Presenteras här är en enkel att använda, Core/Shell, tredimensionell bioprinting set-up för ett steg tillverkning av ihåliga ställningar, lämplig för vävnadsteknik av vaskulära och andra tubulär strukturer.
Tredimensionell (3D) tryckning av Core/Shell filament möjliggör direkt tillverkning av kanal strukturer med ett stabilt skal som är tvärbunden vid gränssnittet med en flytande kärna. Den senare avlägsnas efter tryckning, lämnar bakom en ihålig tub. Integrera en tillsats tillverkningsteknik (som den som beskrivs här med skräddarsydda [bio] bläck, som strukturellt och biokemiskt efterlikna den infödda extracellulära matrix [ECM]) är ett viktigt steg mot avancerad vävnadsteknik. Men exakt tillverkning av väldefinierade strukturer kräver skräddarsydda Fabrication strategier optimerade för det material som används. Därför är det klokt att börja med en uppsättning som är anpassningsbar, enkel att använda och kompatibel med ett brett spektrum av material och applikationer. Detta arbete presenterar en enkel att tillverka kärna/skal munstycke med luer-kompatibilitet för att utforska core/shell tryckning av träpile strukturer, testade med en väldefinierad, alginate-baserade byggnadsställning material formulering.
Förmodligen är det slutgiltiga målet för vävnadsteknik (te) att producera funktionella vävnader eller organ in vitro, som kan användas för att regenerera eller ersätta skadade eller sjuka delar av människokroppen1,2,3. Aktuell forskning inom vävnadsteknik (TE) är inriktad på enskilda aspekter av området (byggnadsställningar material, tillverknings procedurer, cell källor, etc.) 4,5, samtutveckla enkla in vitro-modeller av vävnader och organ som efterliknar grundläggande aspekter av deras in vivo motsvarigheter. Sådana modeller är redan användbara för många tillämpningar, såsom Drug screening och toxicitetsstudier, särskilt i fall där konventionella 2D-cellkulturer misslyckas med att efterlikna de dynamiska svaren från de infödda vävnaderna6,7, 8,9. Tredimensionella in vitro-modeller konstrueras vanligtvis genom att kombinera celler10, fysikalisk-kemiska ledtrådar11, och biologiskt aktiva molekyler12,13 på ställningar, som erhålls från deellulariserade vävnader eller konstruerade de Novo från biologiskt eller biokompatibelt material14,15,16,17,18.
Det är viktigt att byggnadsställningar recapitulate komplexa 3D mikroarkitektur och hierarkisk struktur av de infödda vävnader för att möjliggöra funktionaliteten hos de konstruerade vävnader, representativa för in vivo vävnader19. Trots den betydande tekniska framsteg i TE, utveckling av fysiologiskt relevanta konstgjorda vävnad konstruktioner är fortfarande en utmaning. Tjocka vävnader (> 200 μm i tjocklek) är särskilt problematiska, på grund av begränsningar såsom syre och näringsämne diffusion20. Framsteg mot större vävnads konstruktioner har gjorts. den erforderliga höga närheten av celler till blodkärl för att transportera syre och näringsämnen och främja avlägsnande av avfall måste dock rekapitueras. Vascularization av vävnader (eller alternativt, tillverkning av sammankopplade 3D-vaskulära nätverk inom vävnad konstruktioner) spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellernas lönsamhet och främja funktioner i in vitro-konstruerade vävnader, vilket är svårare för modeller i långvariga experiment21,22. Vidare har den erforderliga upplösningen, den strukturella integriteten och samtidig biokompatibilitet ännu inte uppnåtts23.
Flera TE metoder har föreslagits i ett försök att konstruera blodkärl-liknande strukturer och underlätta vaskularisering in vitro-. Några exempel är sådd endotelceller (även co-odlade med andra celler typer såsom fibroblaster) att själv-montera för att generera mikrovaskulära nätverk24, användning av vaskulära stamceller och pericyter som främjar endotelceller tillväxt21,25, leverans av angiogena tillväxtfaktorer som inducerar vaskularisering20,26, med hjälp av cellark teknik som möjliggör kontroll över vaskulär skiktning20, och tillverkning av mycket porösa byggnadsställning strukturer som främjar angiogenes27. De nämnda tillvägagångssätten fokuserar på angiogeneshämning, som i allmänhet kräver avsevärda mängder ytterligare tillväxtfaktorer (t. ex. VEGF) och tid till form. Men de största nackdelarna är deras begränsade reproducerbarhet och begränsad rumslig kontroll över vaskulär mönkning, vanligtvis resulterar i en slumpmässig kärlsystemet fördelning inom vävnad konstruera som inte nödvändigtvis underlättar perfusion.
Additiv tillverkning (AM, såsom 3D bioprinting) är alltmer involverad i tillverkningen av 3D konstruktioner med hjälp av biologiskt eller biokompatibelt material för att skapa ställningar som lämpar sig för TE. Flera AM-strategier används och utvecklas parallellt (t. ex. bläckstråle-och microextrudering-baserade metoder, olika typer av litografiska tekniker) för att producera ställningar som imiterar inhemska vävnader i deras arkitektur, biokemi och funktionalitet . De enskilda teknikerna uppvisar vissa fördelar och nackdelar28, varför olika modifieringar utforskas (t. ex. mikromönstringar, inducerad angiogenes, etc.) för att öka i vilken utsträckning stora, komplexa och stabila vaskulära nätverk kan tillverkas22,29,30.
Bland dessa, extrudering bioprinting är den vanligaste metoden, särskilt på grund av det breda utbudet av kompatibla material (en allmänt cell-vänlig process28,31,32) samt exceptionell mångsidighet i användningsvillkor (t. ex. inbäddade och offer tryck23,33, tillverkning av ihåliga konstruktioner34,35, etc.). De viktigaste utmaningarna med närvarande studier inkluderar överföring från 2D till 3D strukturer, bildandet av ett tätt nätverk av ihåliga rör med hög rumslig upplösning, och övergripande mekanisk integritet och form trohet under vätskeflödet i cellkulturen villkor30.
Den enklaste metoden för perfusable vävnad är tillverkningen av ett sammanlänkat nätverk av kanaler inom konstruktionen. Skapandet av sådana parfymiserbara kanaler inom en vävnad byggnadsställning förväntas lösa många av de ovan nämnda problem, eftersom det omedelbart möjliggör för näringsämnen och syre diffusion samtidigt ta bort slaggprodukter. Därför undviks den potentiella bildandet av nekrotiska regioner inom konstruktionen36. Sådana kanaler kan dessutom vara seedade med endotelceller (ECs) och fungera som konstgjorda blodkärl i 3D-vävnadsmodeller37. I den mest elementära bemärkelse, ett fartyg kan bestå av en ihålig kanal, mjukt skikt av ECs, och stela skal. Nyligen 3D extrudering av två olika material i en kärna/Shell mode utnyttjar Co-Axial nålar för extrudering har vunnit mycket intresse38,39,40,41, eftersom det gör det möjligt för tillverkning av ihåliga rör.
I likhet med konventionella microextrudering 3D-utskrifter, Core/Shell utskrift utförs med en Co-Axial munstycke (t. ex., två nålar med olika diametrar justeras på samma axel på ett sätt, så att den bredare nålen omsluter den smalare en). Således kan två material extruderas samtidigt, med en som den centrala glödtråden eller “inre” kärna och en sekund som den “yttre” skal41. Hittills har Co-Axial bioprinting utnyttjats för att fabricera strukturer med solid42, Core/Shell43, och ihåliga strängar40,44; de material som används har dock inte optimerats för både optimal cell lönsamhet och mekanisk robusthet hos de tryckta konstrukkterna. Som nämnts, tekniken ger möjlighet att kombinera biomaterial med olika mekaniska egenskaper, där styvare en stöder mjukare en. Ännu viktigare, om byggnadsställningen material (t. ex., alginat, karboxymetylcellulosa) extruderas som skalet, medan kärnan består av tvärbindningsmedel (t. ex., kalciumklorid) dispenseras från den inre kapillär sedan sköljas ut efter tryckning, är det möjligt att tillverka ett sammanhängande ihåligt rör i ett enda steg45.
Med detta i åtanke, en enkel och repeterbara en-stegs metod utvecklades för att bygga väldefinierade och parfymera ställningar för konstruktion av vaskulära strukturer och andra tubulära vävnader. För att utveckla en kostnadseffektiv teknik, bör tillverkningen helst vara en enda steg process. Därför anpassades och integrerades en Core/Shell-uppsättning i 3D bioprinter. Den grundläggande konstruktionen består av en central munstycke av metall för att undvika deformation under injektion, runt vilken ett andra munstycke av en större diameter placeras. En sådan Co-Axial munstycke set-up möjliggör co-extrudering av de två flödena och omedelbar tvärbindning av extruderade hydrogel kanalen. Detta möjliggör direkt tillverkning av flerskiktade ihåliga glödtrådar, medan efterföljande tvärbindning med högre koncentrationer av kalciumklorid (CaCl2) säkerställa mer permanent stabilisering från utsidan.
Som sådan tillåter denna metod för samtidig tryckning av ställningar och mikrokanaler, där de ihåliga hydrogel glödtrådar fungera som en byggnadsställning för att stödja den mekaniska integriteten i 3D konstruktioner och samtidigt fungera som inbyggda mikrokanaler för att leverera näringsämnen för celltillväxt. Detta protokoll ger ett detaljerat förfarande av Core/Shell 3D bioprinting strategi baserat på användning av en skräddarsydd Co-Axial munstycke där hydrogel 3D-strukturer med inbyggda kanaler tillverkas genom att kontrollera tvärbindning för att producera ihåliga glödtrådar, som fortfarande är parfymera under cellkulturen.
3D-utskriftset-up som används i detta arbete är konfigurerad som tidigare beskrivits av Banović och Vihar46 och kan delas in i tre huvudkomponenter: a) en tre-AXLIG CNC mekanisk set-up med 50 μm positionering noggrannhet i X, Y, och Z riktningar; B) två Extrudrar, anpassade för engångssprutor med 5 mL luer-lock, med 1,2 μL Voxel-upplösning. och C) styrning av elektronik och programvara.
För att underlätta kärn-/skal tryck utvecklades ett lämpligt munstycke som kan monteras på en av extruderarna (primär extruder, tryckning av kärnan) och är kompatibelt med G27 Blunt-pinnnålar. Det har också luer-lock kompatibilitet för att ansluta med den andra extruder (utskrift skalet). De första prototyperna var fabricerade genom att sätta in en trubbig ände G27 nål (innerdiameter = 210 μm, ytterdiameter = 410 μm) i antingen en G21 nål (innerdiameter = 510 μm, ytterdiameter = 820 μm) eller G20 konisk spets (innerdiameter = 600 μm), sedan sätta i en sekundär n Eedle Terrace sidled för att förse skalet materialet. Men på grund av lätt böjning av nålens skaft, är det inte möjligt att producera en munstycke spets med koncentrisk justering av inre och yttre nålar.
För att lösa detta problem, utformades ett nytt munstycke design som uppfyllde följande kriterier: 1) det kan tillverkas med hjälp av en 3-axlig CNC Mill, 2) det kan göras från olika material (hög prestanda plast, såsom PEEK eller metaller), 3) det har luer-lock kompatibilitet för applicering av Shell material, och 4) är kompatibel för en G27 trubbig-end nål och håller den på plats i två lägen för att rikta spetsen med den centrala axeln. En schematisk av munstycket prototypen visas i figur 1.
Munstycke design
Med hjälp av den utvecklade core/shell munstycke, integreras i en två-extruder Vitaprint system, ihåliga, rörformiga ställningar var fabricerade i en enda steg process. För att uppnå en jämn tjocklek av rörväggen genom de flesta av de förberedda byggnadsställningar, måste nålen placeras centralt på axeln av den yttre extrudering ringen. Standard gauge nålar uppvisar ofta en liten, men ändå betydande excentricitet utanför axeln. Sålunda, munstycket kroppen var avsedd att hålla nålen på två ställen, en gång på toppen (fastställande av navet) och en gång före den slutliga kärnan/skal kammaren (fastställande av kanyl själv), korrigera dess axiella anpassningen. Precisionen för den axiella justeringen ökar med avståndet mellan fixeringspunkten. Det finns dock en avvägning mellan nål längd och tillgängliga munstycke kammar volym. För att förbättra funktionaliteten hos set-up ytterligare, kan vissa modifieringar av munstycket implementeras: A) ett munstycke fäste med förbättrad stabilitet, B) ytterligare munstycken för ett bredare spektrum av nålkompatibilitet, C) en exakt justerningsmekanism för nål och D) integrering av ytterligare ingångar och mikrofluidiska anordningar för beredning av material i fluga.
Hydrogel optimering
För att fastställa den optimala ALG: CMC-kvoten utvärderades flera materialiterationer. Generellt har kärn-/skal tryck med koncentrationer över 3 WT% av båda komponenterna omöjliggjorts, eftersom det inte tillät ett kontinuerligt hydrogelflöde eller resulterade i igensättning av munstycket. Specifikt, ALG koncentration över 3 WT .% ökade viskositeten överdrivet och resulterade i munstycke igensättning, medan lägre ALG koncentrationer och högre CMC (> 3 WT .%) koncentrationer bromsade tvär bindningstider och därmed misslyckats med att ge tillräcklig strukturellt stöd av ställningen. Kärna/Shell utskrift var möjligt med mindre trögflytande formuleringar; extruderad gel viskositet måste dock vara tillräckligt för att upprätthålla långsiktig form trohet. I slutändan, en 1:1 ALG: CMC förhållandet har visat sig vara det lämpligaste valet som bekräftar en tidigare studie av Maver et al.49. Tillsatsen av NFC avsevärt förbättrad tryckbarhet och strukturell stelhet i Core/Shell tryckta ställningar men hade ingen signifikant effekt på tvär bindningsegenskaper av materialet.
Anpassade program, optimerade för specifika celltyper och experimentella uppställningar kommer att kräva välskräddade byggnads ställnings material, som kommer att variera i sammansättning och tvär bindningsmetoder. Den metod som beskrivs i detta arbete är baserad på en alginate-cellulosa blandad polymer lösning, som är tvärbunden joniskt med ca2 + joner. Alginat självt är en linjär polymer av block av (1,4)-länkade β-d-mannuronat (M) och α-l-guluronat (G) rester som kan vara reversibelt genom användning av ca2 + och andra divalenta katjoner såsom SR2 +, br2 +, mg 2 +. Icke desto mindre, den mest använda Jon för tvärbindning av alginat förblir ca2 + i form av CaCl2. Ca2 + kan även användas i form av Caso4 eller Caco3; den låga lösligheten hos CaSO4 i förhållande till CaCl2 innebär dock långsammare gelering. CaCO3 ger ännu långsammare gelationstider vilket kan resultera i svaga och inkonsekventa mekaniska egenskaper.
Längre gelation gånger producerar vanligtvis en mer homogen konstruktion, men vissa tillämpningar, såsom core/shell utskrift kräver snabb gelation priser50. Mg2 + joner inducerar också gelation; men deras cross-linking effektivitet är ca 5x-10X lägre, jämfört med ca2 +, med cross-linking tider på 2-3 h. Dessutom är magnesium joner mer selektiva mot guluroniska enheter, därav tvärbindning beror mer på den kemiska sammansättningen av ALG51. I detta fall är en snabb gelation hastighet avgörande för att säkerställa kontinuerlig ihåliga kanal bildning innan den ihåliga strukturen kan kollapsa. CaCl2 ger den snabbaste gelation hastighet, vilket är avgörande för direkt avsättning av ihåliga glödtrådar. 100 mM CaCl2 utnyttjades, som adekvat stabiliserade kontinuerlig bildandet av en ihålig glödtråden utan att orsaka gel stelning i munstycket.
Tryckning och efter bearbetning av byggnadsställningar
Följande steg bör övervägas under denna del av processen, inklusive 1) se till att alla lösningar och material inklusive 3D bioprinter är ordentligt steriliserade före utskrift. 2) vid beredning av hydrogel är homogenitet av materialet avgörande för kontinuerlig tryckning. Införandet av föroreningar eller luftbubblor bör undvikas, eftersom de kan täppa till munstycket och/eller störa extrudering. 3) sprutorna bör vara ordentligt anslutna till kärnan/skal munstycket via luer-lock-mekanismen och sättas in korrekt i extrudermonteringar som framgår av figur 2A, B. 4) innan du skriver ut en komplex struktur, det rekommenderas att pre-extrudera en liten del av gelen och cross-linking lösning för att rensa överskott luftbubblor i kärnan/skal munstycke och säkerställa en kontinuerlig hydrogel flöde. Detta kan införlivas direkt i g-koden för att förbättra repeterbarheten. 5) det är bra att lägga till en kjol som omger ställningen för att säkerställa utläggningen av en homogen ihålig glödtråden innan tryckningen av byggnadsställningen själv börjar.
Dessutom, 6) för att förbättra vidhäftning mellan tryck glödtråden och substrat, det rekommenderas att använda en plan yta med god vidhäftning (dvs, en glas bild eller petriskål). 7) extrudering munstycket bör inte vara i direkt kontakt med underlaget för att möjliggöra oavbruten flöde av hydrogel. Det initiala avståndet kommer starkt att påverka kvaliteten på utskriften, men tjockleken av extruderad glödtråden är en god approximation av den ursprungliga inställningen. 8) Start utskrifts höjden i g-koden bör justeras efter individuella behov. När utskrifts parametrarna har optimerats ska den byggnadsställning g-koden importeras till planet CNC-programvaran och utskriftsprocessen startas enligt beskrivningen i protokollet. 9) för att kontrollera och optimera hydrogel Flow med avsikten att skriva ut optimala ställningar bör både formulerings sammansättning och utskriftsparametrar varieras (dvs. utskriftshastighet, extrudering, tryck temperatur, avstånd mellan underlaget och extrudering munstycke, Lagerhöjd, byggnadsställning storlek, etc.).
I allmänhet krävs högre flödeshastigheter för att skriva ut formuleringar med högre viskositet. Som nämnts, alla hydrogel formuleringar, som är lämpliga för omedelbar kemisk tvärbindning, möjliggöra en-stegs tillverkning av ihåliga rör och kan användas med den beskrivna core/shell set-up. De tryck-och tvär bindnings ande mekanismerna måste optimeras i enlighet med detta. Efter utskrift, alla ställningar var efter bearbetas av sekundära tvärbindning med 5 WT .% CaCl2 lösning, som försäkrade fullständig tvärbindning av alg-CMC komponenten och steriliseras från båda sidor under en UV-ljus i minst 30 min. Det bör säkerställas att helt uppslukande ställningen med cross-linking lösning och inkubera tillräckligt länge för att slutföra tvär bindningsprocessen. Efter behandling kommer att variera beroende på den material och tvärbindning mekanism som används, som bör övervägas i förväg. Efter efter behandling bör byggnadsställningar avlägsnas försiktigt från underlaget, överföras till cell odlingsmediet och inkuberas i en kontrollerad atmosfär i minst 24 timmar före cell sådd. Med hjälp av ett färglöst medium kommer att förbättra synligheten av cellsuspensionen under injektion i ställningar.
Live/död analys
Den levande/döda lösningen bör förberedas direkt innan du utför analysen och förvaras i mörker innan du utför analysen, eftersom den innehåller fluorescensfärger som är benägna att blekning. Efter önskad inkubationstid ska cell odlingsmediet försiktigt kasseras runt byggnadsställningar och sköljas med PBS. Helst bör samma ingångspunkt användas för cell sådd följt av levande/död analys som injiceras i ställningar.
Betydelsen av resultat
Både ALG och CMC har redan använts för att främja angiogenes in vitro. Baserat på dess ECM-mimetic funktioner, fysiska tvärbindning, och biokompatibilitet, ALG har varit vanligt förekommande som en komponent för leverans och kontrollerad frisättning av angiogena tillväxtfaktorer (t. ex., bFGF, HGF, VEGF164, och ang-1 * respektive)52 ,53,54. Dessutom, i kombination med gelatin, CMC har också använts för att kapa vaskulära endotelceller på grund av dess snabbt tvär bindningsförmåga under fysiologiska förhållanden55. NFC har lagts till för att ytterligare öka den mekaniska stabiliteten och forma återgivningen av byggnadsställningar. Det bör understrykas att målet inte var att öka vaskularisering utan att Visa möjligheten att producera parfymera, ihåliga alg-CMC ställningar, tryckt i kärna/Shell mode, vilket också underlättar fastsättning och spridning av HUVECs. Valet att använda en ALG-CMC-blandning baserades på resultaten av vanliga, lättillgängliga och biokompatibla basmaterial som kunde möjliggöra kärn-/skal tryckning av ihåliga kanaler. Många andra material kan vara mer livskraftiga alternativ för att förbättra angiogenes; men vissa är inte lämpliga för kärna/skal utskrift, eftersom de inte underlättar snabb gelation/cross-linking, vilket är avgörande i detta tillvägagångssätt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna det ekonomiska stödet för detta projekt som erhållits från den slovenska forsknings byrån (bidrags nummer: P3-0036 och I0-0029), och ministeriet för vetenskap, utbildning och idrott (bidrags nummer: 5442-1/2018/59).
Alginic acid sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | 180947 | powder; Mw ~80,000 |
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] | LGC Standards (UK) | ATCC-CRL-1730 | Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings. |
Axiovert 40 inverted optical microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) | three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Germany) | C1016 | anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0% |
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) | The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) | nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns | |
ELGA Purelab water purification system | Veolia Water Technologies (UK) | ||
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | AMF4300 | a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications |
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 12491015 | high glucose; no glutamine; phenol red |
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 21063029 | high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red |
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 10270106 | FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS |
Hypodermic Sterican needle | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 9180117 | 0.40 x 25mm, 27G x 1'' |
L-glutamine | Sigma-Aldrich (Germany) | G3126 | ReagentPlus®, ≥99% (HPLC) |
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Sigma-Aldrich (Germany) | 4511 | contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence |
Nunc EasYFlask cell culture flasks | ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) | 156367 | Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2 |
Omnifix syringe | B. Braun Melsungen AG (Germany) | 4617053V | 5 mL Luer Lock |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich (Germany) | P3032 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich (Germany) | P4417 | tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C |
Sodium carboxymethyl cellulose | Sigma-Aldrich (Germany) | 419338 | powder; average Mw ~700,000 |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich (Germany) | S9137 | powder; BioReagent; suitable for cell culture |
Ultra-pure water | Veolia Water Technologies (UK) | 18.2 mΩ cm at 25⁰C | |
VitaPrint 3D bio-printer | IRNAS (Slovenia) |