Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Cheryl A. Hobbs; Leslie Recio; John Winters; Kristine  L. Witt

doi:10.3791/59955

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Article de méthode

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

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DOI :

10.3791/59955

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24 mars 2020

Cheryl A. Hobbs^*¹ , Leslie Recio¹ , John Winters¹ , Kristine L. Witt²

¹Toxicology Program, ILS, Inc., ²Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Résumé

L’essai de comète gagne en popularité comme moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules et les tissus cultivés, en particulier après l’exposition à des produits chimiques ou à d’autres facteurs de stress environnementaux. L’utilisation de l’analyse de la comète dans les essais réglementaires pour le potentiel génotoxique chez les rongeurs a été motivée par l’adoption d’une ligne directrice d’essai de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en 2014. Les diapositives d’analyse de comète sont généralement préparées à partir de tissus frais au moment de l’autopsie; cependant, la congélation d’échantillons de tissus peut éviter les problèmes logistiques associés à la préparation simultanée de diapositives à partir de plusieurs organes par animal et de nombreux animaux par étude. La congélation permet également d’expédier des échantillons de l’installation d’exposition à un autre laboratoire pour analyse, et le stockage des tissus congelés facilite le report d’une décision de générer des données sur les dommages à l’ADN pour un organe donné. L’essai de comète alcalin est utile pour détecter les ruptures d’ADN à double brin et à brin liés à l’exposition, les lésions alkali-labile, et les ruptures de brin associées à la réparation incomplète d’excision d’ADN. Cependant, les dommages à l’ADN peuvent également résulter de la tonte mécanique ou des procédures de traitement inadéquates de l’échantillon, confondant les résultats de l’essai. La reproductibilité dans la collecte et le traitement des échantillons de tissus pendant les nécropsies peut être difficile à contrôler en raison de la fluctuation du personnel de laboratoire avec des niveaux variables d’expérience dans la récolte des tissus pour l’essai de la comète. Il est coûteux d’améliorer la cohérence grâce à une formation de recyclage ou au déploiement d’unités mobiles dotées d’un personnel de laboratoire expérimenté et n’est pas toujours possible. Pour optimiser la génération constante d’échantillons de haute qualité pour l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’essai de comète, une méthode pour homogénéiser des cubes de tissu congelés flash à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire personnalisé a été évaluée. Des échantillons préparés pour l’analyse de la comète par cette méthode ont comparé favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés en mâmant pendant l’autopsie. En outre, de faibles dommages à l’ADN de base ont été mesurés dans les cellules des cubes congelés de tissu après stockage prolongé.

Introduction

L’essai de comète est de plus en plus utilisé comme un moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules cultivées et les tissus exposés à des produits chimiques ou d’autres facteurs de stress environnementaux¹. L’essai peut détecter des ruptures d’ADN à deux brins et à un brin, des lésions alkali-labile, et des ruptures à brin unique associées à la réparation incomplète de l’ADN. Le Conseil international pour l’harmonisation des exigences techniques pour les produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) recommande un analyse de rupture de brin d’ADN tel que l’analyse de la comète comme un deuxième test pour compléter l’essai de micronuclé....