Induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans des cellules HepaRG différenciées

Silvia Di Cocco; Laura Belloni; Abigail  D.G. Nunn; Debora Salerno; Silvia Piconese; Massimo Levrero; Natalia Pediconi

doi:10.3791/59843

Article de méthode

Induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans des cellules HepaRG différenciées

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DOI :

10.3791/59843

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18 juillet 2019

Silvia Di Cocco¹^,² , Laura Belloni³ , Abigail D.G. Nunn³ , Debora Salerno³ , Silvia Piconese²^,⁴ , Massimo Levrero²^,³^,⁵^,⁶ , Natalia Pediconi¹^,³

¹Department of Molecular Medicine, Sapienza University, ²Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, ³Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, ⁴Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, ⁵INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, ⁶Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé pour induire la stéatose vésiculaire de foie dans les cellules différenciées d'HépaRG avec l'oleat sodium de sel d'acide gras et employons des méthodes pour la détection et la quantification de l'accumulation de lipide, y compris les anti-Stokes cohérents Microscopie de diffusion raman (CARS), analyse cytofluorimétrique, coloration rouge huile O et qPCR.

Résumé

La stéatose hépatique représente un dysfonctionnement métabolique qui résulte d'une accumulation de gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides dans les hépatocytes. L'accumulation excessive de graisse mène à la maladie de foie gras non-alcoolique (NAFLD), qui est potentiellement réversible et peut évoluer en stéatohépatite non-alcoolique (NASH) et par la suite cirrhose et carcinome hépatocellulaire (HCC). Les mécanismes moléculaires liant l'accumulation de lipide dans les hépatocytes avec la progression à NASH, les dommages irréversibles de foie, la fibrose, la cirrhose, et même HCC restent toujours peu clairs. À cette fin, plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour élucider les processus pathologiques qui causent nAFLD. Dans la présente étude, nous décrivons un modèle cellulaire pour l'induction de la stéatose vésiculaire du foie qui se compose de cellules hepaRG hepatic humaines différenciées DMSO traitées avec l'oleat de sodium de sel d'acide gras. En effet, les cellules HepaRG traitées à l'oleat de sodium accumulent des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et présentent des caractéristiques typiques de la stéatose. Ce modèle humain in vitro représente une alternative précieuse aux modèles de souris in vivo ainsi qu'aux hépatocytes humains primaires. Nous présentons également une comparaison de plusieurs méthodes pour la quantification et l'évaluation de l'accumulation de graisse dans les cellules de HepaRG, y compris la coloration rouge d'huile o, la mesure cytofluorimétrique de Bodipy, l'analyse métabolique d'expression de gène par qPCR, et l'anti-Stokes cohérent Microscopie de diffusion raman (CARS). L'imagerie CARS combine la spécificité chimique de la spectroscopie Raman, une technique d'analyse chimique bien connue dans les applications de la science des matériaux, avec les avantages de microscopies optiques non linéaires à haute vitesse et à haute résolution pour permettre quantification de l'accumulation de lipides et de la dynamique des gouttelettes lipidiques. La mise en place d'un modèle in vitro efficace pour l'induction de la stéatose vésiculaire, ainsi qu'une méthode précise pour la quantification et la caractérisation de l'accumulation de lipides, pourrait conduire au développement d'un diagnostic précoce de NAFLD via le l'identification des marqueurs moléculaires et à la génération de nouvelles stratégies de traitement.

Introduction

La stéatose hépatique est définie comme une accumulation de graisse intrahépatique, dans des gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides, d'au moins 5 % du poids du foie. Le stockage hépatique prolongé de lipide est un processus potentiellement réversible, cependant, il peut mener au dysfonctionnement métabolique de foie, à l'inflammation et aux formes avancées de la maladie hépatique non alcoolique (NAFLD), la cause prédominante de la maladie chronique de foie dans beaucoup de parties de le monde¹^,². NAFLD est une maladie multifactorielle qui peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique plus agr....