Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Résumé

Les îlots pancréatiques se composent de cellules endocriniennes avec des modèles distinctifs d'expression d'hormone. Les cellules endocriniennes montrent des différences fonctionnelles en réponse à des conditions normales et pathologiques. L'objectif de ce protocole est de générer des données de transcriptome de haute qualité à grande échelle de chaque type de cellules endocriniennes à l'utilisation d'une technologie de séquençage microfluidique à base de gouttelettes à une seule cellule. Ces données peuvent être utilisées pour établir le profil d'expression génique de chaque type de cellule endocrinienne dans des conditions normales ou spécifiques. Le processus nécessite une manipulation minutieuse, une mesure précise et un contrôle rigoureux de la qualité. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées pour la dissociation, le séquençage, et l'analyse de données des îlots pancréatiques humains. Les résultats représentatifs d'environ 20 000 cellules d'îlet sinispeules humaines démontrent l'application réussie du protocole.

Introduction

Les îlots pancréatiques libèrent des hormones endocriniennes pour réguler les niveaux de glucose dans le sang. Cinq types de cellules endocriniennes, qui diffèrent fonctionnellement et morphologiquement, sont impliqués dans ce rôle essentiel : les cellules de l'apo, produisent du glucagon, de l'insuline des cellules, de la somatostatine des cellules PP, du polypeptide pancréatique et de la ghréline^descellules de l'apo 1. Le profilage de l'expression génique est une approche utile pour caractériser les cellules endocriniennes dans des conditions normales ou spécifiques. Historiquement, l'ensemble du profilage de l'expression génique des îaux a é....

Protocole

1. Dissociation des islets humains

1. Obtenir des îlots humains isolés chez les donneurs d'organes de cadavre de l'un ou l'autre sexe, âgés entre 15 et 80 ans, sans maladies préexistantes, à moins que des îlots de donneurs ayant des données démographiques spécifiques ne soient nécessaires aux fins de l'étude.
   1. Après l'isolement, faire garder les îlots isolés dans l'installation de culture tissulaire pendant 2-3 jours chez le fournisseur. Il faut souvent plus d'un jour pour que les dommages causés par les islets deviennent visibles.
   2. Placer les îlots dans une bouteille et les immerger complètement dans le milieu de l'îlots. Acquiez-le au laborat....

Résultats

Le flux de travail de séquençage de l'ARN à cellule unique se compose de trois étapes : dissocier les îlots humains intacts en suspension à cellule unique, capturer les cellules individuelles à l'aide d'une technologie à base de gouttelettes et analyser les données DE l'ARN-seq (figure 1). Tout d'abord, les îlots humains acquis ont été incubés pendant la nuit. Les îlots intacts ont été examinés au microscope (Figure 2A). L'intégr.......

Discussion

Les technologies unicellulaires développées ces dernières années fournissent une nouvelle plate-forme pour caractériser les types de cellules et étudier l'hétérogénéité moléculaire dans les îlots pancréatiques humains. Nous avons adopté un protocole d'isolement microfluidique à base de gouttelettes unicellulaire et d'analyse de données pour étudier les îlots humains. Notre protocole a produit avec succès des données de séquençage de l'ARN à partir de plus de 20 000 cellules d'ists humains uniques avec des variations rela.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
30 et micro ; m Filtres de pré-séparation	Miltenyi Biotec	130-041-407	Filtre cellulaire
Lames à 8 chambres	Chemometec	102673-680	Lames de comptage Dell
Bioanalyseur Kit d’ADN haute sensibilité	Agilent	5067-4626	pour QC
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A9647	Milieu unicellulaire
Chrome Single Cell 3' Bibliothèque & Kit de billes de gel v2, 16 rxns	10X Genomics	120237	Réactifs unicellulaires
Chrome, cellule unique A Chip Kit v2, 48 rx (6 puces)	10X Genomics	120236	Puces microfluidiques
CMRL-1066	ThermoFisher	11530-037	Média complet d’îlot
EB Buffer	Qiagen	19086	Tampon d’élution
Eppendorf twin-tec PCR, 96 puits, bleu, semi-jupe	VWR	47744-112	Plaque d’émulsion Sérum
veau fœtal	ThermoFisher	16000-036	Milieu complet des îlots
humains	Prodo Labs	HIR	Isolés
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher	25030-081	Milieu complet des îlots
Nextera Kit de préparation de la bibliothèque d’ADN Nextera (96 échantillons)	Illumina	FC-121-1031	Bibliothèque réactifs de préparation
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)	Illumina	FC-404-2005	Séquençage de
la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	ThermoFisher	15140-122	Milieu complet des îlots de Langerhans
Qubit Kit d’ADNdb haute sensibilité	Life Technologies	Q32854	pour
QC Solution 18	Chemometec	103011-420	Essai de comptage cellulaire réactif
SPRISelect Reagent	Fisher Scientific	B23318	Perles de purification
Boîtes de culture tissulaire (10 cm)	VWR	10861-594	pour la culture d’îlots pancréatiques
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013	Solution de dissociation cellulaire
Zymo DNA Clean & Concentrateur-5, 50 réactions	VWR	77001-152	Colonnes de nettoyage de la bibliothèque

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