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Article de méthode

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

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DOI :

10.3791/59859

⸱

16 octobre 2019

 , 
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Senior Adviser's Office, Center for Brain Science, RIKEN

Dans cet article

Résumé

Chez certains animaux manipulés par des gènes, l'utilisation d'un seul protocole peut ne pas induire la Ltd dans les cellules cérévelaires de Purkinje, et il peut y avoir un écart entre la LTD et l'apprentissage moteur. Plusieurs protocoles sont nécessaires pour évaluer l'induction de LTD chez les animaux manipulés par des gènes. Les protocoles standard sont affichés.

Résumé

La plasticité synaptique fournit un mécanisme d'apprentissage et de mémoire. Pour l'apprentissage moteur cérévelaire, la dépression à long terme (LTD) des transmissions synaptiques des fibres parallèles (PF) aux cellules de Purkinje (PC) est considérée la base pour l'apprentissage de moteur, et les insuffisances de LTD et d'apprentissage de moteur sont observées dans divers animaux manipulés par des gènes. Des ensembles communs d'apprentissage de moteur, tels que l'adaptation du réflexe optokinetic (OKR), le réflexe vestibulaire-oculaire (VOR), et l'essai de rotarod ont été employés pour l'évaluation de la capacité d'apprentissage de moteur. Cependant, les résultats obtenus à partir du termininus gluA2-carboxy modifié knock-in souris ont démontré l'adaptation normale du VOR et de l'OKR, en dépit de l'absence de PF-LTD. Dans ce rapport, l'induction de ltd a été essayée seulement utilisant un type de protocole de stimulation à la température ambiante. Ainsi, les conditions pour induire le LÉve de cervelateur ont été explorées dans les mêmes mutants knock-in utilisant divers protocoles à la température physiologique proche. Enfin, nous avons trouvé des protocoles de stimulation, par lesquels la LTD pourrait être induite chez ces souris manipulées par les gènes. Dans cette étude, un ensemble de protocoles sont proposés pour évaluer l'induction de LTD, qui permettra plus précisément l'examen de la relation causale entre LTD et l'apprentissage moteur. En conclusion, les conditions expérimentales sont cruciales lors de l'évaluation de la LTD chez les souris manipulées par des gènes.

Introduction

L'organisation synaptique des réseaux neuronaux élaborés du cortex céréco-rebelle, composé de PC, d'interneurons de couche moléculaire (cellules de panier et de stellate), de cellules de Golgi, de PFdes des cellules granules, de fibres moussues et de fibres d'escalade (CFs), ont été élucidées en termes d'excitation/inhibition et de divergence/convergence, et le diagramme de circuits bien organisé a suggéré que le cervelet est une « machine neuronale »1,bien qu'il n'y ait aucune idée auparavant du but de cette « machine ». Plus tard Marr a proposé que l'entrée des PC aux PC constituent un réseau d'apprentissage associatif à trois couches2. Il a également suggéré que chaque FC transmette une instruction cérébrale pour le mouvement élémentaire2. Il a supposé que l'activation simultanée des PF set et des CF augmenterait l'activité de synapse de PF-PC, et causerait la potentialisation à long terme (LTP) de la synapse de PF-PC. D'autre part, Albus a supposé que l'activation synchrone des PF et des FC a entraîné l'ILD aux synapses PF-PC3. Les deux études ci-dessus interprètent le cervelet comme un dispositif de mémoire unique, dont l'incorporation dans le réseau cortical cérécolar conduit à la formation du modèle de machine d'apprentissage Marr-Albus.

Suivant ces prédictions théoriques, deux lignes de preuve suggèrent la présence de plasticité synaptique dans le cervelet. La première ligne de preuve a été suggérée par l'organisation anatomique du flocculus; ici les voies MF d'origine vestibulaire d'organe et les voies de CF d'origine rétinienne convergent sur les PC4. Ce modèle unique de convergence suggère qu'une plasticité synaptique se produisant dans le flocculus cause l'adaptabilité remarquable du réflexe vestibulo-oculaire. Deuxièmement, l'enregistrement de la réponse des PC dans le flocculus et le lésion du flocculus étayaient également l'hypothèse ci-dessus5,6,7. En outre, le modèle de décharge de PC pendant l'adaptation du mouvement de main d'un singe8 a soutenu l'hypothèse de plasticité synaptique, particulièrement Albus's LTD-hypothesis3.

Pour déterminer la nature de la plasticité synaptique directement, la stimulation conjonctive répétée (Cjs) d'un faisceau de PFets et le CF qui intériorise spécifiquement le PC in vivo a été montré pour induire LTD pour l'efficacité de transmission des synapses PF-PC9, 10,11. Dans les explorations in vitro suivantes utilisant une tranche de cervelateur12 et des PC cultivés, conjonction de la stimulation co-cultivée de cellules de granule et de stimulation de cellules d'olive13 ou conjonction du glutamate et somatique appliqués iontophoretically dépolarisation14,15 causé LTD. Le mécanisme de transduction de signal sous-jacent à l'induction LTD a également été intensivement étudié à l'aide de préparations in vitro16,17.

Les adaptations du VOR et de l'OKR ont souvent été utilisées pour l'évaluation quantitative des effets de manipulation des gènes sur l'apprentissage moteur céréreux, parce que le cortex vestibule-cérévelateur s'est avéré être l'origine essentielle de l'apprentissage adaptatif du VOR18 ,19,20 et l'OKR19,21 La corrélation entre l'échec de l'induction de LTD et l'affaiblissement de l'apprentissage moteur comportemental a été prise comme preuve que LTD joue un rôle essentiel dans le moteur mécanismes d'apprentissage22. Ces points de vue sont collectivement appelés l'hypothèse LTD de l'apprentissage moteur, ou Marr-Albus-Ito hypothèse23,24,25,26.

L'apprentissage adaptatif du mouvement des yeux a été mesuré à l'aide de protocoles similaires, tandis que diverses conditions expérimentales ont été utilisées pour induire ltd dans la préparation des tranches27,28,29,30,31 . Récemment, Schonewille et coll.26 ont signalé que certaines souris manipulées par des gènes ont démontré un apprentissage moteur normal, mais que les tranches de cérévelateur n'ont pas montré de LTD, et ont ainsi conclu que la Ltd n'était pas essentielle à l'apprentissage moteur. Cependant, l'induction de ltd n'a été tentée qu'en utilisant un type de protocole à température ambiante. Par conséquent, nous avons utilisé plusieurs types de protocoles ltd-induisant dans des conditions d'enregistrement à environ 30 oC, et nous avons confirmé que le LTD a été induit de façon fiable chez les souris manipulées par les gènes en utilisant ces protocoles à des températures physiologiques proches32.

Cependant, il reste quelques questions concernant les propriétés de base de la stimulation conjonctive. La première est la relation entre la forme de la pointe complexe et l'amplitude de LTD. Deuxièmement, en conjonction avec PF-stimulation et dépolarisation somatique, si le nombre de stimuli utilisés étaient nécessaires ou non était insaisissable. Dans la présente étude, ces questions ont été étudiées à l'aide de souris de type sauvage (WT).

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité RIKEN sur le soin et l'utilisation des animaux dans les expériences. Les souris ont été gardées dans les installations animales du RIKEN Center for Brain Science sous une température bien contrôlée (23-25 oC) et de l'humidité (45 % à 65 %) Conditions. Des souris mâles et femelles de WT (C57BL/6, 3-6 mois) ont été employées.

1. Préparation des solutions utilisées dans les expériences

REMARQUE: Toutes les solutions doivent être faites dans de l'eau ultrapure exempte de métaux (résistance à 18,2 M) et d'autres impuretés (carbone organique total (TOC) et 5,0 ppb). Le liquide céphalo-rachidien artificiel de travail (ACSF) pour couper et enregistrer les tranches sont fabriqués fraîchement le jour de l'expérience à partir d'un stock 10 fois (x10) d'ACSF. Bulle les solutions avec 5% CO2/ 95% O2 mélange de gaz avant utilisation. Le pH de l'ACSF est ajusté à 7,4 à 0,1, et l'osmolarité est ajustée de 315 à 5 mOsm/kg en ajoutant de l'eau ultrapure.

  1. Préparer 10x stock d'ACSF contenant 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4, et 260 mM NaHCO3. Cette solution peut être stockée à 4 oC.
  2. Préparer l'ACSF de travail contenant 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 et 20 mM de glucose.
    1. Tout d'abord, ajouter 1 ml de 2 M CaCl2 solution suivie de 1 ml de 1 M Mg2SO4 solution dans environ 800 mL d'eau ultrapure, pour éviter les précipitations. Ajouter ensuite 100 ml de 10x ACSF et glucose. Enfin, faire jusqu'à un volume total de 1000 ml en ajoutant de l'eau ultrapure.
  3. Préparez 3,3 % d'agar pour la manipulation du cerveau. Dissoudre 1 g d'agar dans 30 ml de solution NaCl de 0,9 % et chauffer au micro-ondes jusqu'à ébullition. Remuer pour mélanger, puis verser dans une boîte stérile en plastique de 4 cm x 10 cm et laisser se solidifier. Conserver la plaque d'agar(épaisseurde 8 mm) dans un réfrigérateur.
  4. Préparer la solution interne.
    1. Préparer la solution interne à base de K-contenant 60 mM KCl, 60 mM K-gluconate, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP et 30 mM HEPES (pH 7,2).
      REMARQUE: Une faible concentration (0,3 mM) d'EGTA, un ca2-chelator lent, est ajoutée au chélate possiblement contaminé Ca2 dans l'eau pure, mais cette faible concentration d'EGTA dans la solution interne ne bloque jamais l'induction de LTD (Figure 3, Figure 4, Figure 5) lors de l'enregistrement à cellule entière. La pression osmotique mesurée est de 285 mOsm/kg.
    2. Préparer la solution interne à base de Cs-CsCsCl, 46 mM D-gluconate, 27 mM de chlorure de tétraéthylammonium (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP et 30 mM HEPES (pH 7,2, ajusté à l'aide de CsOH).
      REMARQUE: Cs-blocks tension-dependent K-channels, and improves space-clamp conditions at remote dendrites by increasing the length-constant. La pression osmotique mesurée est de 285 mOsm/kg.
    3. Préparer 200 aliquots L des solutions et stocker à -30 oC.

2. Dissection du cerveau et découpage

  1. Refroidir et oxygéner deux béchers de 50 ml d'ACSF sur la glace jusqu'à ce que la température soit inférieure à 4 oC. Ajouter 50 l de tétrodotoxine (TTX, 1 mM) dans l'un des béchers glacés de l'ACSF et réserver pour couper les tranches. Pour obtenir la tranche de cervelateur de souris réservant la capacité ltd-induisant, l'addition de TTX à l'ACSF normal est nécessaire.
  2. Refroidir le plateau de spécimens en métal en remplissant une zone de bain de glace de la chambre de tranchage avec de la glace.
  3. Verser 1 ml d'isoflurane dans un bocal anesthésiant(1000ml) puis y placer une souris pendant 30 à 45 s. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésiée en confirmant son incapacité à répondre à la stimulation mécanique.
  4. Décapiter la souris à l'aide de ciseaux chirurgicaux. Tenez la tête et coupez la peau superficielle le long de la ligne médiane à l'aide d'un ciseau ophtalmologique. Tirez la peau en tenant avec les doigts pour exposer largement la surface du crâne.
  5. Couper le crâne horizontalement le long d'une ligne du trou spinocerebellar majeur juste au-dessus de l'oreille et l'œil à l'aide d'un ciseaux ophtalmologiques. Couper le crâne le long d'une ligne au-dessus des deux yeux et enlever pour isoler le crâne.
  6. Couper le cerveau au milieu du cerveau à l'aide d'un scalpel, puis isoler la partie caudale du cerveau, y compris le cervelet du crâne. Plongez-le dans un bécher glacé de l'ACSF. Habituellement, le temps total de la décapitation à l'immersion du bloc cérébral dans le bécher pré-réfrigéré de l'ACSF devrait être inférieur à 60 s.
  7. La position des tubes bouillonnants doit être ajustée afin de ne pas remuer le bloc cérébral dans le bécher. Les dommages mécaniques peuvent causer un gonflement de la tranche pendant l'enregistrement. Laissez-le pendant au moins 7 min et laissez le cerveau refroidir.
  8. Pour couper le bloc cérébral, couper un morceau d'agar rectangulaire (2 cm x 2 cm) d'une grande plaque d'agar (4 cm x 10 cm, stockée à 4 oC) et le mettre sur un papier filtre pour absorber l'excès de liquide.
  9. Tourner la pièce d'agar à l'envers sur le papier filtre, puis placer le morceau d'agar sur un papier filtre sur un plateau de spécimen sépar (16 cm x 20 cm). Ramassez le bloc cérébral à l'aide d'une spatule et absorbez le liquide excessif autour d'elle avec un morceau de papier filtre.
  10. Montez le bloc de cerveau sur le bloc d'agar utilisant la colle (adhésif instantané de cyanoacrylate médical). Assurez-vous d'attacher le fond (côté ventral) du bloc cérébral à l'agar.
  11. Découper l'hémisphère droit avec une lame. Assurez-vous que le côté du plan de coupe est aussi parallèle que possible au plan dendritique du PC parce que ce côté est attaché à la surface du plateau du spécimen. Couper et enlever l'autre côté de l'hémisphère. Ensuite, couper le cerveau entre le colliculi supérieur et inférieur, et couper la moelle épinière.
  12. Coller le côté droit du cervelet garni avec le bloc d'agar sur le plateau de spécimen pré-réfrigéré. Étendre l'excès de colle autour du cervelet avec la partie plate d'une spatule, pour empêcher l'excès de colle de se fixer à la surface du cervelin. Inclinez le plateau métallique et versez ACSF afin de fixer la colle et laver l'excès de colle.

3. Découpage du cerveau

  1. Orientez l'échantillon de telle sorte que le côté dorsal du cervelet se trouve sur le côté avant. Verser la coupe à froid ACSF, contenant 1 M TTX, suffisante pour immerger complètement le cervelet. Placez un tube de gaz dans l'ACSF et commencez à bouillonner avec le mélange de gaz O2/CO2.
  2. Retirer le mater arachnoïdien à l'aide d'une pince fine sous des jumelles. Couper le pédoncule céréveleux avec une lame, et enlever le tronc cérébral et le bloc d'agar. Faites pivoter le plateau à 180 degrés, de sorte que la surface dorsale du cervelet fait face à une lame de rasoir.
  3. Réglez la lame et ajustez le premier emplacement de coupe. Définiz les paramètres de tranchage vibratome à ce qui suit : amplitude à 5,5, fréquence à 85 Hz, vitesse à 3-4, et épaisseur de tranche à 300 m.
  4. Transférer la tranche de cervelateur sur un filet de nylon dans un incubateur en acrylique et immerger complètement la tranche dans l'ACSF oxygéné. L'incubateur doit être placé dans un bain d'eau qui maintient une température à 26 oC.
  5. Conserver les tranches pendant au moins 1 h pour permettre la récupération des dommages lors du découpage.

4. Enregistrement patch-clamp à cellules entières

REMARQUE: Un enregistrement patch-clamp nécessite l'équipement suivant : un microscope droit avec contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC) optique, un amplificateur de patch-clamp, un numériseur de données, un stimulateur numérique, un isolateur, un ordinateur, un logiciel pour l'acquisition de données et l'analyse, manipulateur motorisé, plate-forme de microscope, table d'isolation de vibration, cage de Faraday, système de chauffage de solution, pompes péristaltiques et puller d'électrode.

  1. Ajouter la picrotoxine (0,1 mM) à l'ACSF et le résoudre en utilisant l'ultra-soniation pendant 3 min.
  2. Perfild une chambre d'enregistrement avec picrotoxine-contenant, O2-CO2-saturéACSF à la vitesse de 2 ml/min. Maintenir la température de la chambre d'enregistrement à environ 30 oC.
  3. Faire une électrode d'enregistrement en tirant un capillaire en verre borosilicate avec filament (diamètre extérieur de 1,5 mm) à l'aide d'un puller à 4 pas. Le diamètre de la pointe doit être d'environ 1 m.
  4. Faire une électrode stimulante en tirant le même capillaire à l'aide de la tireuse avec 2 étapes, puis casser pour produire une pointe fine en frappant la pointe contre un bloc de fer sous un microscope binoculaire. Le diamètre final doit être de 3 à 5 m.
  5. Transférer la tranche de cervelateur dans la chambre d'enregistrement et la fixer avec un poids Pt avec des fils de nylon. Remplissez une électrode stimulante avec ACSF.
  6. Pour la stimulation des P, placez l'électrode stimulante à la surface de la couche moléculaire, à environ 50 m de la couche cellulaire de Purkinje.
  7. Pour la stimulation de la fibrose kystique, placez l'électrode stimulante au bas de la couche cellulaire de Purkinje (étapes 5.3, 5.4).
  8. Filtre KouCs- solution interne basée avec un filtre de 0,45 m. Utilisez un microchargeur pour remplir une électrode d'enregistrement avec 8 L de solution interne.
  9. Appliquer une faible pression positive sur l'électrode d'enregistrement avant de l'immerger dans l'ACSF. Sa résistance doit être de 2 à 4 M et le potentiel de jonction liquide doit être corrigé.
  10. Approchez le corps de cellules saines et lumineuses du PC avec l'électrode d'enregistrement. Poussez légèrement la surface de la cellule de Purkinje, arrêtez d'appliquer une pression positive, appliquez ensuite une pression négative jusqu'à ce qu'il forme un joint giga-ohm. Ensuite, établissez la configuration de l'ensemble des cellules à l'aide d'une pression négative.
  11. Maintenez le potentiel membranaire à -70 mV et appliquez une impulsion de -2 mV (durée, 100 ms) à 0,1 Hz pour surveiller la résistance aux entrées, la résistance en série et la capacité d'entrée, en continu. N'utilisez pas la compensation de résistance de série. Jetez les données lorsque la résistance de la série varie de plus de 15 %.

5. Induction de LTD

  1. Stimuler la couche moléculaire avec une impulsion (durée, 0,1 ms). Identifier les courants postsynaptiques PF-excitateur (EPSC) en appliquant un double stimulus d'impulsion (intervalle d'interspike (ISI) de 50 ms). Le PF-EPSC devrait montrer la facilitation de paire-impulsion et l'augmentation progressive de l'amplitude par rapport à l'augmentation de l'intensité de stimulation.
  2. Enregistrez la réponse d'essai du PF-EPSC en appliquant une seule impulsion à 0.1 Hz. Ajustez l'intensité du stimulus de sorte que l'amplitude EPSC évoquée est d'environ 200 pA. Évitez la contamination du courant par le canal ionique dépendant de la tension.
  3. Stimuler la fibrose kystique au bas de la couche cellulaire de Purkinje et identifier l'EPSC obtenu par l'activation des FC (en appliquant un double stimulus d'impulsion). Le CF-EPSC devrait montrer la dépression de paire-impulsion et une manière tout ou aucune selon l'augmentation de l'intensité de stimulation. Pour l'induction LTD, un seul stimulus doit être utilisé.
  4. Protocole LTD-induisant 1
    1. À l'aide d'une électrode contenant une solution interne basée sur KetK, appliquer un seul stimulus DE PF et un seul stimulus DE CF simultanément à 1 Hz pendant 5 min (300 impulsions) (Figure 1A).
  5. Protocole LTD-induisant 2
    1. À l'aide d'une solution interne à base deKet d'électrodes dans des conditions de pince sécurisanie, appliquer des stimuli PF doubles (ISI de 50 m) et un seul stimulus DE CF comme deuxième stimulus de PF coïncide avec les stimulus de CF à 1 Hz pendant 5 min (figure 1B).
  6. Protocole LTD-induisant 3
    1. À l'aide d'une électrode contenant une solution interne à base deCs-à base de tension dans des conditions de tension-clamp, appliquer un double PF-stimulus (ISI de 50 ms) et un seul pas de tension dépolarisant (-70 à 0 mV, 50 ms) au soma à 1 Hz pendant 3 min, de sorte que le deuxième PF-stimulus est équivalent au début de l'étape de tension dépolarisante (Figure 1C).
  7. Protocole LTD-induisant-4
    1. À l'aide d'une électrode contenant une solution interne à base deCs-dans des conditions de tension-clamp, appliquer les stimuli PF (5x à 100 Hz) et une seule étape de tension dépolarisante (-70 à 0 mV, 50 ms) au soma à 0,5 Hz pendant 3 min, simultanément (Figure 1D ).

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Résultats

Quatre protocoles ont été employés dans cette étude pour induire le CErebellar LTD. Dans les deux premiers protocoles (protocole 1 et 2), la conjonction de la stimulation PF et de la stimulation de la fibrose kystique a été appliquée dans des conditions de pince séminude. Dans les deux autres protocoles (protocole 3 et 4), la dépolarisation somatique a été remplacée par la stimulation de la fibrose kystique dans des conditions de tension-clamp. Des traces de tension ou de courant-traces pendant la stimulation conjonctive...

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Discussion

Différences entre les quatre protocoles

Dans les protocoles ltd-induisant 1 et 2, Cjs 300 fois à 1 Hz est suffisant pour induire le cervelateur LTD. La fréquence de stimulation des FC semblait être dans une gamme physiologique, parce que le taux de tir de pointe complexe chez les souris adultes alertes (P60) a été rapporté pour être 1.25 Hz36. Cependant, la stimulation des FC seule n'a pas causé de plasticité à long terme dans la synapse PF-CF, comme utilisé dans les prot...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions A. Oba pour son assistance technique. Cette recherche a été partiellement appuyée par Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 à K.Y.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AmplificateurMolecular Devices-AxonMulticlamp 700B
Capillaire en verre borosilicatéSutterBF150-110-10
NumériseurMolecular Devices-AxonDigidata1322A
Extracteur d’électrodeSutterModèle P-97
IsofluraneFUJIFILM Wako Pure Chemical26675-46-7
IsolateurA.M.P.I.ISOflex
Trancheuse linéaireDosaka EMPRO7N
MicroscopeNIKONEclipse E600FN
Pompe péristaltiqueGilsonMP1 Pompe
PicrotoxineSigma-AldrichP1675
Dessalinisateurpur Merck-MilliporeMilliQ 7000
Logiciel pour l’expérienceSonde moléculaire-AxonpClamp 10
Logiciel pour les statistiquesKyensLabKyPlot 5.0
StimulateurWPIDS8000
Régulateur de températureWarnerTC-324B
TétrodotoxineTocris1078
monocanal

Références

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