Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

Summary

L'immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.

Abstract

L'évaluation de microenvironnement du tissu intact pour l'analyse de l'infiltration cellulaire et de l'organisation spatiale est essentielle pour comprendre la complexité des processus de la maladie. Les principales techniques utilisées dans le passé comprennent l'immunohistochimie (IHC) et l'immunofluorescence (IF) qui permettent la visualisation des cellules comme un instantané dans le temps en utilisant entre 1 et 4 marqueurs. Les deux techniques présentent des lacunes, notamment des difficultés à colorer des cibles mal antigéniques et des limitations liées à la réactivité inter-espèces. Le CSI est fiable et reproductible, mais la nature de la chimie et la dépendance à l'égard du spectre de la lumière visible ne permettent d'utiliser que quelques marqueurs et rendent la colocalisation difficile. L'utilisation de IF élargit les marqueurs potentiels, mais repose généralement sur le tissu congelé en raison de l'autofluorescence tissulaire étendue après fixation formaline. La cytométrie de flux, une technique qui permet l'étiquetage simultané des épitopes multiples, abroge beaucoup des insuffisances de IF et iHC, cependant, la nécessité d'examiner des cellules comme une suspension de cellules simples perd le contexte spatial des cellules rejetant le biologique important Relations. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) ponts ces technologies permettant de phénotypage cellulaire multi-épitographié dans la formaline paraffine intégrée (FFPE) tissu tout en préservant l'architecture microenvironnement globale et spatiale relation des cellules dans le tissu intact non perturbé. Les fluorophores à haute intensité fluorescente qui se lient de façon covalente à l'épitotome tissulaire permettent de multiples applications d'anticorps primaires sans se soucier de la réactivité croisée spécifique des espèces par des anticorps secondaires. Bien que cette technologie ait été prouvée pour produire des images fiables et précises pour l'étude de la maladie, le processus de création d'une stratégie utile de coloration mfIHC peut être long et exigeant en raison de l'optimisation et la conception étendues. Afin de faire des images robustes qui représentent des interactions cellulaires précises in situ et d'atténuer la période d'optimisation pour l'analyse manuelle, présentés ici sont des méthodes pour la préparation des diapositives, l'optimisation des anticorps, la conception des multiplexes ainsi que des erreurs couramment rencontrés au cours du processus de coloration.

Introduction

La visualisation d'un microenvironnement intact de tumeur (TME) est essentielle en évaluant non seulement l'infiltration cellulaire dans les malignités pleines mais les interactions de cellules à cellules aussi bien. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) a émergé comme un outil efficace pour le phénotypage multi-antigène des cellules dans l'étude du cancer et des maladies associées^{1,2,3,4, 5,6,7}. Ceci, en combinaison avec de....

Protocol

Tous les travaux ont été approuvés par le comité d'examen interne de l'Université du Michigan.

1. Optimiser les anticorps primaires et la préparation des diapositives

1. Déterminer la concentration idéale d'anticorps pour le multiplexe à l'aide d'IHC conventionnel.
   1. Testez les anticorps pour le multiplexe par immunohistochimie conventionnelle manuelle (IHC)¹³.
   2. Utilisez des tissus spécifiques qui ont un type de cellules abondante pour chaque anticorps testé comme l'utilisation de tissu amygdale pour l'essai d'anticorps CD3.
   3. Utilisez la concentration de référence pour le CSI recommandée ....

Results

Le processus global d'obtention d'un analyse multiplexe de 7 couleurs suit un modèle répétitif. La figure 1 décrit le processus sous une forme schématique. Une fois les lames coupées et séchées ou reçues du laboratoire et cuites au four d'hybridation à 60 oC pendant 1 h, puis procéder à la déparaffinisation et à la réhydratation, fixer les lames en formaline à nouveau suivies d'une récupération d'antigène. Chaque tour de multiplexage commence à la récupération d'antigène et se termine à l'en.......

Discussion

Les spécimens intacts de tissu de la biopsie pleine de tumeur et de la résection chirurgicale restent les outils diagnostiques et prédictifs importants pour l'analyse de la maladie aussi bien que le pronostic patient. L'immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) est une technique nouvelle qui combine les avantages de l'immunohistochimie (IHC), de l'immunofluorescence (IF) et de la cytométrie de flux. Les méthodes précédentes pour sonder les cellules in situ ont permisl'évaluation des arrange.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 % éthanol	Fisher	HC8001GAL
70 % d’éthanol	Fisher	HC10001GL
95 % d’éthanol	Fisher	HC11001GL
Logiciel d’analyse	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade	Mountant ThermoFisher	P36961	ProLong
Diamond Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Couvertures	Fisher	12-548-5E
Lingette délicate	Kimberly-Clark	34120
Diluant fluorescent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal Diluant TSA
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 gouttes en TBST ou PBS
Boîte résistante à la chaleur	Tissue-Tek	25608-904	Boîte à lames en plastique-vert
Chambre humidifiée	Ibi Scientific	AT-12
Four d’hybridation	FisherBiotech
Stylo barrière hydrophobe	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra poste de travail de pathologie quantitative
Micro-ondes	Panasonic	NN-A661S	avec technologie inverter
Formol tamponné neutre	Fisher Scientific	SF100-4	10 % neutre formol tamponné
pH 6 tampon de récupération d’antigène	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 tampon de récupération d’antigène	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Solution saline tamponnée au phosphate	Fisher	BP3994	PBS
Boîte à lames en plastique	Tissue-Tek	25608-906
Pellicule plastique	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primaire anticorps CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Anticorps primaire CD3	Dako	A0452	1:400
Anticorps primaire CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Anticorps primaire FOXP3	Dako	M3515	1:400
Anticorps primaire pancytokératine	Signalisation cellulaire	12653	1:500
Anticorps primaire-L1	Cellule Signalisation	13684	1:200
Anticorps secondaire	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Polymère opale
Set de coloration de lame	Microscopie	Sciences 6254001
Tris saline tamponnée	Corning	46-012-CM	TBS
Rack de lames vertical	Microscopie électronique Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher