Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Résumé

Ici, nous présentons une méthode automatisée de digestion de protéine de plasma pour l’analyse protéomique quantitative spectrométrique-basée de masse. Dans ce protocole, les étapes de transfert et d’incubation liquides pour la dénaturation des protéines, la réduction, l’alkylation et les réactions de digestion de la trypsine sont rationalisées et automatisées. Il faut environ cinq heures pour préparer une plaque de 96 puits avec la précision désirée.

Résumé

La préparation de l’échantillon pour l’analyse de spectrométrie de masse dans la protéomique exige le clivage enzymatique des protéines dans un mélange de peptide. Ce processus implique de nombreuses étapes d’incubation et de transfert liquide afin d’atteindre la dénaturation, la réduction, l’alkylation et le clivage. L’adaptation de ce flux de travail à un poste de travail automatisé peut accroître l’efficacité et réduire les coefficients de variance, fournissant ainsi des données plus fiables pour les comparaisons statistiques entre les types d’échantillons. Nous avons déjà décrit un flux de travail automatisé de préparation d’échantillons protéomiques¹. Ici, nous rapportons le développement d’un flux de travail plus efficace et mieux contrôlé avec les avantages suivants : 1) Le nombre d’étapes de transfert liquide est réduit de neuf à six en combinant des réactifs ; 2) Le temps de tuyauterie est réduit par tuyauterie sélective de pointe utilisant une tête de tuyauterie de 96 positions avec plusieurs canaux ; 3) Le débit potentiel est augmenté par la disponibilité d’un plus grand nombre de positions de pont; 4) L’enceinte complète du système permet une amélioration de la température et du contrôle de l’environnement et réduit le risque de contamination d’échantillons ou de réactifs; et 5) L’ajout de peptides étiquetés isotopiques stables, ainsi que de protéines de galactosidase, à chaque échantillon rend possible la surveillance et le contrôle de la qualité tout au long du processus. Ces améliorations matérielles et de processus offrent une bonne reproductibilité et améliorent la précision intra-analyse et inter-analyse (CV de moins de 20 %) pour la quantification des protéines et des peptides à base de LC-MS. Le flux de travail total pour digérer 96 échantillons dans une plaque de 96 puits peut être complété en environ 5 heures.

Introduction

La quantification des protéines et des peptides à base de spectrométrie de masse (SEP) est de plus en plus appliquée comme outil bioanalytique pour l’analyse plasmatique dans la recherche fondamentale et les laboratoires cliniques^2,3. L’instrumentation et l’informatique requises ont progressé rapidement que la SP est devenue la méthode de choix pour quantifier les protéines ou les protéines modifiées en ciblant des séquences spécifiques de peptide en raison de sa capacité à quantifier des centaines de peptides dans une seule série de SP⁴. La préparation des échantillons sert de base à toute analyse protéomique. Avant l’analyse de la SP, les protéines d’un échantillon biologique sont généralement dénaturées, réduites, alkylées, digérées en peptides tryptiques et désaltées⁵. L’alkylation bloque les cystéines pour prévenir les modifications incontrôlées et s’assurer que toutes les cystéines ont la même masse. Ensuite, la trypsine est ajoutée pour digérer les protéines en peptides. Chacune de ces étapes nécessite une optimisation, et l’ensemble du processus est traditionnellement exécuté manuellement, permettant l’introduction d’erreurs analytiques.

Le pipeline traditionnel de développement des biomarqueurs se compose de deux processus principaux : la protéomique du fusil de chasse pour la découverte mondiale de protéines afin de créer un inventaire de protéines en profondeur⁶ et des protéomiques ciblés pour la vérification et la validation visant à la quantitation de protéines de haute précision et à haut débit⁷. Indépendamment de l’approche de LA SP, la préparation de l’échantillon est la même et se concentre sur le clivage enzymatique des protéines dans un mélange de peptide. Comme proposé par Van Eyk et Sobhani⁸, ayant une méthode qui permet une analyse précise, précise et reproductible pour la découverte et les essais ciblés est souhaité pour déplacer efficacement les biomarqueurs de découverte vers des essais cliniques mis en œuvre. Pour ce faire, l’automatisation de la préparation de l’échantillon sera utile et fournira la capacité d’augmenter l’efficacité à l’analyse à haut débit. Les méthodes manuelles introduisent généralement des erreurs analytiques au-delà des limites acceptables spécifiées par la Food and Drug Administration (FDA) dans le revised Bioanalytical Method Validation Guidance, qui comprend les biomarqueurs et les diagnostics^2,9. Le développement d’un flux de travail rapide, très précis et sans main pour la préparation d’échantillons de protéines de SP sera nécessaire pour faciliter la recherche sur les biomarqueurs, qui nécessite la préparation et l’analyse de milliers d’échantillons biologiques. La préparation de l’échantillon de SP comporte de nombreuses étapes où des erreurs peuvent être introduites, et le processus est fastidieux et long.

Dans notre méthode améliorée, un poste de travail automatisé a été programmé pour effectuer toutes les procédures nécessaires de préparation d’échantillons plasmatiques dans un total de 6 étapes(figure 1) pour s’assurer : 1) des transferts liquides précis; 2) la réaction est initiée et arrêtée à un moment constant; 3) la réaction est effectuée à une température contrôlée (c.-à-d., incubateur); et 4) la réaction a un mélange uniforme pour toutes les réactions. Nous avons également mis en œuvre l’ajout de protéines exogènes de contrôle de la qualité et de normes internes (normes stables de peptide étiquetés par isotopes) afin d’assurer un débit de qualité et reproductible de la quantification des protéines et des peptides à base de LC-MS dans un format de 96 puits. En incluant la préparation des réactifs, les heures de travail et un total de 1 000 000 étapes de tuyauterie seraient nécessaires pour traiter 96 échantillons dans des tubes individuels. L’automatisation réduit le temps pratique et le nombre d’interactions humaines impliquées.

Protocole

1. Mise en forme pour le gestionnaire liquide automatisé

1. Créer une nouvelle méthode à partir du menu Fichier(Fichier Nouvelle méthode)
   REMARQUE : Remplissez les étapes de l’ordre donné. La police italique dénote le texte à taper dans le logiciel Biomek. Veuillez contacter les auteurs pour obtenir de l’information sur les techniques et les modèles de tuyauterie.
2. Types De variables d’étape de démarrage et leurs valeurs dans l’étape de départ comme indiqué dans le tableau 1.
3. Réglez les colonnes pour le tuyauterie sélectif. Pour les étapes 1.3-1.7, cliquez sur l’étape Set Global dans la barre d’outils sous control Steps et faites-la glisser vers la méthode.
   1. À l’aide de l’étape Set Global, définissez la valeur « FirstColumn » à FirstColumn_Globalvariable, la valeur de LastColumn à LastColumn_Globalvariable, la valeur de LastColumn-FirstColumn-1 aux colonnes variables, et la valeur des colonnes 8 à des puitsvariables.
   2. Sélectionnez l’étape Script dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Tapez le script VB tel qu’indiqué dans la figure 2.
4. Définir des volumes pour les mixes Set Global et des solutions.
   1. À l’aide de l’étape Set Global, définissez les valeurs correspondantes aux variables de mixage de volume telles qu’indiquées dans le tableau 2.
   2. Cliquez sur l’étape Si dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Dans des conditions, tapez Autosampler.
   3. Sous puis, cliquez sur l’étape Set Global dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-le glisser vers la méthode.
   4. À l’aide de l’étape Set Global, définir lavaleur(MobilePhase-Columns)de 10 à variable MobilePhaseWell.(
   5. Sous Else, cliquez sur l’étape Set Global dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-le glisser vers la méthode.
   6. À l’aide de l’étape Set Global, définissez la valeur 0 à mobilePhaseWell variable
5. Configuration guidée labware (GLS)
   1. Cliquez sur l’étape de l’éditeur de pont dans la barre d’outils sous Utilities. Créez un nouveau pont pour correspondre à la disposition du tablier de la figure 3 et étiquetez-la comme deck 1.
   2. Cliquez sur l’étape d’installation guidée dans la barre d’outils sous Configuration et Appareils et faites-la glisser vers la méthode. Faites glisser et larguer les types de laboratoires dans les positions du pont, comme indiqué dans le tableau 3. Par la suite, remplissez les onglets dans la table comme indiqué dans le tableau 3 et la figure 4 (mise en place de la configuration guidée).
6. Mise en place de la procédure de comptage des pourboires
   1. Cliquez sur l’étape de la procédure de définition dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Procédure de nom comme TipCount.
   2. Cliquez sur l’étape script dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Tapez le script VB tel qu’indiqué dans la figure 5 (script de comptage des conseils).
   3. Cliquez sur l’étape Si dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode.
   4. Dans des conditions, tapez TL5 à 0.
   5. Sous puis,cliquez sur l’étape Move Labware dans la barre d’outils sous configuration et les étapes de l’appareil et faites-le glisser vers la méthode. Déplacez les laboratoires de TL5 à TR3. Cliquez sur l’étape Move Labware dans la barre d’outils, sous configuration et les étapes de l’appareil et faites-le glisser vers la méthode. Déplacez les laboratoires de TL2 à TL5. Enfin, cliquez sur l’étape Move Labware dans la barre d’outils sous configuration et les étapes de l’appareil et faites-le glisser vers la méthode. Déplacez les laboratoires de BC90 à TL2.
7. Définir la procédure pour l’incubateur
   1. Cliquez sur l’étape de la procédure de définition dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Procédure de nom comme incubateur.
   2. Tapez en halfTime comme nom variable et 1800 comme valeur par défaut.
   3. Tapez dans NextTemp comme nom variable et 22 comme valeur par défaut.
   4. Tapez l’intérim comme nom variable et 60 comme valeur par défaut.
   5. Cliquez sur l’étape Enhanced Move Labware dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Déplacez les laboratoires de la P11 à INHECO1.
   6. Cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Procédure de nom comme TipCount.
   7. Cliquez sur l’étape INHECO Incubate dans la barre d’outils sous Intégrations et faites-la glisser vers la méthode. Tapez INHECO1 pour utiliser l’appareil en position, «HalfTime for Incubate for, 'Temp for 'C et 'C for 'C of target temperature. Sélectionnez l’option Shake tout en incubant et Orbital ( dans le sensdes aiguilles d’une montre) secouer le style. Pour les réglages, tapez 1,00 mm d’un côté à l’autre, 6,6 fois par seconde, 1,00 mm vers l’avant et 6,6 fois par seconde.
      REMARQUE : Assurez-vous que le logiciel INHECO Incubator est installé.
   8. Cliquez sur l’étape INHECO Incubate dans la barre d’outils sous Intégrations et faites-la glisser vers la méthode. Tapez INHECO1 pour utiliser l’appareil en position, «HalfTime for Incubate for, 'Temp for 'C et 'C for 'C of target temperature. Sélectionnez l’option Shake tout en incubant et Orbital ( dans le sens inversedes aiguilles d’une montre) secouez le style. Pour les réglages, tapez 1,00 mm d’un côté à l’autre, 6,6 fois par seconde, 1,00 mm vers l’avant et vers l’arrière à 6,6 fois par seconde.
   9. Cliquez sur l’étape Pause dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Pause tout le système pour 1 s.
   10. Cliquez sur l’étape de la procédure de définition dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Procédure de nom comme incubateur.
   11. Cliquez sur l’étape INHECO Incubate dans la barre d’outils sous Intégrations et faites-la glisser vers la méthode. Tapez INHECO1 pour utiliser l’appareil en position, 1 pour Incubate pour, 'NextTemp pour 'C et 3 pour 'C de température cible.
8. Procédure de définition pour Orbital.
   1. Cliquez sur l’étape Enhanced Move Labware dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Déplacez les laboratoires de P11 à Orbital1.
   2. Cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez la procédure TipCount.
   3. Cliquez sur l’étape d’action de l’appareil dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez Appareil OritalShaker0, Commande TimedShake. Entrez Shaking vitesse 1000, Temps pour atteindre la pleine vitesse 2, Il est temps de secouer 30.
   4. Cliquez sur l’étape Enhanced Move Labware dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Déplacez le laboratoire Orbital1 en P11.
9. Mise en place du premier mix
   1. Cliquez sur l’étape Select Tip dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez la position de réorganisation TL4.
   2. Cliquez sur l’étape INHECO Incubate dans la barre d’outils sous Intégrations et faites-la glisser vers la méthode. Tapez INHECO1 pour utiliser l’appareil en position, 1 pour Incubate pour, 60 pour le C et 3 pour la température cible.
   3. Cliquez sur l’étape Boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape Select Tip. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin, et 1 comme Increment.
   4. Cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’étape de boucle. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement et Conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
   5. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’étape de boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez le volume sur firstMix,Aspirate à la colonne 1 et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
   6. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’étape de boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez le volume sur firstMix,distribuez à la colonne col et à la rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
   7. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils sélectionneurs dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’étape de boucle. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
10. Mise en place des échantillons
    1. Cliquez sur l’étape Si dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Type SamplePlate comme condition.
    2. Sous puis,cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-le glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement et Conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans les tipcolumns.
    3. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de ce moment-là. Sélectionnez Greiner96RoundPS Labware Type et Samples Position. Tapez le volume ' Échantillon,Aspirate à la colonne 'FirstColumn et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    4. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de la date de là. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Tapez le volume ' Échantillon, dispensez à la colonne ' FirstColumn et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manutention liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de ce moment-là. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    6. Après la fin de l’étape If, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez l’incubateur de procédure. Tapez en halfTime comme nom variable et 1800 comme valeur par défaut. Tapez dans NextTemp comme nom variable et 22 comme valeur par défaut. Tapez l’intérim comme nom variable et 60 comme valeur par défaut.
11. Mise en place du bloc Cysteine
    1. Cliquez sur l’étape Boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape de pointe Select. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin et 1 comme incrément.
    2. Sous la boucle, cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-le glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement et Conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
    3. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez dans le volume 'CysteineMix, aspirez à la colonne 2 et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    4. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Type en volume - CysteineMix, dispenser à la colonne col et la rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manutention liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de ce moment-là. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    6. Après la fin de la boucle If, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez l’incubateur de procédure. Tapez en halfTime comme nom variable et 300 comme valeur par défaut. Tapez dans NextTemp comme nom variable et 43 comme valeur par défaut. Tapez l’intérim comme nom variable et 25 comme valeur par défaut.
12. Mise en place du deuxième mix
    1. Cliquez sur l’étape Boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape de pointe Select. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin et 1 comme incrément.
    2. Sous boucle, cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement et Conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
    3. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez le volume de SecondMix,Aspirate à la colonne 3 et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    4. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Type en volume - SecondMix, Dispenser à la colonne col et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manutention liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de ce moment-là. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    6. Après la fin de la boucle Si la boucle, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez la procédure Orbital.
    7. Cliquez sur l’étape Pause dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Pause tout le système pour 1 s.
13. Mise en place de l’ajout trypsin
    1. Cliquez sur l’étape Boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape de pointe Select. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin et 1 comme incrément.
    2. Sous la boucle, cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-le glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement, et TL2 conseils de sauvegarde Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
    3. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez le volume de la trypsine,de l’aspiration à la colonne 4 et de la rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    4. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Tapez le volume 'Trypsin,Dispensez à la colonne ' col et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manutention liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de ce moment-là. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    6. Après la fin de la boucle If, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez l’incubateur de procédure. Tapez en halfTime comme nom variable et 3600 comme valeur par défaut. Tapez dans NextTemp comme nom variable et 25 comme valeur par défaut. Tapez l’intérim comme nom variable et 43 comme valeur par défaut.
    7. Cliquez sur l’étape INHECO Incubate dans la barre d’outils sous Intégrations et faites-la glisser vers la méthode. Assurez-vous que le logiciel INHECO Incubator est installé. Tapez INHECO1 pour utiliser l’appareil en position, 1 pour Incubate pour, 25 pour le C et 5 pour la température cible.
14. Mise en place de l’étanchéité
    1. Cliquez sur l’étape Boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape Select Tip. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin et 1 comme incrément.
    2. Sous la boucle, cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-le glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement et Conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
    3. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez le volume ' Quench,Aspirate à la colonne 5 et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    4. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Tapez le volume ' Quench, Dispensez à la colonne ' col et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de Then. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    6. Après la fin de la boucle Si la boucle, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez la procédure Orbital.
    7. Cliquez sur l’étape Pause dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Pause l’ensembledu système pour 1 s .
    8. Cliquez sur l’étape Pause dans la barre d’outils sous les étapes de configuration et d’appareil et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez Pause l’ensemble du système et afficher ce message. Tapez le message 'Continuer après centrifugation'.
15. Mise en place de la plaque pour Autosampler
    1. Cliquez sur l’étape Si dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode, dans l’étape Select Tip. Type Autosampler comme condition.
    2. Sous Puis,cliquez sur l’étape boucle dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Type col aussi variable 'FirstColumn que Démarrer, 'LastColumn comme fin et 1 comme incrément.
    3. Sous la boucle, cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-le glisser vers la méthode. Sélectionnez BC230 Conseils, TL6 Emplacement et conseils de sauvegarde TL2 Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans 1.
    4. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type et Reagent Plate Position. Tapez dans le volume 'MobilePhase, Aspirate à la colonne 6 et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    5. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez Bio_RadPCR96 labware Type et Autosampler Plate Position. Tapez dans le volume 'MobilePhase, Dispensez à la colonne ' col et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    6. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, à l’intérieur de Then. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1.
    7. Après la fin de la boucle If, cliquez sur l’étape de procédure d’exécution dans la barre d’outils sous les étapes de contrôle et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez la procédure TipCount.
    8. Cliquez sur l’étape Select Tips Load Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode. Sélectionnez BC90 Conseils, TL5 Emplacement, et TL2 conseils de sauvegarde Emplacement à partir du menu drop-down. Sélectionnez Une colonne unique et tapez dans les tipcolumns.
    9. Cliquez sur l’étape d’aspiration Select Tips dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode dans la boucle. Sélectionnez BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Tapez dans le volume 'DigestTransfer, Aspirate à la colonne 'firstcolumn et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    10. Cliquez sur l’étape Select Tips Dispense dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode, dans la boucle. Sélectionnez Bio_RadPCR96 labware Type et Autosampler Plate Position. Tapez dans le volume 'MobilePhase, Dispensez à la colonne 'FirstColumn et rangée 1. Sélectionnez une technique optimisée dans le menu déroulant de la technique.
    11. Cliquez sur l’étape de déchargement de conseils de sélection dans la barre d’outils sous les étapes de manipulation liquide et faites-la glisser vers la méthode dans Puis. Sélectionnez des conseils de déchargement à TR1. L’étape de certains conseils se termine ici.
    12. Enregistrer et nommer la méthode.

2. Préparer des spécimens, des laboratoires et des réactifs

1. Transférer 5 L de plasma humain sain en piscine dans une plaque de puits profond de 96 rounds.
   REMARQUE : Voir tableau des matériaux pour les réactifs et les fournitures utilisées dans ce protocole. TPCK Treated Trypsin a été acheté et trypsin au substrat rapport et le temps d’incubation a été optimisé spécifiquement. Si une autre catégorie de trypsine est utilisée, comme la trypsine recombinante de qualité de séquence, le rapport enzyme/substrat et le temps d’incubation doivent être testés et optimisés.

3. Procédure d’exploitation

1. Double-Cliquez sur l’icône logicielle.
2. Sous l’onglet Méthode, sélectionnez Home All Axes pour orienter et préparer le gestionnaire liquide automatisé. Assurez-vous que toutes les seringues de poste de travail ne contiennent pas de bulles d’air visibles.
3. Sous fichier, sélectionnez Ouvert Méthode.
4. Sélectionnez la méthode(figure 6).
5. Commencez la méthode en cliquant sur l’icône Run en forme de triangle vert.
6. Pour avoir une plaque d’autosampler préparé à la fin de la méthode, entrez la valeur «vrai» dans l’Entrer une valeur à utiliser pour 'Autosampler' invite, puis cliquez sur OK. Si une plaque d’autosampler n’est pas en cours de préparation, entrez la valeur «faux», puis cliquez sur OK.
7. Entrez la valeur '1' dans l’Entrez une valeur à utiliser pour 'firstcolumn' invite, puis cliquez sur OK.
8. Entrez la valeur '12' dans l’Entrez une valeur à utiliser pour 'lastcolumn' invite, puis cliquez sur OK.
   REMARQUE : Cette étape et cette étape 4.7 indiquent au poste de travail d’effectuer une digestion sur 12 colonnes d’une plaque de 96 puits, ce qui entraîne l’utilisation de tous les puits de la plaque pour la digestion.
9. Si une plaque d’échantillon est utilisée avec des volumes d’échantillons d’au moins 20 l, entrez la valeur «vrai» dans l’Entrer une valeur à utiliser pour 'SamplePlate' invite, puis cliquez sur OK. Si une plaque d’échantillon n’est pas utilisée, entrez la valeur «fausse», puis cliquez sur OK.
   REMARQUE : Si une plaque d’échantillon n’est pas utilisée, ajoutez 5 L d’échantillon à chaque puits correspondant de la plaque de réaction.
10. Suivez les instructions dans la fenêtre Guided Labware Setup et cliquez sur Continuer.
    REMARQUE : La fenêtre suivante décrit la disposition de la « plaque de réactif » à préparer(figure 7, tableau supplémentaire 1). Les volumes suivants seront aliquoted dans chacun des 8 puits d’une seule colonne dans la plaque de 1 mL Deep Round 96 puits:
    Colonne 1 : 540 l de mélange de réaction 1.
    Colonne 2: 50 l de Cysteine Block.
    Colonne 3: 730 l de Reaction Mix 2.
    Colonne 4: 130 l de Trypsin.
    Colonne 5: 130 L de la solution d’étanchéité.
    Colonne 5 : 1090 L de solution de phase mobile (Si l’utilisateur est entré « vrai » dans l’étape 6).
11. Cliquez ensuite et la fenêtre suivante décrit le volume minimum (20 l) nécessaire pour être aliquoted dans la plaque d’échantillon. Si l’utilisateur a saisi la valeur «fausse» pour l’invite impliquant la plaque d’échantillon (étape 9), l’utilisateur sera invité à ajouter un échantillon de 5 L à la plaque de réaction.
12. Cliquez sur Next.
    REMARQUE : La fenêtre suivante montre qu’une boîte à pourboires vide de 90 L doit être placée sur le tablier automatisé de gestionnaire liquide.
13. Cliquez à nouveau sur Next, en exposant le tablier du gestionnaire liquide automatisé tel que spécifié et illustré(figure 8), y compris la plaque reagent, la plaque de réaction, la plaque d’échantillon, la plaque Autosampler, 6 boîtes à pourboires complètes de 90 L, une boîte à pourboire vide de 90 L et une boîte à pourboires complète de 230 L.
14. Cliquez sur Finition pour commencer la méthode.
    REMARQUE : Après avoir cliqué sur La finition,l’utilisateur ne peut pas atteindre le gestionnaire liquide automatisé. Cela va «briser le rideau de lumière» de la machine et arrêter le gestionnaire liquide par mesure de sécurité.
15. Au Continuer après l’invite de centrifugation, récupérez la plaque de réaction et centrifugez-la pendant 30 minutes à 3 000 tr/min.
16. Une fois la centrifugation terminée, remettre la plaque de réaction au gestionnaire liquide automatisé à la position dans laquelle elle se trouvait avant la centrifugation, et cliquez sur Continuer.
    REMARQUE : Le gestionnaire liquide automatisé s’arrêtera à nouveau lorsque la méthode sera terminée. Si l’utilisateur est entré «vrai» pour l’étape 6, la plaque Autosampler peut alors être retiré du poste de travail et placé dans l’autosampler d’un instrument de chromatographie liquide pour l’analyse.

4. LC-MSMS

1. Résoudre les peptides sur un HPLC à débit élevé comprenant un C18 2,1 mm x 100 mm, colonne de 3,5 m avec un débit de 0,25 mL/min et analysé en ligne sur un spectromètre de masse triple quadrupole.
   REMARQUE : Après digestion de peptide, la méthode ciblée de LC-MSMS pour quantifier des peptides des échantillons robotiques préparés est décrite en détail¹ suivant une brève description de LC-MSMS.
2. Réglez la température du four à colonne à 40 oC. Utilisez le tampon A (2 % ACN, 98 % d’eau, 0,1 % d’acide formique) et le tampon B (95 % ACN, 5 % d’eau, 0,1 % d’acide formique) comme phases mobiles.
3. Équilibrez la colonne avec 5% B pendant 5 minutes après le chargement. Elute les peptides plus de 30 minutes avec un gradient linéaire de 5% à 35% de tampon B.
   1. Recyclez la colonne avant de charger l’échantillon suivant en lavant avec 98% B pendant 10 minutes, puis 5% B pendant 5 minutes.
   2. Pour le détournement en ligne, détournez l’eluent post-colonne vers le gaspillage avant qu’il n’entre dans la source d’ion à l’aide d’une soupape de commutation en deux phases.
4. Traiter les données MRM.

Résultats

Le flux de travail automatisé de préparation d’échantillons de protéomique sur le poste de travail automatisé a été adapté de notre protocole automatisé précédent avec une^robuste méthode d’acquisition de LC-SRM-MS pour l’albumine, la protéine plasmatique sélectionnée et la galactosidase (-gal), une protéine exogène utilisée pour le contrôle de la qualité. Après le traitement, les échantillons ont été exécutés sur un triple quadrupole LC-MS dans un essai SRM ciblant l’albumin de sérum, '-galactosidase. Le coefficient de variation (CV) du signal SRM pour chaque transition a été utilisé pour surveiller la reproductibilité du protocole de digestion automatisé.

Nous avons automatisé l’addition de réactif et les étapes de mélange pour une digestion d’échantillons de plasma de 5 L avec une incubation de trypsine de 2 heures sur le pont-incubateur. Pour déterminer la reproductibilité, 5 l d’une piscine plasmatique a été canalisé dans plusieurs puits d’une plaque de réaction avec une tête multicanal (96 broches). Pour surveiller la consistance, nous avons ajouté la protéine de gal avant les réactions de réduction et d’alkylation. Le flux de travail automatisé de préparation d’échantillons de protéomique a été testé avec une méthode robuste d’acquisition de LC-SRM-MS, y compris l’albumine, la protéine plasmatique la plus élevée d’abondance, et la protéine de gal, utilisée pour le contrôle de la qualité. Trois peptides et deux peptides d’albumine ont été surveillés à partir de protéines d’albumine plasma transformées et de protéines à pointes de gal(tableau 4).

Dans un effort pour gagner du temps et simplifier la procédure, nous avons réduit les étapes de transfert liquide de l’ajout/ de mélange/incubation du mélange de réactif et de réaction avec le poste de travail d’un flux de travail en neuf étapes à un flux de travail en six étapes(figure 1). Le flux de travail protéomique total était composé de deux composantes expérimentales : la préparation automatisée de l’échantillon et le LC-MS/MS. Tout d’abord, nous avons évalué la précision de l’acquisition de données LC-MS/MS SRM par huit injections consécutives du même puits de digestion de la plaque d’autosampler. La précision du flux de travail automatisé de préparation de l’échantillon a été calculée par le pourcentage de coefficient de variance (%CV) du flux de travail protéomique total de SRM moins %CV du LC-MS/MS(figure 9B). Avec la procédure simplifiée de digestion du plasma sur le poste de travail automatisé, la précision expérimentale de la préparation automatisée des échantillons était inférieure à 11,4 % pour les protéines exogènes à pointes de gal (10,0 % en moyenne), et moins de 14,9 % pour l’albumine de sérum humain la plus abondante (9,9 % en moyenne)(figure 9). De bonnes intensités de signal ont été observées pour l’albumine de sérum humain et les protéines de gal comme prévu(figure 9C).

Pour chaque étape de tuyauterie et de transfert de liquide, les techniques ont été spécifiquement optimisées. Pour surveiller la précision des étapes de transfert de liquides, nous avons augmenté les normes de peptide étiquetées par isotopes stables (SIL) pour la protéine endogène de l’albumine de sérum humain et la protéine exogène de 10 ans dans trois étapes indépendantes de transfert de réactifs : Reaction Mix 1, Cysteine Blocker, et Reaction Mix 2(figure 10). Les signaux MRM de ces cinq peptides SIL ont été acquis pour surveiller la précision des étapes automatisées de transfert de liquide. Le %CV moyen pour les peptides, DDNPNLPR ET GDFQFNISRMD (représente l’acide aminé étiqueté N15) de Reaction Mix 1 étape variait de 1,8% à 11,2%. Le pourcentage moyen de 1 peptide (IDPNAWVERMD) de l’étape cysteine Blocker variait de 6,6 à 8,8 %. Le % CV moyen de deux peptides (WVGYGQDSR ET LVNEVTEFAKMD) variait de 6,2 % à 11,9 %(figure 10).

Pour valider le flux de travail automatisé de préparation d’échantillons de protéomique, nous avons évalué la reproductibilité à travers plusieurs protéines et plusieurs jours pour l’albumine de sérum humain, exogène et 40 protéines plasmatiques supplémentaires. Nous avons traité 21 échantillons de réplique (plasma humain normal mis en commun), bien situé dans la figure 11A, sur trois jours différents. Les CV intrajournalaux ont été calculés à partir de 21 puits préparés le même jour. Les PV à taux de pourcentage intrajournaliques moyens pour 40 protéines variaient de 4 % à 20 %(figure 11B). Pour évaluer l’effet de bord du flux de travail automatisé basé sur la plaque, % CV a été calculé à partir de puits spécifiques dans les colonnes et les rangées désignées(figure 12A pour la colonne et la carte des rangées). Les intensités des signaux MRM étaient similaires dans toutes les configurations de colonnes et de rangées avec % CV allant de 3 % à 22 %(figure 12B).

En résumé, le flux de travail automatisé optimisé produit 96 échantillons uniformément traités en moins de cinq heures avec une excellente précision expérimentale. Pour la compatibilité avec un flux de travail automatisé, nous avons sélectionné des réactifs qui ont des réactions latérales non spécifiques négligeables, sont stables dans la lumière ambiante, sont LC-MS/MS amicales, et peuvent être stockés comme aliquots congelés.

Figure 1 : Schéma du flux de travail de préparation de l’échantillon. Les 6 principales étapes de transfert de liquides sont répertoriées. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Script de chargement de conseil. Les détails du script VB sont affichés ici. Le script spécifie les conditions de chargement des pourboires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Disposition automatisée du poste de travail Deck. Le tablier se compose de 1x1 ALP, tip Loading ALPs, Trash, Tip wash, Peltier et un incubateur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Propriétés de la plaque de réactif. Les propriétés nécessaires pour le laboratoire Reagent Plate lorsqu’elles sont consultées à l’aide de la configuration de labware guidé sont indiquées. Sélectionnez la colonne correspondante et tapez les variables telles qu’indiquées dans le chiffre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Compte-conseil du script. Ce script permet de garder une trace du nombre de conseils sur le pont. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Aperçu de la méthode de digestion et d’aliquoting des échantillons de plasma. Étapes pour les calculs de réactif, la configuration de labware, et les manipulations liquides dans la méthode du gestionnaire liquide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Disposition de la plaque de réactif. Les réactifs chimiques nécessaires à la digestion du plasma et à la préparation de l’autosampler sont présentés et répartis dans les laboratoires de plaque réactifs. Ce chiffre a été modifié à partir d’une note technique¹⁰. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Mise en page du laboratoire sur le pont du poste de travail automatisé. On y voit la disposition du tablier pour la méthode de digestion du plasma pour le gestionnaire liquide. Ce chiffre a été modifié à partir d’une note technique¹⁰. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9 : La précision du flux de travail protéomique total est composée de CV de poste de travail et de CV LC MS/MS ciblé.
Cinq peptides de la gal et de l’albumine ont été surveillés, les chromatogrammes et le temps de rétention de peptide pour chaque peptide sont montrés (A), Précision a été déterminée à partir de 30 puits / échantillons de traitement expérience représentative, CV% pour le flux de travail protéomique total, LC MS / MS analyse et le traitement automatisé des échantillons ont été calculés (B). Dans l’ensemble, les peptides digérés ont montré de bons signaux variaient de 1x10⁵ jusqu’à 1x10⁸. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10 : Détermination de la précision pour les étapes de transfert liquide. Les peptides synthétiques ont été augmentés dans des réactifs spécifiques à l’étape, et le transfert automatique de liquide a été déterminé par le total% CV. À partir de 30 puits/échantillons d’expérience moins % CV LC MSMS (déterminé par 8 injections répétées de LC MSMS. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 11 : Reproduction de plusieurs jours du flux de travail automatisé de préparation d’échantillon protéomique avec 42 analyses de MRM de protéine. (A) La carte de la plaque de réaction pour chacun des trois jours est montré ici, 5 L de plasma a été ajouté à chacun des 21 puits. 3 puits reçus 5 ul eau ont été utilisés comme contrôles négatifs / blanc. (B) Les intensités moyennes de 190 transitions comprennent 75 peptides et 42 protéines (à gauche) et %CV pour chaque transition MRM a été calculé à partir de 21 puits de digestion pour chaque jour (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 12 : Reproductibilité d’emplacements spécifiques de puits (position des colonnes et des rangées). (A) Colonnes et emplacement des rangées avec une carte de plaque sont montrés ici. (B) Colonne et emplacement de ligne signaux MRM spécifiques des intensités moyennes des puits spécifiés (gauche) et cv% (droite) d’une digestion de plaque unique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 13 : Capture d’écran de l’éditeur technique. Pour chaque modèle de tuyauterie, définissez les propriétés de la détection de niveau liquide, de la détection de caillots, du piercing, du type liquide, du général, de l’aspiration, du dispense, du mélange et de l’étalonnage. Le modèle et les techniques utilisés dans ce protocole sont indiqués dans le tableau supplémentaire 2). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Variable	Variable	Valeur	Description
Autosampler	Boolean	Vrai	Utilisez autosampler
Betagal Betagal	Entier	5	Volume Betagal
BG1 (BG1)	Entier	0.8	Volume BG1
BG2 (BG2)	Entier	0.8	Volume BG2
BG3 (BG3)	Entier	0.8	Volume BG3
CysteinBlocker	Entier	1.25	Volume de bloqueur de cystéine
CysteineBuffer	Entier	0.45	Volume tampon de cystéine
Dénaturant	Entier	5	Volume dénaturant
DigestTransfer (en)	Entier	10	Digest volume de transfert
Premier tampon	Entier	25.9	Premier volume tampon
Première colonne	Entier	1	Première colonne
HSA1 (HSA1)	Entier	0.8	Volume HSA1
HSA2 (HSA2)	Entier	0.8	Volume HSA2
Lastcolumn	Entier	12	Dernière colonne
MobilePhase (en)	Entier	90	Volume de phase mobile
Étancher	Entier	10	Colonne d’étanchéité
Réduire Leagent	Entier	5	Réduction de la colonne d’agent
Échantillon	Entier	5	Exemple de colonne
SamplePlate (samplePlate)	Boolean	Vrai	Utiliser la plaque d’échantillon
DeuxièmeBuffer	Entier	58.4	Deuxième volume tampon
Trypsine	Entier	10	Colonne de trypsine

Tableau 1 : Variables d’étape de démarrage

Valeur	Variable
'FirstBuffer’Denaturant’ReducingAgent-Betagal-BG1-HSA1	FirstMix (en)
-CysteineBlocker-CysteineBuffer-BG2	CysteineMix
'SecondBuffer’BG3'HSA2	SecondMix
(FirstMix-Colonnes) 30	FirstMixWell (en)
(CysteineMixMD Colonnes) 20	CysteineWell CysteineWell
(SecondMix-Colonnes) 10	DeuxièmeMixWell
(Trypsin-Colonnes) 10	TrypsinWell
(Quench-Colonnes) 10	QuenchWell
(FirstMixWell 8) 100	FirstMixStock (en)
CysteineWell 8-20	CysteineMixStock (en)
(SecondMixWell 8) 100	DeuxièmeMixStock

Tableau 2 : Variables de mélange de volume

Type	Nom	Position	Profondeur	Propriétés	Utiliser?
BCDeep96Round	Plaque de réactif	P5 (en)	1(top)	#	-pas SamplePlate
BCDeep96Round	Plaque de réactif	P5 (en)	1(top)	#	SamplePlate
BCDeep96Round	Plaque de réaction	P11	1(top)		Vrai
Bio_RadPCR96	Échantillons	P9 P9	1(top)		SamplePlate
Bio_RadPCR96	Plaque Autosampler	P10	1(top)		Autosampler
BC90 (en)	Vide		1(top)		Vrai
BC90 (en)			1(top)		Vrai
BC90 (en)			1(top)		Vrai
BC230 (en)			1(top)		Autosampler
BC90 (en)			1(top)		Colonnes 'gt;1
BC90 (en)			1(top)		Colonnes 'gt;3
BC90 (en)			1(top)		Colonnes 'gt;5
BC90 (en)			1(top)		Colonnes 'gt;7
BC90 (en)			1(top)		Colonnes 'gt;9
Note: : Correspond à la plaque 96 well Bio-Rad. : Cliquez sur les propriétés et entrez ensuite les variables de volume indiquées dans la figure 6.

Tableau 3 : Mise en place de la configuration guidée

Protéines ID	Séquence Peptide	Q1 Messe (Da)	Messe Q3 (Da)	Temps (min)	Fragment Ion	Réduction du potentiel	Énergie de collision	Potentiel de sortie de cellules de collision
sp P00722 BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	2y6	61	25	18
	IDPNAWVER (EN anglais seulement)	550.3	436.1	18.1	2y7-2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR (WVGYGQDSR)	534.3	782.1	12.1	2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	2y4	90	25	8
sp P02768 ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	2y6	61	27	18
	LVNEVTEFAK	575.3	694.4	18.2	2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	2y7	73.1	29.6	18

Tableau 4 : Paramètres MRM

Tableau supplémentaire 1 : Plaque de réactif S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.

Tableau supplémentaire 2 : Modèle de protocole S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Le traitement d’échantillon pour la spectrométrie de masse exige la dénaturation de protéine, la réduction et l’alkylation pour bloquer les cystéines, et la digestion de la trypsine pour fendre des protéines dans des peptides. Chaque réaction chimique ou enzymatique doit être lancée à un moment désigné et effectuée à une température contrôlée, et chaque étape du processus comporte plusieurs étapes de transfert liquide où des variations expérimentales peuvent être introduites. Le traitement automatisé des échantillons constitue une solution à ce dilemme. Les systèmes de manutention liquide actuellement disponibles ont la capacité de transférer les réactifs dans des plaques de 96 puits avec une précision et une précision inférieures à 5 %, selon le type de tête et de pointe utilisé, et d’incuber des échantillons, avec des secousses si désirées, sous des températures contrôlées allant de 14 à 70 oC. Nous avons utilisé un gestionnaire liquide automatisé pour traiter le plasma pour les essais SRM dans un format de 96 puits.

Il y a plusieurs milliers de sites de clivage de protéase dans les mélanges complexes de protéines dans le sérum, le plasma, et d’autres échantillons biologiques ; et chacune de ces protéines a des propriétés uniques affectant l’accessibilité du site de clivage et la stabilité des peptides qui en résultent. Il est donc impossible de concevoir une procédure de traitement de l’échantillon qui est optimale pour chaque protéine. La meilleure alternative est d’être aussi cohérent que possible.

Pour atteindre la cohérence, nous avons optimisé chaque étape de tuyauterie effectuée par le gestionnaire liquide automatisé. Nous avons d’abord examiné le volume requis et les contraintes imposées par le type de liquide (plasma, aqueux ou organique) et les propriétés correspondantes (viscosité, cohésion et volatilité), le matériel (machine à piper-tête et les bras qui s’accrochent à la plaque) et les laboratoires. Nous avons ensuite varié la vitesse et l’écart d’air de fuite pour l’aspiration, la vitesse et le volume d’éruption pour la distribution, et la force et la durée du mélange, tout en incorporant une touche de pointe après aspiration et /ou de distribuer, si nécessaire, pour éliminer l’adhérence liquide à l’extérieur des conseils(figure 13, tableau supplémentaire 1). Un peptide SIL unique, pré-dépisté pour la stabilité, a été cloué dans chaque réactif pour permettre de surveiller la précision de chaque étape de manipulation liquide. Après optimisation, les CV de processus pour la majorité des transitions étaient inférieurs à 10 %, démontrant une bonne reproductibilité avec le poste de travail automatisé(figure 9, figure 10, figure 11 et figure 12).

Le flux de travail automatisé présenté ici prévoit une digestion enzymatique cohérente avec une reproductibilité et un débit améliorés par rapport aux méthodes manuelles(figure 9, figure 10). Cette approche promet d’améliorer la précision et la fiabilité de la découverte et de la validation des biomarqueurs par spectrométrie de masse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Un pool de plasma humain sain	Bioreclamation Inc.
Acétonitrile, HPLC Grade	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS solvant
B-Galactosidase Recombinant à partir de	protéines de contrôle exogènes	Sigma-Aldrich	G3153-5MG
Station de travail automatisée Biomek i7	Beckman Coulter, Inc.		Le poste de préparation protéomique des échantillons : Les postes de travail automatisés Biomek ne sont pas destinés ou validés pour être utilisés dans le diagnostic de maladies ou d’autres affections
Biomek i-Series Tips 230µ ; L Non stérile	Beckman Coulter, Inc.	B85903  ;	Pointes, consommable i7
Biomek i-Series Pointes 90µ ; L Non stérile	Beckman Coulter, Inc.	B85881  ;	Pointes, consommable i7
FG, Kit Trypsine TPCK	Sciex	4445250	Trypsine utilisée dans la digestion
Plaques PCR à 96 puits à coque dure, profil bas, paroi mince, à jupe, verte/transparente.	Bio-Rad	Plaque d’échantillonneur automatique
Octyl B-D-Glucopyranoside	Sigma-Aldrich	O9882-5G	détergent utilisé dans
la digestion Polypropylène, 96 plaques rondes à puits profonds Stérile	Beckman Coulter, Inc.	267007	Plaque de réactif et de digestion
Prominence UFLCXR Système HPLC	Shimadzu, Japon		Système LC à haut débit
QTRAP 6500	SCIEX		Spectromètre
de masse Eau, HPLC Grade	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS Solvant
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm	Eaux	186003564	LC Colonne MSMS