L'objectif du protocole est d'illustrer les différents essais relatifs à l'entrée virale qui peuvent être utilisés pour identifier les inhibiteurs de l'entrée virale candidat.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les analyses antivirales qui examinent mécaniquement l'entrée virale sont pertinentes pour discerner à quelle étape les agents évalués sont les plus efficaces, et permettent l'identification des inhibiteurs d'entrée virales candidats. Ici, nous présentons les approches expérimentales pour l'identification de petites molécules capables de bloquer l'infection par le coxsackievirus A16 (CVA16) non enveloppé en ciblant les particules virales ou des étapes spécifiques dans l'entrée virale précoce. Les essais comprennent l'analyse de l'heure de l'ajout de médicaments, l'analyse de liaison virale basée sur la cytométrie du flux et l'essai d'inactivation virale. Nous présentons également un protocole d'amarrage moléculaire utilisant des protéines capsides virales pour prédire les résidus potentiels ciblés par les composés antiviraux. Ces tests devraient aider à l'identification des agents antiviraux candidats qui agissent sur l'entrée virale. Les orientations futures peuvent explorer ces inhibiteurs possibles pour le développement ultérieur de médicaments.
Introduction
La maladie de la main, du pied et de la bouche (HFMD) est une maladie la plus souvent causée par le coxsackievirus A16 (CVA16) et l'entérovirus 71 (EV71) chez les jeunes enfants. Récemment, dans toute la région Asie-Pacifique, il y a eu une hausse significative de la DHHC induite par le CVA16. Bien que les symptômes peuvent être légers, des complications graves peuvent se produire qui affectent le cerveau et le cœur, avec la fatalité potentielle1,2. À l'heure actuelle, il n'existe pas de thérapies antivirales ou de vaccins homologués pour le CVA16, et il est donc urgent d'élaborer des stratégies antivirales po....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
REMARQUE: Toutes les cultures cellulaires et les infections virales doivent être effectuées dans des hottes de biosécurité certifiées qui conviennent au niveau de biosécurité des échantillons manipulés. Les deux tanins de la classe des petites molécules d'acide chébulagique (CHLA) et de punicalagin (PUG), qui ont été observés pour bloquer efficacement l'infection CVA169, sont utilisés comme exemples d'agents inhibiteurs candidats. Pour les principes de base dans les techniques de virologie, la propagation du virus, la détermination du titre de virus, et les concepts d'unités de formation de plaque (PFU) ou la multiplicité de l'....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
L'exemple de l'heure d'ajout de drogue est indiqué à la figure 1 et montre l'influence du traitement à l'aide des petites molécules CHLA et PUG sur l'infection cVA16 soit pré-virale (prétraitement), lors de l'entrée virale (co-addition), ou post-virale entrée ( post-infection). Les deux petites molécules n'ont produit qu'un impact marginal contre l'infectiosité CVA16, que ce soit dans le prétraitement des cellules hôtes avant l'infection virale (
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans ce rapport, nous avons décrit les protocoles qui sont utiles pour l'identification des candidats antiviraux qui ciblent l'entrée virale, en particulier contre le CVA16 non enveloppé. Les essais sont conçus de manière à disséquer les premiers événements lors de l'entrée virale, ce qui est utile pour clarifier le mécanisme d'action et les cibles potentielles de l'activité antivirale des agents d'essai. L'« analyse de l'heure de l'ajout de médicaments » permet de déterminer de façon générale la cible potentielle des co.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêts.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants au Dr Joshua Beckham de l'Université du Texas à Austin pour son soutien technique avec l'amarrage moléculaire. Cette étude a été financée en partie par le financement du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST107-2320-B-037-002 à C.-J.L. et L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 et MOST107-2320-B-038-034-MY3 à L.-T.L.).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4 % Paraformaldéhyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugué anti-souris IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotéricine B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anticorps anti-VP1 | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Anticorps, réaction croisée avec Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytomètre | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Cristal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldéhyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Héparine sel de sodium | Sigma | H3393 | |
| Kit de dosage toxicologique in vitro, à base de XTT | Sigma | TOX2 | |
| Méthylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7,4 | GIBCO | 10010023 | |
| Pénicilline-Streptomycine | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrö ; dinger | ||
| UCSF Chimera | Université de Californie, San Francisco |
Références
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 2....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
