Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

Turgay Saritas; Victor  G. Puelles; Xiao-Tong Su; David  H. Ellison; Rafael Kramann

doi:10.3791/60002

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Article de méthode

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

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DOI :

10.3791/60002

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22 juillet 2019

Turgay Saritas¹ , Victor G. Puelles¹^,²^,³ , Xiao-Tong Su⁴ , David H. Ellison⁴^,⁵^,⁶ , Rafael Kramann¹^,⁷

¹Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, ²III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, ³Department of Nephrology, Monash Health, ⁴Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, ⁵Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, ⁶Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, ⁷Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

Dans cet article

Résumé

La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.

Résumé

Les techniques de compensation optique rendent le tissu transparent en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour la formation image tridimensionnelle (3-D) subséquente. Ils ont reçu une grande attention dans tous les domaines de recherche pour le potentiel d'analyser les structures microscopiques multicellulaires qui s'étendent sur des distances macroscopiques. Étant donné que les tubules de rein, la vascularisation, les nerfs, et le glomeruli s'étendent dans beaucoup de directions, qui ont été seulement partiellement capturées par les techniques bidimensionnelles traditionnelles jusqu'ici, dégagement de tissu a également ouvert de nombreux nouveaux secteurs de la recherche de rein. La liste des méthodes de compensation optique s'allonge rapidement, mais il reste difficile pour les débutants dans ce domaine de choisir la meilleure méthode pour une question de recherche donnée. Fourni ici est une méthode simple qui combine l'étiquetage des anticorps des tranches de rein de souris épaisses; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi; et l'imagerie confocale. Ce protocole décrit comment perfuter les reins et utiliser une étape de récupération d'antigène pour augmenter la liaison des anticorps sans avoir besoin d'équipement spécialisé. Son application est présentée dans l'imagerie de différentes structures multicellulaires dans le rein, et comment dépanner la pénétration des anticorps pauvres dans les tissus est abordée. Nous discutons également des difficultés potentielles de l'imagerie fluorophores endogènes et l'acquisition de très grands échantillons et comment les surmonter. Ce protocole simple fournit un outil facile à installer et complet pour étudier les tissus en trois dimensions.

Introduction

L'intérêt croissant pour l'étude d'organes entiers ou de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de méthodes de compensation optique qui impliquent l'imagerie de tissus transparents en trois dimensions. Jusqu'à récemment, les meilleures méthodes pour estimer le nombre, la longueur ou le volume des structures entières étaient la stérilisation ou la section sérielle exhaustive, qui est basée sur l'échantillonnage systémique des tissus pour l'analyse ultérieure en deux dimensions^1, ^{2 (en)} ^, ³. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et nécessite....