Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Résumé

Nous décrivons une approche pour générer fiable des cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) et testons leur différenciation et fonction in vitro et in vivo.

Résumé

L'immunothérapie adoptive est prometteuse pour le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Nous décrivons une approche simple pour transduire les lymphocytes T humains primaires avec le récepteur chimérique d'antigène (CAR) et d'étendre leur progéniture ex vivo. Nous incluons des essais pour mesurer l'expression de la RCA ainsi que la différenciation, la capacité de prolifération et l'activité cytolytique. Nous décrivons des essais pour mesurer la production de cytokine effectrice et la sécrétion inflammatoire de cytokine dans les cellules T de CAR. Notre approche fournit une méthode fiable et complète pour la culture des cellules T CAR pour les modèles précliniques d'immunothérapie adoptive.

Introduction

Les récepteurs d'antigène chimérique (RAC) fournissent une approche prometteuse pour rediriger des cellules de T contre des antigènes distincts de tumeur. Les RAC sont des récepteurs synthétiques qui lient une cible antigène. Bien que leur composition précise soit variable, les RAC contiennent généralement 3 domaines distincts. Le domaine extracellulaire dirige la liaison vers un antigène cible et est généralement composé d'un fragment d'anticorps à chaîne unique relié à la RCA via une charnière extracellulaire. Le deuxième domaine, généralement dérivé de la chaîne CD3du du complexe du récepteur des lymphocytes T (TCR), favorise l'activation des lymphocytes T après l'....

Protocole

Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie.

1. Activation, transduction et expansion des lymphocytes T

1. Activer les lymphocytes T humains primaires frais ou cryoconservés en mélangeant avec des perles magnétiques anti CD3/CD28 (p. ex., dynabeadss) à un rapport de 3 perles par cellule T dans des plats de culture cellulaire de 6 puits. Les cellules T de culture dans le milieu x-VIVO 15 complété avec le sérum humain normal de AB de 5%, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, et IL2 (100 unités/mL). Maintenir les lymphocytes T à une concent....

Résultats

En utilisant les méthodes décrites ci-dessus, nous avons stimulé et élargi les lymphocytes T pendant 3 ou 9 jours(figure 1A,B). Nous avons également analysé leur profil de différenciation, tel qu'indiqué par la stratégie de gating décrite à la figure 1C, en mesurant l'abondance de glycoprotéines distinctes exprimées à la surface des cellules. Nous montrons un changement progressif vers la différenciation effector au fil du temps.......

Discussion

Ici nous décrivons des approches pour mesurer la fonction et l'efficacité des cellules T de CAR récoltées à des intervalles variables tout au long de la culture ex vivo. Nos méthodes fournissent un aperçu complet des essais conçus pour évaluer la capacité de prolifération ainsi que la fonction effector in vitro. Nous décrivons comment mesurer l'activité des lymphocytes T carracinés par stimulation par le CAR et détaillons les modèles de xénogreffe de la leucémie à l'aide de cellules T CAR récoltées au jour 3 contre le 9e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dynabeads anti CD3/CD28	Thermo Fisher	40203D
APC Souris Anti-Humain CD8	BD Biosciences	555369	RRID :AB_398595
APC-H7 Souris anti-Humain Anticorps CD8	BD Biosciences	560179	RRID :AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentré	BD Biosciences	349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes	BD Biosciences	340334
Brilliant Violet 510 Anticorps CD4 anti-humain	BioLegend	317444	RRID :AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-CD3 humain	BioLegend	317322	RRID :AB_2561911
CellTrace CFSE Kit de prolifération cellulaire	Life Technologieslohgies	C34554
CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen		C36950
FITC anti-humain CD197 (CCR7) Anticorps	BD Pharmingen	561271	RRID :AB_10561679
FITC Souris anti-humain CD4	BD Biosciences	555346	RRID :AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
Humain AB sérum	Valley Biomedical	HP1022
Humain IL-2 IS, qualité supérieure	Miltenyi	130-097-744
L-glutamine	Gibco	28030-081
Compteur à scintillation liquide, MicroBeta trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD Sondes moléculaires violettes fixables		L34964
Multisizer Compteur Coulter	Beckman Coulter
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
Pacifique Anticorps CD14 anti-humain bleu	BioLegend	325616	RRID :AB_830689
Anticorps CD19 bleu du Pacifique	BioLegend	302223
PE anti-humain CD45RO Anticorps	Biosciences	555493 RRID	:AB_395884
PE/Cy5 anti-humain CD95 (Fas) Anticorps	BioLegend	305610	RRID :AB_493652
PE/Cy7 anti-humain CD27	Beckman Coulter	A54823
Milieu sans rouge de phénol	Gibco	10373-017
UltraPure SDS Solution, 10 %	Invitrogen	15553027
Via-Probe	BD Biosciences	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ Sel	Perkin	Elmer 122799

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