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Induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans des cellules HepaRG différenciées

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DOI :

10.3791/59843

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18 juillet 2019

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1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé pour induire la stéatose vésiculaire de foie dans les cellules différenciées d'HépaRG avec l'oleat sodium de sel d'acide gras et employons des méthodes pour la détection et la quantification de l'accumulation de lipide, y compris les anti-Stokes cohérents Microscopie de diffusion raman (CARS), analyse cytofluorimétrique, coloration rouge huile O et qPCR.

Résumé

La stéatose hépatique représente un dysfonctionnement métabolique qui résulte d'une accumulation de gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides dans les hépatocytes. L'accumulation excessive de graisse mène à la maladie de foie gras non-alcoolique (NAFLD), qui est potentiellement réversible et peut évoluer en stéatohépatite non-alcoolique (NASH) et par la suite cirrhose et carcinome hépatocellulaire (HCC). Les mécanismes moléculaires liant l'accumulation de lipide dans les hépatocytes avec la progression à NASH, les dommages irréversibles de foie, la fibrose, la cirrhose, et même HCC restent toujours peu clairs. À cette fin, plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour élucider les processus pathologiques qui causent nAFLD. Dans la présente étude, nous décrivons un modèle cellulaire pour l'induction de la stéatose vésiculaire du foie qui se compose de cellules hepaRG hepatic humaines différenciées DMSO traitées avec l'oleat de sodium de sel d'acide gras. En effet, les cellules HepaRG traitées à l'oleat de sodium accumulent des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et présentent des caractéristiques typiques de la stéatose. Ce modèle humain in vitro représente une alternative précieuse aux modèles de souris in vivo ainsi qu'aux hépatocytes humains primaires. Nous présentons également une comparaison de plusieurs méthodes pour la quantification et l'évaluation de l'accumulation de graisse dans les cellules de HepaRG, y compris la coloration rouge d'huile o, la mesure cytofluorimétrique de Bodipy, l'analyse métabolique d'expression de gène par qPCR, et l'anti-Stokes cohérent Microscopie de diffusion raman (CARS). L'imagerie CARS combine la spécificité chimique de la spectroscopie Raman, une technique d'analyse chimique bien connue dans les applications de la science des matériaux, avec les avantages de microscopies optiques non linéaires à haute vitesse et à haute résolution pour permettre quantification de l'accumulation de lipides et de la dynamique des gouttelettes lipidiques. La mise en place d'un modèle in vitro efficace pour l'induction de la stéatose vésiculaire, ainsi qu'une méthode précise pour la quantification et la caractérisation de l'accumulation de lipides, pourrait conduire au développement d'un diagnostic précoce de NAFLD via le l'identification des marqueurs moléculaires et à la génération de nouvelles stratégies de traitement.

Introduction

La stéatose hépatique est définie comme une accumulation de graisse intrahépatique, dans des gouttelettes lipidiques contenant des triglycérides, d'au moins 5 % du poids du foie. Le stockage hépatique prolongé de lipide est un processus potentiellement réversible, cependant, il peut mener au dysfonctionnement métabolique de foie, à l'inflammation et aux formes avancées de la maladie hépatique non alcoolique (NAFLD), la cause prédominante de la maladie chronique de foie dans beaucoup de parties de le monde1,2. NAFLD est une maladie multifactorielle qui peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique plus agressive (NASH), qui à son tour peut progresser vers la cirrhose et, dans un petit pourcentage de patients, au carcinome hépatocellulaire (HCC)1,3. Aucun traitement approuvé n'est actuellement disponible comme traitement spécifique pour NAFLD et la combinaison des modifications de régime et de mode de vie reste le pilier de la gestion de NAFLD et de NASH4,5,6.

Les mécanismes moléculaires menant au développement de la stéatose hépatique dans la pathogénie de NAFLD restent à élucider7. Dans ce contexte, des modèles murins ont été développés pour étudier la progression de la maladie de stéatose humaine. Une myriade de modèles différents existe, et chacun a ses avantages et ses inconvénients, y compris les modèles génétiques, nutritionnels et induits chimiquement combinant des approches différentes. Les souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out) développent spontanément une maladie du foie. Cependant, il convient de noter que ces mutations sont très rares chez l'homme et la suppression ou la surexpression d'un seul gène (par exemple, ob / ob souris) ne peut pas imiter l'étiologie de la maladie humaine multifactorielle au niveau moléculaire8,9. De même, la maladie acquise par les souris après manipulation diététique ou pharmacologique ne peutpas imiter les effets des régimes humains liés au développement de NAFLD dans l'homme 8. Les modèles animaux ont toutefois facilité l'évolution de la compréhension de la NAFLD et cette approche est actuellement la stratégie la plus utilisée dans la recherche en laboratoire. Néanmoins, la réplication chez l'homme des résultats obtenus dans les modèles animaux a échoué à plusieurs reprises, provoquant une mauvaise traduction dans la clinique10.

Par conséquent, les modèles in vitro de NAFLD peuvent jouer un rôle fondamental en élucidant les mécanismes moléculaires de la progression de NAFLD, et ils représentent un outil valable pour examiner un grand nombre de composés. Les cultures cellulaires primaires, les lignées cellulaires immortalisées et les biopsies hépatiques ont été largement utilisées à des fins de recherche11. Les hépatocytes humains primaires ressemblent étroitement aux conditions cliniques humaines, mais il y a un nombre limité de donneurs, et les cultures primaires de cellules montrent la reproductibilité pauvre due à la variabilité des cellules. Ces observations, ainsi que des questions éthiques et logistiques, ont entraîné l'utilisation d'hépatocytes primaires humains étant limité12. Ainsi, les lignées cellulaires hépatiques représentent une alternative pratique, ayant plusieurs avantages essentiels sur la culture primaire, que les lignées cellulaires hépatiques se développent régulièrement, ont une durée de vie presque illimitée, et ont un phénotype stable. En outre, les lignées cellulaires sont facilement accessibles et les conditions de culture des lignées cellulaires hépatiques sont plus simples que celles des hépatocytes primaires et sont normalisées entre les différents laboratoires.

Ici, nous décrivons en détail un modèle cellulaire in vitro de stéatose vésiculaire de foie, représenté par les cellules hepaRG différenciées hépatiques traitées avec l'oleat de sodium d'acide gras. La ligne cellulaire de HepaRG a été établie à partir d'un patient féminin affecté par l'infection d'hépatite C et d'une tumeur bien différenciée de foie de catégorie I d'Edmondson14. La lignée cellulaire HepaRG est une lignée cellulaire bipotente humaine capable de se différencier lors de l'exposition au sulfoxure de diméthyle (DMSO) de 2 % vers deux phénotypes cellulaires différents : les cellules biliaires et hépatocytes. Les cellules HepaRG différenciées (dHepaRG) partagent certaines caractéristiques et propriétés avec les hépatocytes adultes et possèdent la capacité d'exprimer de façon stable des gènes spécifiques au foie tels que l'albumine, l'aldolaseB, le Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) et cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)13 (étape 3). Le traitement des cellules dHepaRG avec l'oleat de sodium de sel de sel d'acide gras (250 M) pendant 5 jours mènent à la génération des gouttelettes cytoplasmiques de lipide, imitant les effets du foie gras14,15,17,18 ( étape 4). L'accumulation de gouttelettes lipidiques peut être facilement détectée par la coloration Oil Red O (étape 5), un colorant liposoluble lysochrome qui tache les triglycérides neutres et les lipides rouge-orange. Pour quantifier efficacement les lipides dans le dHepaRG gras, nous illustrons ici l'analyse cytofluorimétrique après coloration avec 4,4-difluoro-1,3,5,5,7-tétramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (étape 6), une sonde fluorescente lipophile qui localise aux corps lipidiques intracellulaires et a été utilisé pour étiqueter les gouttelettes lipidiques19. En outre, ici nous montrons comment évaluer la stéatose par réaction quantitative en chaîne de polymérase (qPCR) (étape 7) déréglementation d'expression de gène de plusieurs gènes métaboliques dans les cellules dHepaRG. Pour caractériser et quantifier davantage l'accumulation de gouttelettes lipidiques après le traitement à l'avoine de sodium, nous avons effectué une microscopie cohérente de diffusion anti-Stokes Raman (CARS) (étape 8), une technique innovante qui permet la visualisation et la quantification de gouttelettes lipidiques sans étiquetage20,21.

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Protocole

1. Préparation des médias culturels et des réactifs

  1. Moyen proliférant : supplément du milieu E de William avec glutaMAX, 10% sérum bovin foetal (FBS), 1% pénicilline/streptomycine, insuline de 5 g/mL et 0.5 'M d'hemisuccinate d'hydrocortisone.
  2. Moyen de différenciation : supplément du milieu E de William avec GlutaMAX, 10% FBS, 1% pénicilline/streptomycine, insuline de 5 g/mL, 50 'M d'hémicine hydrocortisone et 2% d'hemisuccinate d'hydrocortisone et 2% de DMSO.
  3. Milieu de congélation : supplément du milieu proliférant avec 10% de DMSO.
  4. Oleate de sodium : dissoudre dans 99 % de méthanol à une concentration de 100 mm, remuer O/N et conserver à -20 oC.
  5. Oil Red O: préparer une solution de stock. Peser 0,35 g d'huile rouge O et dissoudre en 100 ml d'isopropanol. Remuer O/N, filtrer (0,2 m) et stocker chez RT. Préparer une solution de travail : mélanger 6 mL de solution Oil Red O Stock avec 4 ml de ddH2O. Laisser s'asseoir à température ambiante (RT) pendant 20 min, puis filtrer à l''intérieur d'un filtre de 0,2 m. Une filtration appropriée est fortement recommandée pour la coloration réussie pour éviter l'arrière-plan.
  6. Bodipy (505/515) : dissoudre le colorant Bodipy (505/515) dans le DMSO à une concentration de 100 M. de stock, stocker à -20 oC dans l'obscurité et l'utiliser à une concentration finale de 100 nM.
  7. Acquérir des plats transparents à fond de verre pour les expériences CARS.

2. Décongélation, amplification et cryoconservation des cellules HepaRG

  1. Décongeler les cellules HepaRG cryoconservées en immergeant un lot dans un bain de 37 oC jusqu'à ce qu'elles soient décongelées. Sélectionnez un lot de passage faible (lt;20). Les cellules HepaRG sont disponibles dans le commerce.
  2. Transférer rapidement les cellules dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de milieu proliférant et de centrifugeuse pendant 5 min (200 x g, 4 oC).
  3. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 5 ml de milieu proliférant.
  4. Compter les cellules et diluer afin de plaquer 2,5 x 104 cellules/cm2.
  5. Renouveler le milieu tous les 2 ou 3 jours. Les cellules prolifèrent avec un temps de doublement d'environ 24 h.
  6. Détachez les cellules HepaRG lorsqu'elles sont à 80 % de confluence par incubation de 3 à 5 min avec une solution de trypsine de 0,05 %. Recueillir les cellules dans le milieu proliférant et centrifugeuse pendant 5 min (200 x g, 4 oC).
  7. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 5 ml de milieu proliférant.
  8. Compter les cellules et diluer afin de plaquer 2,5 x 104 cellules/cm2.
  9. À ce stade, amplifiez les cellules en répétant les étapes 2.5-2.8 afin d'atteindre un nombre approprié de cellules pour commencer des expériences, ou cryopreserve comme dans l'étape 2.10.
  10. Pour cryoconserver les cellules HepaRG, détacher les cellules 24 h après le placage par 3-5 min d'incubation avec la solution de trypsine 0,05%. Recueillir les cellules dans le milieu proliférant et centrifugeuse pendant 5 min (200 x g, 4 oC). Jeter le supernatant, resuspendre les cellules dans 1 ml/batch de milieu de congélation, 1,5 x 106 cellules/batch et cryoconserver les lots dans de l'azote liquide.

3. Différenciation des cellules HepaRG (Jour 0-21) (Figure 1A)

  1. Jour 0. Cellules d'hépaRG de semences à faible densité (2,5 x 104 cellules/cm2) dans des plats traités par la culture avec un volume approprié de milieu de prolifération (Figure 1B). Deux plats doivent être plats pour chaque analyse (coloration huile rouge O, analyse FACS, qPCR): un pour les cellules témoins et un pour les cellules traitées à l'oléate. Si vous effectuez des mesures CARS (étape 8), ensemencez les cellules en parallèle dans des plats transparents à fond de verre. En tant que contrôle, récoltez un plat non traité (cellules proliférantes Jour 0) pour effectuer l'analyse de l'expression génique des gènes marqueurs de différenciation (voir l'étape 3.6).
  2. Jour 2 et Jour 4. Changer le milieu avec un volume approprié de milieu de prolifération et laisser les cellules se développer jusqu'à la confluence.
  3. Jour 7. Les cellules doivent être 100% confluentes (figure 1C). Laver les cellules une fois avec 1x saline tamponnée par phosphate (PBS). Retirez 1x PBS et ajoutez un volume approprié de milieu de différenciation.
  4. Jour 8, 9, 12, 15, 18.  Laver les cellules une fois avec 1x PBS. Retirez 1x PBS et ajoutez un volume approprié de milieu de différenciation.
  5. Jour 21. Observez les cellules HepaRG au microscope et assurez-vous que les cellules sont des cultures différenciées confluentes (Figure 1D).
  6. En tant que témoin, récoltez un plat témoin (cellules différenciées Jour 21) pour effectuer l'analyse de l'expression génique (étape 7) des gènes marqueurs de différenciation (Figure 1E).
  7. Au jour 21, les cellules HepaRG différenciées peuvent être cryoconservées en azote liquide.

4. Induction de la stéatose vésiculaire (Jour 21-26)

  1. Jour 21. Diluer l'oleat de sodium (100 mM) avec un volume approprié de milieu de différenciation complète à une concentration finale de 250 M (1:400). Ajouter 99 % de méthanol 1:400 (même volume que celui de l'oleat de sodium) dans un autre aliquot de milieu de différenciation pour faire le traitement de contrôle du véhicule. (Par exemple : ajouter 25 l d'oleat de sodium à 10 ml de milieu et ajouter en parallèle 25 l de 99 % de méthanol à 10 ml de milieu). Laver les cellules une fois avec 1x PBS et ajouter le véhicule ou le milieu oleate de sodium.
  2. Jour 23 et Jour 25. Changer le milieu avec un volume approprié de milieu fraîchement préparé comme à l'étape 4.1.
  3. Jour 26. Observez au microscope optique que les gouttelettes lipidiques s'accumulent dans les cellules traitées à l'oleat de sodium et sont facilement visibles sous forme de gouttelettes translucides dans le cytoplasme comme dans la figure 2A.

5. Évaluation de la surcharge de lipide et de l'induction de stéatose : Rouge d'huile O Staining

  1. Laver les cellules une fois avec 1x PBS et enlever 1x PBS complètement.
  2. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (dilué en 1x PBS) et couver pendant 15 min à RT.
    MISE EN GARDE: Le paraformaldéhyde est toxique, de sorte que cette étape doit être effectuée dans une hotte de fumée, avec un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire, et un masque.
  3. Enlever le paraformaldéhyde et laver les cellules deux fois avec 1x PBS. Les cellules peuvent être conservées en 1x PBS à 4 oC pendant quelques jours avant la coloration. Envelopper de parafilm et recouvrir de papier d'aluminium pour empêcher les cellules de sécher.
  4. Supprimer 1x PBS. Incuber les cellules avec 60% d'isopropanol pendant 5 min à RT.
  5. Enlever l'isopropanol et laisser sécher complètement les cellules à RT.
  6. Ajouter la solution de travail Oil Red O et incuber à RT pendant 30 min. Le volume de la solution de travail requise pour chaque échantillon correspond au volume de supports utilisés pour la culture des cellules.
  7. Retirez la solution Oil Red O et ajoutez immédiatement ddH2O. Lavez les cellules 4 fois avec ddH2O.
  8. Acquérir des images au microscope pour analyse (Figure 2B).
  9. Pour éliter huile Rouge O colorant: enlever toute l'eau et laisser sécher; ajouter 1 mL d'isopropanol à 100% et incuber pendant 10 min avec des secousses douces à RT.
  10. Pipet l'isopropanol avec l'huile élunée Rouge O colorant de haut en bas à plusieurs reprises, en veillant à ce que tout le pétrole rouge O est dans la solution. Transférer la solution dans une cuvette. Mesurer OD500 nm par spectrophotométrie et utiliser 100% isopropanol comme blanc (Figure 2C).

6. Évaluation de la surcharge lipidique et de l'induction de stéatose : teinture de Bodipy et analyse cytofluorimétrique

  1. Laver les cellules une fois avec 1x PBS. Incuber avec 100 nM de Bodipy dilué en 1x PBS dans l'obscurité pendant 40 min à 37 oC. Un contrôle non taché doit être inclus dans les mesures de cytométrie du débit. À partir de ce point, protégez les échantillons de la lumière autant que possible.
    REMARQUE: Le volume de la solution de coloration requise pour chaque échantillon correspond au volume de supports utilisés pour la culture des cellules.
  2. Enlever la solution de coloration et laver les cellules une fois avec 1x PBS. Passez aux étapes 6.3-6.6. pour l'analyse DU CAE (Tri des cellules activée par fluorescence) ou à l'étape 6.7 pour l'imagerie au microscope.
  3. Gratter doucement les cellules avec 1x PBS et les transférer dans un tube de 15 ml. Centrifugeuse pendant 10 min (200 x g, 4 oC).
  4. Retirez délicatement les supernatants sans déranger les granulés et lavez-les avec 3 ml de 1x PBS. Centrifugeuse pendant 5 min (200 x g, 4 oC).
  5. Retirez les supernatants et suspendez-les en 300 OL de 1x PBS, puis transférez-les dans un tube FACS.
  6. Mesurer immédiatement l'intensité de la fluorescence de Bodipy par analyse cytofluorimétrique avec des longueurs d'onde d'excitation/émission de 505/515 nm (Figure 3A,B).
  7. Laver les cellules une fois avec 1x PBS et enlever PBS complètement.
  8. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (dilué en 1x PBS) et couver pendant 15 min à RT.
    MISE EN GARDE: Le paraformaldéhyde est toxique, de sorte que cette étape doit être effectuée dans une hotte de fumée, avec un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire, et un masque.
  9. Retirer le paraformaldéhyde et laver les échantillons 3x pendant 5 min dans PBS. Les cellules peuvent être conservées en 1x PBS à 4 oC ou images immédiatement (figure3C). Pour le stockage, envelopper de parafilm et couvrir de papier d'aluminium pour empêcher les cellules de sécher.

7. Évaluation de la surcharge lipidique et de l'induction de stéatose : qPCR

  1. Laver les cellules une fois avec 1x PBS. Gratter les cellules avec 1x PBS, centrifugeuse à 200 x g, et jeter le supernatant. À cette étape, les cellules peuvent être récoltées à -80 oC ou traitées comme à l'étape 7.2.
  2. Effectuer l'isolement total de l'ARN par des méthodes standard en utilisant des réactifs commerciaux suivant les instructions du fabricant.
  3. Évaluer la concentration d'ARN par mesure spectrophotométrique UV, en veillant à ce que la pureté de l'ARN soit élevée (près de 2,0) sur la base de la lecture A260/A280.
  4. Synthétiser l'ADNc à partir de 1 g d'ARN total avec un kit de synthèse cDNA standard.
  5. Diluer l'ADNc à un volume final de 50 L avec H2O.
  6. Analyser chaque échantillon d'ADNc en triplicate par qPCR : préparer un mix maître qPCR (tableau 1) qui est suffisant pour les réactions nécessaires pour chaque amorce, y compris les amorces spécifiques pour les trois gènes d'entretien ménager comme témoins : gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), actinB et ribosomal 18S (voir Tableau des matériaux pour les séquences d'apprêt):
  7. Distribuer 18 l de mélange maître par puits dans une plaque multi-murs PCR.
  8. Ajouter 2 ll d'échantillon d'ADNc dans chaque puits. Scellez l'assiette.
  9. Exécutez les échantillons selon l'instruction thermale Cycler.

8. Évaluation de la surcharge lipidique et de l'induction de stéatose : CARS

  1. Fixez les cellules préalablement préparées sur des plats à fond de verre, comme décrit dans les étapes 5.1-5.3.
  2. Allumez un système laser pulsé picoseconde réglable commerciale, l'accordant pour obtenir deux sorties de longueurs d'onde différentes. La différence de fréquence entre les sorties doit être de 2 840 cm-1 pour générer le signal lumineux intense CARS correspondant à l'étirement symétrique du méthylène; pour une sortie à longueur d'onde fixe à 1 064 nm (lumière « Stokes »), l'autre longueur d'onde doit être réglée à 817 nm (lumière de la pompe).
  3. S'assurer que la sortie de 817 nm est spatialement et temporellement superposée à la sortie de 1 064 nm : utiliser un miroir dichroïque approprié (c.-à-d. avec une coupe entre 817 et 1 064 nm) pour combiner spatialement les faisceaux et utiliser une ligne de retard optique pour obtenir un chevauchement temporel du laser Impulsions.
  4. S'assurer que les deux faisceaux de copropagating sont à la fois collimated et que leurs diamètres ont des valeurs similaires qui sont appropriées pour le système optique dans le microscope qui les concentrera sur l'échantillon; si nécessaire, collimatez séparément les poutres devant le miroir dichroïque qui les combine.
  5. Allumez un système commercial de microscope inversé, qui devrait inclure une unité de balayage laser infrarouge et une unité de détection d'épi rouge/vert à double canal et aligner les faisceaux laser de copropagating dans l'unité de balayage.
  6. Ouvrir l'unité de détection d'épi à double canal, retirer le cube de filtre et remplacer son filtre de détection de longueur d'onde rouge par un filtre de bande qui peut sélectionner le signal 2 840 cm-1 CARS qui est centré à 663 nm pour la pompe 817/1 064 nm/Stokes excitation combine. Un filtre à bande passante étroite (20 nm) est préférable pour éviter la collecte de niveaux élevés de signaux fluorescents.
  7. Placez un plat sur la scène du microscope CARS inversé, et en utilisant un objectif d'immersion d'huile 100x, déplacez la position verticale de l'objectif pour se concentrer sur les cellules.
  8. Configurez le logiciel de microscope pour collecter des images à haute résolution (1024 x 1024 pixels) sur un champ de vision s'étendant sur 127 m x 127 x 127 m.
  9. Définiz le logiciel de microscope pour acquérir et afficher en permanence des images du champ de vision de 127 x 127 m et vérifiez les images affichées tout en optimisant les paramètres de la collection d'images. Assurez-vous que les pouvoirs laser sont équilibrés pour une collecte d'images rapide et des dommages minimes, en insérant des filtres de densité neutre appropriés dans les chemins de faisceau au besoin, et sélectionnez un temps d'habiter pixel qui permet la collecte d'images avec un bon signal au bruit dans les conditions de puissance laser sélectionnées.
  10. Acquérir et enregistrer des images de plusieurs champs de vision différents dans le plat dans les conditions optimisées. En option, les images de fluorescence multiphoton, générées par une émission de longueur d'onde verte (principalement à partir d'excitation à deux photons à 817 nm), peuvent être recueillies simultanément par l'autre détecteur d'épi. Répétez les étapes 8.7-8.10 pour chaque plat.
  11. Pour l'analyse d'images CARS, traiter les images à l'aide de la mise en œuvre DE L'ImageJ par LE FIJI. Exploitez la fonction Despeckle (ou un outil de dénoisation similaire) sur chaque image avant une analyse plus approfondie afin d'améliorer les rapports signal-bruit sans perte de détail.
  12. Utilisez FIJI pour sélectionner manuellement les cellules, puis comptez automatiquement les gouttelettes lipidiques dans les cellules individuelles segmentées pour produire des statistiques sur les zones et les nombres de gouttelettes lipidiques pour chaque cellule et pour l'ensemble des données d'image pour chaque plat.

9. MTT Cell Viability Assay

  1. La plaque a différencié des cellules d'HépaRG dans une plaque de 96 puits avec une densité de 1 x 105 cellules/puits dans un volume final de 100 L de milieu de culture de différenciation.
  2. 24 h après l'ensemencement, traiter les cellules avec 99% de méthanol (véhicule) et avec 100 M, 250 M et 500 M d'oleate de sodium et de palmitate de sodium dilué dans 100 'L de culture de différenciation moyenne /bien en tripler.
  3. Changer le milieu avec 99 % de méthanol et avec 100 M, 250 M et 500 M d'oleat de sodium et de palmitate de sodium dilués dans 100 L de culture de différenciation moyenne/bien toutes les 24 h.
  4. 96 h après le traitement au méthanol/oleatde de sodium/palmitate de sodium, traiter les cellules avec 2 M doxorubicine diluée dans 100 L de culture de différenciation moyenne/bien en triplicate comme un contrôle.
  5. 18 h après traitement à la doxorubucne, changer le milieu avec 100 l de milieu de culture de différenciation.
  6. Pipet 20 l de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium réagent MTT (Table of Materials) dans chaque puits de la plaque d'analyse 96-bien contenant les cellules en 100 'L de culture moyenne de culture différente . Inclure un contrôle de fond en pipetting 20 'L de réactif dans un puits de contrôle sans cellules dans 100 'L de milieu de culture de différenciation dans le triple.
  7. Incuber la plaque à 37 oC dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO 2.
  8. Après avoir incubé pendant 30, 60 et 90 min avec le réactif Tetrazolium MTT, enregistrez l'absorption à 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaque de 96 puits. Soustrayez l'absorption de fond des puits de contrôle sans cellules des valeurs d'absorption pour les autres échantillons.

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Résultats

Ce protocole décrit une méthode efficace pour induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans les cellules HepaRG différenciées d'IllSO par le traitement de l'oleatde de sodium (figure 1A).

Différenciation des cellules HepaRG.
Pour induire efficacement la différenciation, les cellules proliférantes doivent être ensemencées à faible densité (2,5 x 104 cellules/cm2) dans le milieu de prolifération. Lors...

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Discussion

Ce protocole décrit comment différencier les cellules HepaRG et comment induire la stéatose vésiculaire par traitement à l'avoine de sodium (Figure 1A). En effet, par rapport à d'autres lignées cellulaires du carcinome hépatocellulaire humain (HCC), la lignée cellulaire HepaRG présente des caractéristiques d'hépatocytes humains adultes, représentant une alternative précieuse aux hépatocytes humains primaires cultivés ex vivo13,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions le prof. Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, France), qui a gentiment fourni des cellules HepaRG. Nous sommes reconnaissants à Rita Appodia pour son aide administrative. Ce travail a été soutenu par MIUR-Ministero dell'istruzione, dell'università e della ricerca (FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC) et Sapienza University of Rome (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hyclone HyClone Clone fœtal II  ;GE HealthcareSH30066
William' s E medium avec GlutaMAX  ;Thermofisher32551087
Pénicilline/streptomycine  ;SIGMAP4333
Insuline  ;SIGMAI9278
Hémisuccinate d’hydrocortisoneSIGMAH2270
DMSO, sulfoxyde de diméthyleSIGMAD2438  ;   ;   ;
Oléate de sodiumSIGMAO7501  ;
MéthanolSIGMA179337
IsopropanolSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Solution de formaldéhydeSIGMA252549
ARNase libre DNAseIPromegaM198A  ;
Plats à fond de verreWillco WellsGWST-5040
Oil Red solutionSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega  ;G3582
q-PCR nom de l’oligoSequence
ACACB FORCAAGCCGATCACCAAGAGTAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG
&beta ;-actin FORGCACTCTTCCAGCCTTCCT
&beta ;-actin REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMINE POURTGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMINE REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCATCATC
ALDOB POURGCATCTGTCAGCAGAATGGA  ;
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  ; CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 POURCTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTTTCAG
CPT1A POURTCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 POURTTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 POURCTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC
GPAM POURTCTTTGGGTTTGCGGAATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 POURCCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 POURACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAAGGAACATACACG
PLIN2 POURTTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 POURAATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAACGAACGAAGTAGC
SCD POURTCTAGCTCCTATACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCTCCTCC
SLC2A1 POURTGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTCTCCTTCCTTCATCTCTC
18S POURCGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Références

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