Cartographie génétique des différences de thermotolérance entre les espèces de levure saccharomyces via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Résumé

L'hémizygosité réciproque par le séquençage (RH-seq) est une nouvelle méthode puissante pour cartographier la base génétique d'une différence de trait entre les espèces. Les piscines d'hémizygotes sont générées par la mutagénèse transposon et leur condition physique est suivie par la croissance concurrentielle utilisant le séquençage de haut-tout. L'analyse des données obtenues identifie les gènes sous-jacents au trait.

Résumé

Un objectif central de la génétique moderne est de comprendre comment et pourquoi les organismes à l'état sauvage diffèrent dans le phénotype. Jusqu'à présent, le champ a progressé en grande partie sur la force des méthodes de liaison et de cartographie d'association, qui tracent la relation entre les variantes de séquence d'ADN et le phénotype à travers la progéniture recombinante des accouplements entre les individus d'une espèce. Ces approches, bien que puissantes, ne sont pas bien adaptées pour caractéristiquer les différences entre les espèces isolées sur le plan de la reproduction. Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour la dissection à l'échelle du génome de la variation naturelle des caractères qui peut être facilement appliquée à des espèces incompatibles. Notre stratégie, RH-seq, est une mise en œuvre à l'échelle du génome du test de l'hémizygote réciproque. Nous l'avons exploitée pour identifier les gènes responsables de la croissance frappante à haute température de la levure Saccharomyces cerevisiae par rapport à son espèce sœur S. paradoxus. RH-seq utilise la mutagénèse transposon pour créer un pool d'hémizygotes réciproques, qui sont ensuite suivis par une compétition à haute température par le séquençage à haut débit. Notre flux de travail RH-seq tel qu'il est présenté ici fournit un moyen rigoureux et impartial de disséquer les caractères anciens et complexes dans le clade de levure en herbe, avec la mise en garde que le séquençage profond à forte intensité de ressources est nécessaire pour assurer une couverture génomique pour la cartographie génétique. Comme les coûts de séquençage baissent, cette approche est très prometteuse pour une utilisation future à travers les eucaryotes.

Introduction

Depuis l'aube du champ, il a été un objectif premier en génétique de comprendre la base mécaniste de la variation entre les individus sauvages. Comme nous cartographions les loci sous-jacents à un trait d'intérêt, les gènes émergents peuvent être d'une utilisation immédiate comme cibles pour le diagnostic et les médicaments, et peuvent faire la lumière sur les principes de l'évolution. La norme de l'industrie à cette fin est de tester une relation entre le génotype et le phénotype à travers une population par le biais de liaison ou d'association¹. Aussi puissantes que soient ces approches, elles ont une limitation clé : elles reposent sur de gr....

Protocole

1. Préparation du plasmide contenant du piggyBac pour la transformation

1. Streak out à des colonies simples de la souche E. coli hébergeant plasmide pJR487 sur une plaque d'agar LB carbenicillin. Incuber pendant 1 nuit à 37 oC ou jusqu'à l'apparition de colonies uniques.
   REMARQUE: Une description de la façon dont plasmid pJR487 a été cloné peut être trouvé dans notre travail précédent³.
2. Inoculer 1 L de LB et de carbenicilline à 100 g/mL avec une seule colonie d'E. coli contenant du pJR487 dans un flacon de verre de 2 L. Cultivez toute la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min jusqu'à ce qu'ils soient saturé....

Résultats

Nous avons accouplé S. cerevisiae et S. paradoxus pour former un hybride stérile, que nous avons soumis à la mutagénèse transposon. Chaque clone mutagénaire était un hémizygote, un hybride diploïde dans lequel un allèle d'un gène est perturbé (Figure 1A, Figure 2). Nous avons rivalisé les hemizygotes les uns contre les autres par la croissance à 39 oC et, dans une expérience distincte comme un contrôle, à 28 oC (

Discussion

Les avantages de RH-seq par rapport aux méthodes statistiques-génétiques précédentes sont plusieurs fois. Contrairement à l'analyse des liens et des associations, RH-seq offre une résolution de cartographie monogène; en tant que tel, il sera probablement d'une utilité significative, même dans les études de la variation des traits entre les individus d'une espèce donnée, ainsi que des différences interspécifiques. En outre, les tentatives précédentes à l'analyse réciproque de l'hémizygosité à l'échelle du génome ont utili.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-2 kits plasmidiques Gigaprep	Zymo Research	D4204	Le nombre de kits nécessaires dépend de l’efficacité de vos préparations dans chaque kit. Ce kit est livré avec 5 colonnes individuelles de préparation de plasmide. Passez 1 L de culture d’E. coli saturé dans chaque colonne de préparation, car l’utilisation de plus de 1 L par colonne peut provoquer l’obstruction du filtre de préparation, entraînant un faible rendement et un ADN de mauvaise qualité.
10X tampon Tris-EDTA (TE) (100 mM Tris-HCl et 10 mM EDTA)	Tout	filtre N/A	Stériliser à travers un 0,22 &mu ; m avant utilisation.
1M LiOAc	Tout	filtre N/A	Stériliser à travers un 0,22 &mu ; m avant utilisation.
300 mg/mL de généticine (G418)	Gibco	11811023
52 % de polyéthylène glycol (PEG) 3350	Sigma	1546547	Dissoudre dans l’eau et filtrer stériliser à travers un 0,22 &mu ; m avant utilisation. 1X mélange trafo : 228 uL 52 % PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X tampon TE
Bouillon liquide LB autoclavé	BD Difco	244620	Préparez le bouillon liquide LB en utilisant votre poudre de n’importe quelle marque et de l’eau milliQ. Autoclavez-le avant utilisation.
Stock de carbénicilline dans l’eau (100 mg/mL)	Tout	filtre N/A	Stériliser à travers un 0,22 &mu ; m avant utilisation.
Plaques complètes de gélose synthétique (24,1 cm x 24,1 cm) avec de l’acide 5-fluoroorotique (5-FOA) [0,2 % de mélange d’acides aminés sans uracile ou base d’azote de levure (YNB), 0,005 % d’uracile, 2 % de D-glucose, 0,67 % de YNB sans acides aminés, 0,075 % de 5-FOA]	5-FOA : Zymo Research, Mélange de décrochage : US Biological, Uracil : Sigma, D-glucose : Sigm), YNB : Difco	5-FOA : F9001-5, Mélange de décrochage : D9535, Uracil : U0750, D-glucose : G8270, YNB : DF0919
DMSO	Toute	N/A
E. coli porteuse de pJR487 (cochon CEN-/ARS+ plasmide contenant du Bac)	N/A	N/A	Demande du laboratoire Brem.
Souche de levure hybride JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)	N/A	N/A	Demande au laboratoire Brem.
Illumina Hiseq 2500			utilisé pour les lectures SE-150 Grands
incubateurs à agitation avec réglages de température variables	N’importe quelle	N/A
LB + plaques de gélose à la carbénicilline (100 &mu ; g/mL)	Gélose : BD Difco	Gélose : 214010	Fabriquer des plaques de gélose LB comme d’habitude et ajouter de la carbénicilline à 100 &mu ; g/mL avant le séchage.
Spectrophotomètre Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit Fluorimeter	Thermo Scientific	Q33240
Spermatozoïde de saumon ADN	Invitrogen	15632011
Bain-marie à 39° ; C	N’importe quel	N/A
Kit de préparation d’ADNg fongique de levure	Zymo Research	D6005
Milieu liquide de peptone de levure (YPD)	BD Difco	Peptone : 211677, Extrait de levure : 212750	Ajouter du D-glucose stérilisé par filtre à 2 % après autoclavage.
Plaques de gélose YPD + G418 (300 &mu ; g/mL)	Gélose : BD Difco	Gélose : 214010	Fabriquer des plaques de gélose YPD comme d’habitude et ajouter G418 à 300 &mu ; g/mL avant le séchage.
Plaques de gélose YPD Gélose	: BD Difco	Gélose : 214010