Un protocole pour préparer les cultures de tranches flottantes à partir du cerveau humain adulte est présenté. Le protocole est une variante de la méthode de culture de tranches largement utilisée à l'aide d'inserts membranaires. Il est simple, rentable et recommandé pour les essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge.
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Article de méthode
Cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Organotypic, ou cultures de tranche, ont été largement employés pour modéliser des aspects du système nerveux central fonctionnant in vitro. Malgré le potentiel des cultures de tranches en neurosciences, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, en particulier celles des sujets humains. L'utilisation de tissus humains adultes pour préparer les cultures de tranches est particulièrement attrayante pour améliorer la compréhension des neuropathologies humaines, car elles contiennent des propriétés uniques typiques du cerveau humain mature manquant de tranches produites à partir de rongeurs (généralement néonatales) tissu nerveux. Ce protocole décrit comment utiliser les tissus cérébraux recueillis auprès de donneurs humains vivants soumis à une chirurgie réséctive du cerveau pour préparer des cultures de tranches à court terme et flottantes. Des procédures pour maintenir et effectuer des essais biochimiques et de biologie cellulaire utilisant ces cultures sont également présentées. Les résultats représentatifs démontrent que le lamination corticale humain typique est préservé en tranches après 4 jours in vitro (DIV4), avec la présence prévue des principaux types de cellules neurales. En outre, les tranches de DIV4 subissent une mort cellulaire robuste lorsqu'elles sont confrontées à un stimulus toxique (H2O2), indiquant le potentiel de ce modèle pour servir de plate-forme dans les tests de mort cellulaire. Cette méthode, une alternative plus simple et rentable au protocole largement utilisé utilisant des inserts membranaires, est principalement recommandée pour exécuter des essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge. Enfin, bien que le protocole soit consacré à l'utilisation de tissus corticaux prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal, on fait valoir que les tissus prélevés dans d'autres régions ou conditions cérébrales devraient également être comme sources pour produire des cultures de tranches flottantes similaires.
Introduction
L'utilisation d'échantillons humains dans la recherche est sans équivoque une excellente option pour étudier les pathologies du cerveau humain, et les techniques modernes ont ouvert de nouvelles voies pour l'expérimentation robuste et éthique en utilisant des tissus dérivés du patient. Des méthodes comme les cultures organotypic/slice préparées à partir du cerveau humain adulte ont été de plus en plus employées dans des paradigmes tels que l'optogénétique1, l'électrophysiologie2,3,4,5, plasticité 6
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Protocole
Des tissus cérébraux adultes vivants ont été obtenus à partir de patients subissant une neurochirurgie réséctive pour le traitement de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal(figure 1A). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital des cliniques de l'école de médecine De Ribeiro Preto (17578/2015), et les patients (ou leur personne responsable légale) ont accepté et signé les conditions du consentement éclairé. La collecte du tissu a été effectuée par l'équipe de neurochirurgie du Centre de chirurgie de l'épilepsie (CIREP - Cliniques Hospital à la Preto Medical School de Ribeiro, U....
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Résultats
Un aspect critique pour évaluer la qualité et la santé des tranches cultivées est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales, des neurones, et des cellules gliales prévus. L'architecture typique du lamination corticale humain a été observée dans une tranche à DIV4, révélée par l'immunolabeling neuronal (Figure 2D). De plus, on a également observé la présence prévue de microglies et d'astroglia(figure 2B,C).
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Discussion
Ce protocole pour la production de cultures de tranches flottantes et à court terme est une méthode alternative pour la culture de tranches néocorticales humaines adultes. Un tel protocole pour les cultures de tranches peut être propice aux études sur (mais pas limité à) l'optogénétique1,44,45, l'électrophysiologie2,3,4,5
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail est soutenu par FAPESP (Grant 25681-3/2017 à AS), CAPES (Bourse postdoctorale PNPD/INCT-HSM à A.F. et Bourse prédoctorale à N.D.M.) et FAEPA. G.M.A. est titulaire d'une maîtrise du FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. est titulaire d'une bourse de recherche du CNPq. Nous remercions les patients et leurs familles d'avoir fait don des tissus réséqués pour cette étude. Nous tenons à souligner le soutien des résidents, des infirmières, des techniciens et de l'équipe du CIREP, de l'hôpital clinique de l'École de médecine Ribeiro Preto, université de Sao Paulo, qui ont aidé à diverses étapes du processus.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide, solution à 30 % | Sigma Aldrich | A3449 ; | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Persulfate d’ammonium | Sigma | A3678-25G | |
| Amphotéricine B | Gibco | 15290-018 | |
| Anticorps anti-ERK 2 (lapin) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1 000 in BSA 2,5 % |
| Anticorps anti-pERK (souris) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1 000 dans BSA 2,5 % |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Bradford 1x Réactif de colorant | BioRad | 500-0205 | |
| EDTA | Sigma | T3924 | Utilisé dans le tampon RIPA |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Sels équilibrés de Hank | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Acide chlorhydrique | Merck | 1003171000 | |
| Peroxyde d’hydrogène (H2O2) | Vetec | 194 | |
| IgG de souris, AB entier lié à la HRP (anti-souris) | GE | NA931-1ML | |
| NaCl | Merck | 1064041000 | Utilisé dans le tampon RIPA |
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| Lait écrémé en poudre (Molico) | Nestlé ; | Utilisé pour le blocage membranaire | |
| Tampon PBS pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
| Péniciline/Streptomicine | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Chlorure de potassium | Merck | 1049361000 | |
| Prime Western Blot Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| Rabbit IgG, HRP Linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
| FDS | Sigma | L5750 | Utilisé dans le tampon RIPA |
| TEMED | GE | 17-1312-01 | |
| Bromure de tétrazolium de bleu de thiazolyle (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
| Tris | Sigma | T-1378 | Utilisé dans le tampon RIPA |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Utilisé dans le tampon RIPA |
| Eau ultrapure | Millipore | Eau stérile, dérivée du système de purification d’eau MiliQ | |
| Equipment and Material | |||
| 24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
| Amersham Potran Premium (membrane nitrocellulosique) ; | GE | 29047575 | |
| Carbogen Mixture White | Martins | 95 % O2, 5 % CO2 CO2 | |
| Incubateur | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation de tranches 5 % CO2, 36º ; C |
| Lecteur de microplaques | Dispositifs moléculaires Microtubes | ||
| Greiner | 001608 | Microtube de 1,5 mL | |
| Pilon motorisé | Kimble Chase | ||
| Cuillère | Taille d’une cuillère à dessert | ||
| Lame de rasoir | Bic | Chrome Platinum, utilisée pour trancher avec vibratome | |
| Lame | de scalpelBecton Dickinson (BD) | Numéro 24 | Utilisé pour le tranchage des tissus ; superglue recommandée de même taille ou plus petite |
| (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition : Etilcianoacrilato ; acide 2-propénoïque ; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol ; homopolymère | |
| Vibratome ; | Leica | 14047235612 - VT1000S | |
| Nom du matériau/ de l’équipement pour l’immunohistochimie | |||
| Anticorps anti-NeuN (souris) | Millipore ; | MAB377 | Dilution 1:1 000 dans le tampon phosphate |
| Anticorps anti-GFAP (souris) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1 000 dans le tampon phosphate |
| Anticorps anti-IBA1 (lapin) | Abcam | EPR16588 - ab178846 | Dilution 1:2 000 dans le tampon phosphate |
| Anticorps IgG anti-souris biotinylé (H+L) | Vecteur | BA-9200 | |
| DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
| Entellan | Merck | 107960 | |
| Éthanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| Gélatine Synthé | 00G1002.02.AE | Utilisé pour le revêtement des lames | |
| Microtome | Leica | SM2010R | Équipé d’une platine de congélation (BFS-10MP, Physiotemp), réglée sur -40º ; C |
| Sérum d’âne normal | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Lapin IgG, AB entier lié à la HRP (anti-lapin) | GE | NA934-1ML | |
| Lames (Star Frost) | Knittel Glaser | Lames enduites de gélatine | |
| Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
| Vectastain ABC HRP Kit (Peroxydase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
| Xylène | Synth | 01X1001.01.BJ |
Références
- Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
- Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophy....
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Réimpressions et autorisations
