfC. Définir la température de fonte8 (Tm) du gtfC-avant et spcr-inverse amorces pour correspondre avec les températures de fonte de la gtfC-inverse et spcr- amorces avant, respectivement.
    2. Concevoir des amorces non-parisées (nichées vers l'avant et inversées) pour le deuxième PCR (Figure 2B).
    3. Amorces de conception(gtfC-avant et colonie-revers) spécifiques pour l'ADN génomique du transformateur (figure 2C; les amorces sont utilisées pour la colonie PCR).
      REMARQUE: Les amplicons chevauchent la frontière entre gtfC et spcr. L'amorce avant gtfCpeut être appliquée comme amorce avant.
    4. Amorces de conception (vers l'avant et vers le bas) pour la confirmation finale de la génération de S. mutans His-gtfC (Figure 2C; le produit PCR amplifié par les amorces est utilisé pour le séquençage de l'ADN).

2. Extraction d'ADN génomique de S. mutans

REMARQUE: Chaque souche de S. mutans doit être cultivée dans le milieu d'infusion cardiaque du cerveau (BHI) à 37 oC dans des conditions anaérobies. Les souches mutantes de S. mutans et S. mutans His-gtfC sont cultivées en BHI complétées par une spectinomycine de 100 g/mL.

  1. Streak S. mutans WT et S. mutans -gtfC séparément sur chacune des plaques d'agar BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
  2. Choisissez des colonies simples de S. mutans WT ou S. mutans -gtfC à l'aide d'un cure-dent stérilisé et inoculez-vous dans 1,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
    REMARQUE: Les colonies peuvent être utilisées comme source d'ADN modèle pour le premier PCR (étape 3.1).
  3. Transférer 1 ml de chaque culture bactérienne dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugelant la culture pendant 1 min à 15 000 x g.
  4. Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml du tampon Tris-EDTA (pH 8,0) pour suspendre à nouveau le granule cellulaire.
  5. Centrifugeuse suspension pendant 1 min à 15 000 x g. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 oL de tampon Tris-EDTA (pH 8,0).
  6. Chauffer la suspension à l'aide d'un incubateur de blocs pendant 5 min à 95 oC. Centrifugeuse suspension pendant 5 min à 15 000 x g.
  7. Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml (le supernatant servira d'ADN modèle pour le premier PCR).

3. Amplification DE PCR

REMARQUE: Le tableau 1, le tableau 2et le tableau 3 résument respectivement les amorces, les réactifs et les cycles d'amplification du PCR.

  1. Effectuez le premier PCR en utilisant le génome S. mutans WT et S. mutans gtfC comme modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles qui hébergent spcr à l'aide des amorces décrites à l'étape 1.1.1.2 (Figure 2A).
  2. Électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Accises les fragments d'ADN souhaités d'environ 1 000 pb et 2 000 pb. Purifiez les fragments des gels à l'aide de la méthode d'extraction de gel à base de membrane de silice.
    REMARQUE: Les procédures de base pour PCR9, l'électrophorèse de gel d'ADN10,et la purificationd'ADN 11 sont détaillées ailleurs.
  3. Effectuez un deuxième PCR à l'aide des produits du premier PCR (environ équimolar) comme modèles PCR avec les amorces non remue-avant et nichées -inversées (figure 2B).
  4. Électrophorese un dixième du mélange PCR sur le gel d'agarose. Confirmer la génération de l'amplicon approprié d'environ 3 000 pb.
  5. Précipitez le produit PCR restant.
    REMARQUE :     La purification du produit PCR n'est pas nécessaire, car les amplicons non spécifiques générés par le deuxième PCR n'interfèrent pas avec la recombinaison homologue.
    1. Ajouter de l'eau sans nauséabonde au mélange DE PCR et porter le volume total à 100 l, suivi de 0,1 volume (10 l) d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et de 2,5 volumes (250 l) d'éthanol absolu. Mélanger et conserver le mélange pendant 10 min à température ambiante (RT).
    2. Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Ajouter 1 ml d'éthanol à 70 % pour laver le granule d'ADN.
    3. Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Séchez et dissez la pastille d'ADN avec 10 l l d'eau exempte de nucléane.

4. Transformation cellulaire

  1. Préparer compétent S. mutans WT pour introduire le deuxième produit PCR en suivant les étapes décrites dans la publication précédente5. Conserver les cellules à -80 oC.
    REMARQUE: Pour cette expérience, les cellules WT compétentes de S. mutanont déjà été conservées en -80 oC pour générer S. mutans etgtfC.
  2. Mélanger 5 'L du deuxième produit PCR concentré à l'aliquot de 50 L de cellules compétentes glacées congelées précédemment. Ajouter le mélange dans des cuvettes d'électroporation. Donner une seule impulsion électrique (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 F) aux cellules à l'aide de l'appareil d'électroporation.
  3. Resuspendre les cellules dans 500 'L de bouillon BHI. Immédiatement, étalez 10 à 100 l de la suspension sur des plaques d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les assiettes pendant 2 à 6 jours à 37 oC jusqu'à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées.

5. Vérification de larecombinaison et du stockage de Genome

  1. Effectuer la PCR de la colonie, à l'aide d'amorces gtfC-avant et de colonie-inversées pour dépister la recombinaison. Électrophorese chaque produit PCR de colonie sur un gel d'agarose. Confirmer le fragment d'ADN d'environ 1 500 pb.
  2. Choisissez l'une des colonies positives à l'aide d'un cure-dent stérilisé et la sous-culture des cellules pendant la nuit dans 2 ml de bouillon BHI contenant de la spectinomycine.
  3. Mélanger 0,8 ml de culture bactérienne avec 0,8 ml de glycérol stérile à 50 % et stocker à -80 oC ou -20 oC.
  4. Transférer les 1 ml restants de suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Répétez les étapes 2.3-2.7 pour extraire l'ADN génomique des cellules.
  5. Effectuez PCR en utilisant les amorces vers l'avant et vers le bas et l'ADN génomique comme modèle. Répétez l'étape 3.2 pour purifier le produit d'ADN amplifié des gels.
  6. Déterminer la séquence d'ADN de l'amplicon purifié par séquençage de l'ADN.
    REMARQUE: Assurez-vous de confirmer la génération de S. mutans Son-gtfC par séquençage de l'ADN.

6. Purification du GTF-SI étiqueté polyhistidine

  1. Streak S. mute sa gtfC sur une plaque d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber pendant la nuit à 37 oC.
  2. Ramassez une seule colonie à l'aide d'un cure-dent stérilisé et de cellules de sous-culture dans 3 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
  3. Préparer deux flacons coniques avec 1 L de bouillon BHI sans spectinomycine. Inoculer 1 ml de la suspension de culture de nuit dans 1 L du bouillon BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
  4. Concentrer les protéines du supernatant de culture par la précipitation de sulfate d'ammonium.
    REMARQUE :     Extraire des corps cellulaires si une protéine cible est intracellulaire. Les procédures de base pour les précipitations de sulfate d'ammonium sont détaillées ailleurs12.
    1. Centrifugelant la suspension de culture bactérienne pendant 20 min à 10 000 x g à 4 oC. Récupérer le supernatant de culture dans un bécher en verre de 3 L.
    2. Ajouter 1 122 g de sulfate d'ammonium à 2 L du supernatant (80% de saturation) avec un remuant vigoureux à l'aide d'un agitateur magnétique. Laisser le précipité se former pendant 4 h ou plus à 4 oC en remuant.
      REMARQUE : La formation précipitée peut se poursuivre pendant la nuit.
    3. Centrifugeuse solution précipitée par le sulfate d'ammonium à 15 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Decant le supernatant.
    4. Recueillir le précipité à l'une spatule et le transférer dans un bécher en verre de 200 ml. Resuspendre les granulés en 35 ml de tampon de liaison (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).
    5. Dialyser la suspension contre 2 500 ml du tampon de liaison à l'aide d'un tube de dialyse de cellulose régénéré, à 4 oC, en remuant. Remplacer la solution de dialyse après 2 h et poursuivre la dialyse toute la nuit.
    6. Remplacez à nouveau la solution de dialyse. Continuer à dialyser pendant 2 h supplémentaires.
  5. Centrifuger la suspension dialysée à 20 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre à membrane à l'aide d'un équipement de filtration par aspiration. Transférer le filtrate dans un flacon de 75 cm2.
  6. Fractionner le GTF-SI étiqueté polyhistidine de la suspension filtérée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
    1. Transférer 2 ml de boue de résine IMAC chargée par Ni (environ 1 ml de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est montée sur un tube de silicone. Retirez la solution de stockage par le flux de gravité.
      MISE EN GARDE: Ne laissez pas la résine sécher dans l'ensemble de l'IMAC.
    2. Ajouter 3 ml d'eau distillée dans la colonne pour laver la résine. Ajouter 5 ml du tampon de liaison pour réquiliber la résine.
    3. Arrêtez le flux avec une bite Hoffmann pincement. Ajouter 5 ml de la suspension filtrée de l'étape 6.5 pour faire la boue.
    4. Ajouter toute la boue à la suspension filtrée restante. Faire tourbillonner doucement le mélange pendant 30 min à 4 oC.
    5. Chargez le mélange sur la colonne. Retirez la suspension par le flux de gravité. Laver la résine IMAC avec 20 ml de tampon de liaison.
      REMARQUE: Ajustez le débit à environ 2 ml/min avec un coq Hoffmann pincement tout au long de l'IMAC suivant.
    6. Elute le GTF-SI recombinant avec 20 mL de tampon d'élution (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8,0).
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. L'éluate doit être stockée à 4 oC. La résine IMAC peut être réutilisée. Consultez les instructions pour la résine IMAC.
  7. Remplacez le tampon d'élution par le tampon de stockage (tampon de phosphate de 50 mM, pH 6,5) et concentrez la solution RecombinantGTF-SI à environ 1 ml à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge. Entreposez la solution GTF-SI recombinante à 4 oC.
    REMARQUE: Confirmer la purification GTF-SI étiquetée polyhistidine à l'aide de SDS-PAGE13 et de l'ouest de l'ouest en utilisant un anticorps monoclonal anti-polyhistidine conjugué au raifort. Ajout de CHAPS (concentration finale, 0,1 %) à l'éluence peut être nécessaire pour éviter l'adsorption non spécifique à l'unité, selon la protéine cible.

7. Restauration fonctionnelle par Recombinant GTF-SI

  1. Stries chaque souche S. mutansur une plaque d'agar BHI individuellement. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 oC.
  2. À l'aide d'un cure-dent stérilisé, prendre une seule colonie pour inoculer 2 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.
  3. Utilisez 20 l de la culture de la nuit de S. mutans etgtfC pour inoculer 2 ml de bouillon DE BHI contenant 1 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube à essai en verre. Ajoutez le GTF-SI ou un volume équivalent du véhicule à la culture S. mutans etgtfC, et cultureles les cellules avec le tube placé en position inclinée pendant la nuit.
    REMARQUE: Stérilisez la solution GTF-SI à l'aide d'un filtre à seringues stériles et déterminez la concentration en protéines à l'aide d'un test de protéines d'acide bicinchoninique15 avant utilisation.
  4. Agiter les suspensions de culture avec un mélangeur de vortex pour 10 s. Décant les suspensions. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée.
  5. Tainer les biofilms sur la paroi du tube avec 1 ml de 0,25% Coomassie bleu brillant (CBB).
  6. Décant la solution de coloration après 1 min. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée. Séchez à l'air les tubes à essai.

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Résultats

La figure 3 montre la taille de chaque amplicon du premier PCR (Figure 3A) et du deuxième PCR (Figure 3B). La taille de chaque amplicon correspondait à la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 4A montre des colonies de S. mutans transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d'agar BHI contenant de la ...

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Discussion

La conception des amorces est l'étape la plus critique du protocole. Les séquences des amorces gtfC-reverse et spcr-avantont été automatiquement déterminées en fonction des séquences de la région d'extrémité de 3 degrés de gtfC et de la région de fin de 5 degrés de spcr. Chaque amorce comprend 24 bases complémentaires qui codent un lien GS et une séquence de codage His-tag dans leurs régions de 5'. La perturbation des séquences réglementaires indigènes situées dan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (numéros de subvention 16K15860 et 19K10471 à T. M., 17K12032 à M. I., et 18K09926 à N. H.) et la SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numéro de subvention 2018.09.10 No 1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02Pour électrophorèse sur gel d’agarose
Anaeropack MitsubishiGas ChemicalA-03Système de culture anaérobie
Anticorps monoclonal anti-His-TagMBLD291-7conjuguées HRP
Thermo Fisher Scientific23227Mesure de la concentration
en protéinesBouillon d’infusion cerveau-cœurBecton, Dickinson237500Milieu de culture bactérienne
CBB R-250Wako031-17922Pour la coloration du biofilm
Unité d’ultrafiltration centrifugeSartoriusVS2032Remplacement du tampon et concentration des protéines
CentrifugeuseKubota7780II
Colonne chromatographiqueBio-Rad7321010Pour IMAC
Pince à membrane de dialysebrand21-153-100
Tube de dialyseAs One2-316-06
ADN polyméraseTakaraR045ASéquençage de l’ADN ADN polymérase haute fidélité
Eurofins Genomics
Substrat ECL Bio-Rad170-5060Pour western blot
EDTA (0,5 M pH 8,0)Wako311-90075Tris-EDTA Préparation du tampon
Cuvette d’électroporationBio-Rad16520860,2 cm d’écart
ÉlectroporateurBio-Rad1652100
Solution d’EtBrNippon Gene315-90051Pour électrophorèse sur gel d’agarose
Coupe-bande de gelNippon GeneticsFG-830
Gel kit d’extractionNippon GeneticsFG-91202Extraction d’ADN à partir de gel d’agarose
ImagerGE Healthcare29083461Pour SDS-PAGE et western blot
ImidazoleWako095-00015Tampon de liaison et préparation du tampon d’élution
IncubateurNippon Medical & Chemical InstrumentsEZ-022Réglage de la température : 4 ° ; C
IncubateurNippon Medical & Chemical InstrumentsLH-100-RDS Réglage de latempérature : 37 ° ; C
Filtre à membraneMerck MilliporeJGWP047000.2 µ ; m de diamètre
MicrocentrifugeuseKubota3740
NaClWako191-01665Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
NaH2PO4· ; 2H2OWako192-02815Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
NaOHWako198-13765Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
(NH4)2SO4Wako015-06737Précipitation de sulfate d’ammonium
Résinede nickel Bio-Rad1560133Pour IMAC
Amorces PCR EurofinsGenomicsCommande
Étalon de protéinesBio-Rad161-0381Pour SDS-PAGE et western
blot Appareil de filtration par solvantAs OneFH-1G
SpectinomycineWako195-11531Antibiotiques ; utilisation à 100 &mu ; g/mL
Filtre stérile pour seringueMerckmilliporeSLGV004SL0,22 & micro ; m diamètre
Streptococus mutans Δ ; gtfCStock en laboratoire.gtfC remplacé par spcr
Streptococus mutans UA159Souche mère en laboratoire.S. mutans ATCC 700610, Souche de type sauvage
SucroseWako196-00015Pour le développement du biofilm
TAE (50 × ; )Nippon Gene313-90035Pour électrophorèse sur gel d’agarose
ThermocycleurBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)Wako314-90065Préparation du tampon Tris-EDTA
Kit de dosage des protéines BCA Fisher chargée sur mesure

Références

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