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Article de méthode

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

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DOI :

10.3791/59949

⸱

17 décembre 2019

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une approche pour générer fiable des cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) et testons leur différenciation et fonction in vitro et in vivo.

Résumé

L'immunothérapie adoptive est prometteuse pour le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Nous décrivons une approche simple pour transduire les lymphocytes T humains primaires avec le récepteur chimérique d'antigène (CAR) et d'étendre leur progéniture ex vivo. Nous incluons des essais pour mesurer l'expression de la RCA ainsi que la différenciation, la capacité de prolifération et l'activité cytolytique. Nous décrivons des essais pour mesurer la production de cytokine effectrice et la sécrétion inflammatoire de cytokine dans les cellules T de CAR. Notre approche fournit une méthode fiable et complète pour la culture des cellules T CAR pour les modèles précliniques d'immunothérapie adoptive.

Introduction

Les récepteurs d'antigène chimérique (RAC) fournissent une approche prometteuse pour rediriger des cellules de T contre des antigènes distincts de tumeur. Les RAC sont des récepteurs synthétiques qui lient une cible antigène. Bien que leur composition précise soit variable, les RAC contiennent généralement 3 domaines distincts. Le domaine extracellulaire dirige la liaison vers un antigène cible et est généralement composé d'un fragment d'anticorps à chaîne unique relié à la RCA via une charnière extracellulaire. Le deuxième domaine, généralement dérivé de la chaîne CD3du du complexe du récepteur des lymphocytes T (TCR), favorise l'activation des lymphocytes T après l'engagement de la RCA. Un troisième domaine costimulatory est inclus pour améliorer la fonction de cellule T, l'engraftment, le métabolisme, et la persistance. Le succès de la thérapie cellulaire t CAR dans diverses malignités hématopoïétiques, y compris la leucémie lymphoblastique aigue à cellules B (LAL), la leucémie lymphocytique chronique (LCL) et le myélome multiple met en évidence la promesse thérapeutique de cette approche1,2,3,4,5,6. Les approbations récentes de la Food and Drug Administration (FDA) pour deux thérapies à cellules T CAR spécifiques à la Car19, le tisagenlecleucel pour les patients atteints de l'ENSEMBLE pédiatrique et des jeunes adultes et du ciloleucel d'axicabtagene pour le lymphome diffus à grandes cellules B, renforce le mérite translationnel de la thérapie cellulaire T de la RCA.

Les approches basées sur le CAR T impliquent l'isolement des lymphocytes T du sang périphérique, l'activation, la modification génétique et l'expansion ex vivo. La différenciation est un paramètre important régulant l'efficacité des lymphocytes T CAR. En conséquence, la restriction de la différenciation des lymphocytes T pendant la culture ex vivo améliore la capacité du produit infusé à s'engrafter, à se développer et à persister, fournissant une immunosurveillance à long terme après le transfert adoptif2,7,8,9. Les lymphocytes T se composent de plusieurs sous-ensembles distincts, y compris : les lymphocytes T naïfs (Tn), la mémoire centrale (Tcm), la mémoire effectrice (Tem), l'effecteur différencié (Tte) et la mémoire des cellules souches (Tscm). Les lymphocytes T différenciés de l'Effecteur ont une capacité cytolytique puissante; cependant, ils sont de courte durée et engraft mal10,11,12. En revanche, les lymphocytes T avec un phénotype moins différencié comprenant les lymphocytes T naïfs et les Tcm présentent des capacités supérieures d'engraftment et de prolifération suivant le transfert adoptif de cellule13,14,15,16,17,18. La composition des lymphocytes T collectés dans le produit préfabriqué peut varier d'un patient à l'autre et est en corrélation avec le potentiel thérapeutique des lymphocytes T CAR. La proportion de lymphocytes T avec un immunophénotype naïf-comme dans le produit d'apheresis de départ est fortement corrélée avec l'engraftment et la réponse clinique19.

La durée de la culture est un paramètre important influençant la différenciation dans les cellules T CAR préparées pour le transfert adoptif. Nous avons récemment développé une approche pour générer des cellules T CAR de qualité supérieure en utilisant un paradigme de culture abrégé20. En utilisant notre approche, nous avons montré que la culture limitée donne lieu à des cellules T CAR avec la fonction effectrice supérieure et la persistance suivant le transfert adoptif dans les modèles de xénogreffe de la leucémie. Ici, nous présentons les approches pour générer de façon fiable des cellules CART19 (cellules T autologues conçues pour exprimer l'anti-CD19 scFv attaché à CD3 et les domaines de signalisation 4-1BB) et incluons une description détaillée des essais qui fournissent un aperçu de la bioactivité et de l'efficacité de CAR T avant le transfert adoptif.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

1. Activation, transduction et expansion des lymphocytes T

  1. Activer les lymphocytes T humains primaires frais ou cryoconservés en mélangeant avec des perles magnétiques anti CD3/CD28 (p. ex., dynabeadss) à un rapport de 3 perles par cellule T dans des plats de culture cellulaire de 6 puits. Les cellules T de culture dans le milieu x-VIVO 15 complété avec le sérum humain normal de AB de 5%, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, et IL2 (100 unités/mL). Maintenir les lymphocytes T à une concentration de 106 lymphocytes T/mL pendant l'expansion. Cellules T de culture à 37 oC, 20 % O2, et 95 % d'humidité avec 5 % de CO2.
  2. Après la stimulation de la nuit, ajouter le supernatant lentiviral aux lymphocytes T activés. Calculer le volume de supernatant nécessaire pour atteindre une multiplicité d'infection (MOI) de 3 à 5.
    REMARQUE: Le plasmide de lentivirus CD19-BBMD CAR se compose d'une charnière CD8, d'un domaine costimulatoire 4-1BB et d'un domaine de signalisation CD321. Le supernatant lentiviral CD19-BBMD a été produit comme décrit précédemment21.
  3. Le jour 3, recueillir un aliquot représentatif de cellules pour la cryoconservation. Avant la cryoconservation, retirez les perles magnétiques par pipetage doux et séparation magnétique. Préparer le milieu de congélation contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) avec 0,5 % de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et conserver à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
    1. Centrifugeuses lymphocytes T à 300 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ajouter 5 ml de PBS. Centrifugeuses cellules à 300 x g pendant 5 min et jetez le PBS.
    2. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu de cryoconservation froid. Congeler les lymphocytes T dans un contenant de congélation réfrigéré et les conserver à -80 oC pendant 48 h. Transférer les cellules congelées à l'azote liquide.
  4. Laver le reste des lymphocytes T une fois sur 5 ml de PBS pour éliminer le vecteur résiduel. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Décant le PBS et resuspendre le granule cellulaire dans le milieu de culture des lymphocytes T à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL.
  5. Divisez les lymphocytes T en deux cultures, désignées pour le jour 5 et le jour 9. Compter les lymphocytes T par cytométrie d'écoulement à l'aide de perles de comptage (Tableau des matériaux) et d'anticorps monoclonaux pour les CD4 et CD8 humains, ainsi qu'un colorant de viabilité (Tableau des matériaux).
    1. Pour mesurer la concentration des lymphocytes T, préparez un mélange maître contenant 500 L de PBS, 5 L de perles de comptage, 10 l de solution de viabilité des cellules D 7-Amino-actinomycine D, 4 oL de CD4-FITC et 4 OL de CD8-APC. Ajoutez 40 L de lymphocytes T au mélange principal et mesurez la concentration cellulaire par cytométrie d'écoulement en fonction du nombre de lymphocytes T vivants/dénombrements de perles. Reflux pour maintenir les cultures à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL tous les deux jours.
  6. Le jour 5, comptez et cryoconservez les cultures du jour 5 telles que décrites dans les étapes 1.3 et 1.5.
  7. Le jour 7, lavez 0,5 x 106 lymphocytes T dans le PBS et suspendez-les dans un tampon de tri cellulaire activé à la fluorescence (FACS) de 100 ll. Détecter l'expression des protéines de surface de cararie par immunostaining avec un idiotype anti-CAR19 fluorescent par cytométrie de flux.
  8. Le jour 9, comptez les cultures du jour 9 et cryopreserve comme décrit dans l'étape 1.3.

2. Évaluation phénotypique de la différenciation des lymphocytes T

  1. Préparer un mélange maître contenant des anticorps pré-titrés pour les anticorps anti-CD3-BV605 (clone OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19-PB (clone HIB19), anti-CD4-BV510 (clone OKT4), anti-CD8-H7APC (clone SK1), anti-CCR7-FITC (clone 150503), anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2), et anti-CAR19-APC.
  2. Préparer les contrôles individuels de fluorescence moins un (FMO) pour les cellules anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 et anti-CD95-PerCP-Cy5.5 pour distinguer les cellules tachées positivement de l'arrière-plan.
  3. Préparer la solution de coloration de cellules mortes en diluant le réactif vivant/mort de stock (tableau des matériaux) 1:10.000 dans PBS.
  4. Décongeler le jour 3, le jour 5 et le jour 9 lymphocytes T qui étaient auparavant cryoconservés. Centrifugeuse 1 x 106 lymphocytes T de chaque groupe à 300 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant. Laver les cellules une fois avec PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min et jetez le PBS.
  5. Mélanger les lymphocytes T avec la solution de coloration morte pendant 15 min à température ambiante (RT), à l'abri de la lumière.
  6. Ajouter 1 mL de tampon FACS pour étancher le colorant de coloration de cellules mortes. Centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min, jetez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille cellulaire dans 100 ll de tampon FACS contenant le cocktail d'anticorps décrit à l'étape 2.1 et 2.2. Incuber pendant 1 h à 4 oC.
  7. Ajouter 1 mL de tampon FACS et centrifugeuse à 300 x g pendant 3 min pour laver les anticorps non liés. Répétez trois fois avec le tampon FACS.
  8. Resuspendre les cellules dans 1 % de paraformaldéhyde (PFA) et les conserver à 4 oC.
  9. Pendant que l'expression de CD45RO diminue après fixation, analysez les échantillons par cytométrie de flux après immunostaining. Pour évaluer la différenciation, portez dans l'ordre suivant : singlets (FSC-H vs FSC-A), cellules CD3et T vivantes (Dump [violet vivant-mort, CD14-PB et CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). En CD4et CD8, porte sur CD45RO-PE vs CCR7-FITC pour définir les cellules T naïfs (CD45RO-CCR7,Tcm (CD45RO-CCR7-), Tem (CD45RO-CCR7-), et Tte (CD45RO-CCR7-). Pour identifier Tscm, porte sur les cellules CD27et T dans la population de lymphocytes T naïfs. Dans ce compartiment, Tscm sont CD95et Tn sont CD95-.

3. Analyse fonctionnelle in vitro

  1. Prolifération des lymphocytes T CAR et sécrétion de cytokine
    1. Vérifier l'expression de la RCA ainsi que la viabilité cellulaire décrite dans les étapes 1.5 et 1.7, par cytométrie de flux.
    2. Laver 5 x 106 lymphocytes T de chaque groupe (jour 3, jour 5 et jour 9) avec PBS et resuspendre dans une solution de 1 M m de carboxyfluorescein diacétate succinimidyl ester (CFSE) en PBS pendant 3,5 min à RT.
    3. Ajouter immédiatement 10 ml de PBS contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) pour éteindre la réaction.
    4. Centrifuger la solution à 300 x g pendant 3 min. Jetez le supernatant et répétez cette étape de lavage trois fois. Compter les cellules à la fin de la coloration CFSE à l'aide d'un compteur Coulter (Tableau des matériaux).
    5. Récoltedes de cellules tachées de CFSE (non stimulées), resuspendre es à 1 % de PFA et conserver à 4 oC pour analyse par cytométrie de débit.
    6. Incuber le nombre souhaité de cellules T CAR tachées de CFSE avec k562-CD19 irradiés (cible) ainsi que des cellules de type K562-sauvage (contrôle) à un rapport de 1:1 pour 120 h dans le milieu de culture libre de cytokine et les conditions de culture comme décrit à l'étape 1.1.
    7. Après 24 h, centrifuger le récipient de culture à 300 x g pendant 5 min. Recueillir 120 ll de supernatant cellulaire. Évaluer la production dépendante de l'activation de l'IL2, de l'IFNMD, du TNFMD, du GM-CSF et d'autres cytokines inflammatoires (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 et IL10) par luminex, conformément aux recommandations du fabricant.
    8. Remplacer le volume de supernatant qui a été recueilli à l'étape 3.1.7 avec un volume équivalent (120 l) de milieu frais.
    9. Le jour 3 (c.-à-d. après 96 h), compter et réalimenter à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL à l'aide de cytométrie à base de perles comme précédemment à l'étape 1.5.
    10. Le jour 5, comptez les cellules CD3vivantes et calculez le changement de pli des lymphocytes T vivants par rapport au nombre de lymphocytes T vivants au jour 0.
    11. Effectuez une analyse complète de la dilution de CFSE en divisant les cellules T de CAR à l'aide du logiciel FlowJo pour mettre en évidence les cycles successifs de division cellulaire.
      REMARQUE : Les tests de prolifération sont bien décrits dans le manuel FlowJo.
  2. Cytotoxicité
    REMARQUE: La capacité des cellules CART19 à tuer les cellules cibles exprimant le CD19 est évaluée à l'aide d'un réto-tosay de 51Cr.
    1. Étiquetez les cellules cibles en mélangeant 5 x 105 K562-CD19, les cellules témoins de type K562-sauvage ou les cellules leucémiques NALM6 avec 50 OL de Na251CrO4 et 0,5 mL de RPMI complétées par 10 % de FBS pendant 90 min dans l'incubateur à 37 oC.
    2. Cellules centrifugeuses à 300 x g pendant 2,5 min. Jeter le supernatant radioactif dans des bacs d'élimination appropriés et laver les cellules cibles dans 5 ml de PBS. Répétez les étapes de lavage deux fois.
    3. Resuspendre les cellules cibles dans le milieu sans phénol rouge contenant 5% de FBS. Utilisez ce support pour le reste de la procédure pour réduire le fond.
    4. Après avoir évalué l'expression de la RCA et la viabilité cellulaire par cytométrie de flux (tel que décrit dans la section 5.1), mélanger les lymphocytes T CAR avec des cellules cibles étiquetées aux ratios effector:target (E:T) de 10:1, 3:1 et 1:1, en triple. Transférer dans une plaque inférieure U de 96 puits.
    5. En parallèle, inclure les cellules cibles seules, et les cellules cibles avec 1% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pour déterminer spontanée (S) et maximale (M) 51Cr libération, respectivement.
    6. Centrifugeuses cellules à 300 x g pendant 5 min et incuber pendant 4 h ou 20 h dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2.
    7. Après l'heure indiquée, centrifugez le récipient de culture à 300 x g pendant 5 min. Recueillir 35 l de supernatant cellulaire et transférer dans une plaque à lecteurs. Évitez les bulles. Laisser sécher l'assiette toute la nuit.
    8. Scellez la plaque avec un joint de plaque standard et comptez avec un compteur de scintillation liquide. L'abondance de chrome dans le supernatant fournit un proxy de la mise à mort de cellules cibles. Calculez le pourcentage de lyse spécifique comme suit : 100 x (comptes par minute [cpm] version expérimentale - cpm S release)/ (cpm M release - cpm S release).

4. Analyse fonctionnelle In Vivo

  1. Obtenez des souris NOD-SCID de 6 à 10 semaines, qui n'ont pas de système immunitaire adaptatif et les assignent au groupe de traitement/contrôle au hasard.
  2. Injectez des animaux par voie intraveineuse par la veine de la queue avec 1 x 106 cellules NALM6 dans un PBS stérile de 0,1 ml.
  3. Après 5 à 7 jours, confirmer l'engraftment de tumeur par la formation image de bioluminescence (BLI). Injecter 150 mg/kg de D-luciferine à des souris qui ont été anesthésiés avec de l'isoflurane (le volume dépend de la masse corporelle).
  4. Mesurer les valeurs de bioluminescence à l'aide d'un système d'imagerie. Quantifier le flux total à l'aide du logiciel correspondant en dessinant des rectangles de zone identique autour des souris, atteignant de la tête à 50% de la longueur de la queue. Soustrayez l'arrière-plan de chaque image individuellement.
  5. Après avoir établi la leucémie, injectez 3 x 106 cellules de CART19 de jour, 0,5 x 106 jours 3 cellules T de CAR, ou les cellules T humaines non transducées correspondantes (NTD) par l'intermédiaire de la veine de queue dans un volume de 100 oL de PBS/Ca stérile2.
    REMARQUE: Comme la bioactivité des cellules récoltées à divers intervalles au cours du processus de culture est différente, la concentration choisie des cellules du jour 3 est inférieure à celle du jour 9.
  6. Pour déterminer la progression de la maladie, mesurez les valeurs de bioluminescence deux fois par semaine comme décrit ci-dessus à l'étape 4.3.
  7. Pour déterminer l'engraftment des cellules T de carRE, collectez 75 sang de L par l'intermédiaire du saignement rétro-orbital dans un tube EDTA-enduit. Transférer 50 lde de sang dans des tubes de comptage absolus.
  8. Tachez le sang avec des anticorps contre CD45, CD4, CD8 et CAR pendant 30 min à RT. Ajouter 400 l de 1x FACS lysing solution aux tubes et vortex à fond. Après coloration, analyser l'expression des marqueurs de surface par cytométrie de flux.
    REMARQUE: D'autres marqueurs de surface peuvent être utilisés pour évaluer la différenciation et l'état d'épuisement des lymphocytes T dans le sang.
  9. Pour mesurer les taux de cytokines dans le sang, centrifuger le sang à 1 200 x g pendant 30 min à 4 oC pour séparer le sérum de la couche supérieure du sang.
  10. Recueillir le sérum et mesurer les cytokines avec une plaque de lecteur désignée selon les instructions du fabricant.

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Résultats

En utilisant les méthodes décrites ci-dessus, nous avons stimulé et élargi les lymphocytes T pendant 3 ou 9 jours(figure 1A,B). Nous avons également analysé leur profil de différenciation, tel qu'indiqué par la stratégie de gating décrite à la figure 1C, en mesurant l'abondance de glycoprotéines distinctes exprimées à la surface des cellules. Nous montrons un changement progressif vers la différenciation effector au fil du temps...

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Discussion

Ici nous décrivons des approches pour mesurer la fonction et l'efficacité des cellules T de CAR récoltées à des intervalles variables tout au long de la culture ex vivo. Nos méthodes fournissent un aperçu complet des essais conçus pour évaluer la capacité de prolifération ainsi que la fonction effector in vitro. Nous décrivons comment mesurer l'activité des lymphocytes T carracinés par stimulation par le CAR et détaillons les modèles de xénogreffe de la leucémie à l'aide de cellules T CAR récoltées au jour 3 contre le 9e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par le financement fourni par Novartis Pharmaceuticals par le biais d'une alliance de recherche avec l'Université de Pennsylvanie (Michael C. Milone) ainsi que st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dynabeads anti CD3/CD28Thermo Fisher40203D
APC Souris Anti-Humain CD8BD Biosciences555369RRID :AB_398595
APC-H7 Souris anti-Humain Anticorps CD8BD Biosciences560179RRID :AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X ConcentréBD Biosciences349202
BD Trucount Absolute Counting TubesBD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 Anticorps CD4 anti-humainBioLegend317444RRID :AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-CD3 humainBioLegend317322RRID :AB_2561911
CellTrace CFSE Kit de prolifération cellulaireLife TechnologieslohgiesC34554
CountBright Absolute Counting Beads,InvitrogenC36950
FITC anti-humain CD197 (CCR7) AnticorpsBD Pharmingen561271RRID :AB_10561679
FITC Souris anti-humain CD4BD Biosciences555346RRID :AB_395751
HEPESGibco15630-080
Humain AB sérumValley BiomedicalHP1022
Humain IL-2 IS, qualité supérieureMiltenyi130-097-744
L-glutamineGibco28030-081
Compteur à scintillation liquide, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD Sondes moléculaires violettes fixablesL34964
Multisizer Compteur CoulterBeckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacifique Anticorps CD14 anti-humain bleuBioLegend325616RRID :AB_830689
Anticorps CD19 bleu du PacifiqueBioLegend302223
PE anti-humain CD45RO AnticorpsBiosciences555493 RRID :AB_395884
PE/Cy5 anti-humain CD95 (Fas) AnticorpsBioLegend305610RRID :AB_493652
PE/Cy7 anti-humain CD27Beckman CoulterA54823
Milieu sans rouge de phénolGibco10373-017
UltraPure SDS Solution, 10 %Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SelPerkinElmer 122799
BD

Références

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Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive
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