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Article de méthode

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

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DOI :

10.3791/60002

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22 juillet 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

Dans cet article

Résumé

La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.

Résumé

Les techniques de compensation optique rendent le tissu transparent en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour la formation image tridimensionnelle (3-D) subséquente. Ils ont reçu une grande attention dans tous les domaines de recherche pour le potentiel d'analyser les structures microscopiques multicellulaires qui s'étendent sur des distances macroscopiques. Étant donné que les tubules de rein, la vascularisation, les nerfs, et le glomeruli s'étendent dans beaucoup de directions, qui ont été seulement partiellement capturées par les techniques bidimensionnelles traditionnelles jusqu'ici, dégagement de tissu a également ouvert de nombreux nouveaux secteurs de la recherche de rein. La liste des méthodes de compensation optique s'allonge rapidement, mais il reste difficile pour les débutants dans ce domaine de choisir la meilleure méthode pour une question de recherche donnée. Fourni ici est une méthode simple qui combine l'étiquetage des anticorps des tranches de rein de souris épaisses; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi; et l'imagerie confocale. Ce protocole décrit comment perfuter les reins et utiliser une étape de récupération d'antigène pour augmenter la liaison des anticorps sans avoir besoin d'équipement spécialisé. Son application est présentée dans l'imagerie de différentes structures multicellulaires dans le rein, et comment dépanner la pénétration des anticorps pauvres dans les tissus est abordée. Nous discutons également des difficultés potentielles de l'imagerie fluorophores endogènes et l'acquisition de très grands échantillons et comment les surmonter. Ce protocole simple fournit un outil facile à installer et complet pour étudier les tissus en trois dimensions.

Introduction

L'intérêt croissant pour l'étude d'organes entiers ou de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de méthodes de compensation optique qui impliquent l'imagerie de tissus transparents en trois dimensions. Jusqu'à récemment, les meilleures méthodes pour estimer le nombre, la longueur ou le volume des structures entières étaient la stérilisation ou la section sérielle exhaustive, qui est basée sur l'échantillonnage systémique des tissus pour l'analyse ultérieure en deux dimensions1, 2 (en) , 3. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et nécessitent un niveau élevé de formation et d'expertise4. Les méthodes de compensation optique surmontent ces problèmes en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour rendre les tissus translucides pour l'imagerie 3D5,6,7.

Plusieurs méthodes de compensation optique ont été développées qui se divisent en deux grandes catégories : les méthodes à base de solvants et les méthodes aqueuses. Les méthodes aqueuses peuvent être encore divisées en immersion simple8,9, hyperhydratation10,11, et hydrogel encastrer12,13. Les méthodes à base de solvant déshydratent le tissu, enlèvent les lipides et normalisent l'indice de réfraction à une valeur d'environ 1,55. Les limites de la plupart des méthodes à base de solvants sont l'étanchéité de la fluorescence endogène des protéines journaliste couramment utilisées telles que le GFP, la toxicité des solvants, la capacité de dissoudre les colles utilisées dans certaines chambres d'imagerie ou lentilles objectives, et le rétrécissement des tissus pendant déshydratation14,15,16,17,18,19,20,21. Cependant, les méthodes basées sur les solvants sont simples, efficaces en temps, et peuvent fonctionner dans un certain nombre de différents types de tissus.

Les méthodes aqueuses s'appuient sur l'immersion du tissu dans des solutions aqueuses qui ont des indices réfractifs de l'ordre de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Ces méthodes ont été développées pour préserver l'émission endogène de protéines fluorescentes de reporter et pour empêcher le rétrécissement déshydraté-induit, mais les limites de la plupart des méthodes aqueuses-basées de compensation incluent une plus longue durée du protocole, l'expansion de tissu, et modification des protéines (c.-à-d. dénaturation partielle des protéines par urée dans des protocoles hyperhydratants tels que ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS a abordé l'expansion des tissus en combinant l'urée avec le sorbitol, qui contrebalance par déshydratation l'expansion des tissus induites par l'urée, et a préservé l'ultrastructure tissulaire telle qu'évaluée par microscopie électronique10. Le rétrécissement ou l'expansion des tissus affecte la taille absolue des structures, les distances entre les objets ou la densité cellulaire par volume; ainsi, la mesure des changements de taille au nettoyage du tissu peut aider à interpréter les résultats obtenus7,26.

En général, un protocole de compensation optique se compose de plusieurs étapes, y compris le prétraitement, la perméabilisation, l'immunoétiquetage (si nécessaire), l'appariement de l'indice réfractif et l'imagerie avec microscopie lumineuse avancée (p. ex. deux photons, confocal, ou microscopie de fluorescence par feuille de lumière). La plupart des approches de compensation ont été développées pour visualiser le tissu neuronal, et des études émergentes ont validé leur application dans d'autres organes5. Cet outil complet a été précédemment démontré pour permettre l'analyse fiable et efficace des structures rénales, y compris glomeruli27,28, immunisé infiltre28, vascularisation28, et les segments tubule 29, et c'est une approche idéale pour améliorer la compréhension de la fonction glomerulaire et le remodelage de tubule dans la santé et la maladie.

Résumé ici est une méthode à base de solvant qui combine l'immunostaining des tubules rénaux; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi (ECi); et l'imagerie par microscopie confocale qui permet une visualisation et une quantification complètes des tubules. Cette méthode est simple, combine la récupération d'antigènes de tranches de rein avec la coloration d'anticorps commerciaux, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires.

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Protocole

REMARQUE: Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, États-Unis, et les autorités locales compétentes à Aix-la-Chapelle, en Allemagne.

1. Perfusion aortique abdominale rétrograde et fixation des reins de souris

  1. Préparer les solutions le même jour ou le soir avant et conserver dans un réfrigérateur pendant la nuit. Solutions chaudes à température ambiante (RT) avant de l'utiliser.
  2. Faire un nouveau lot de paraformaldéhyde (PFA) de 3 % en saline tamponnée de phosphate 1x (PBS). Environ 50-100 mL DE PFA est nécessaire par souris.
    1. Pour faire 1 L de 3% PFA: Peser 30 g de PFA et ajouter 800 ml d'eau distillée dans le capot de fumée. Remuer et chauffer à 50-60 oC. Ne pas chauffer au-dessus de 70 oC.
      CAUTION: PFA est toxique. Préparer pfA dans le capot de fumée.
    2. Ajouter lentement plusieurs gouttes de 2N NaOH. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que PFA entre dans la solution ou ajouter quelques gouttes de plus. Certains petits morceaux ne se dissolvent pas.
    3. Retirer la solution du feu. Ajouter 50 ml de 20x PBS. Refroidir sur la glace à RT.
    4. Ajuster le pH à 7,3-7,4 avec HCl. Ajouter de l'eau distillée à 1 L.
    5. Enlever toutes les particules non dissoutes en filtrant 1x PBS et 3% PFA avec un filtre de 0,22 m.
  3. Ajouter 1 000 unités d'héparine à 1 L de 1x PBS. Transférer 1x PBS contenant de l'héparine et 3% de PFA dans 1x PBS dans des seringues en plastique séparées de 50 ml.
    REMARQUE: Si disponible, la pompe à pression contrôlée fixée à 80-100 mmHg ou la pression hydrostatique (méthode d'égouttement, la hauteur des solutions de perfusion : 160-200 cm au-dessus de l'animal) peut être utilisée pour la perfusion rénale.
  4. Connectez le PBS, le PFA et une aiguille de papillon émoussée de 21 G à un stopcock à trois voies. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans l'ensemble du système.
  5. Étiqueter un tube conique de 15 ml et y distribuer 10 ml de PFA.
  6. Anesthésiez profondément un mâle ou une femelle C57BL/6 souris 12-24 semaines d'âge en utilisant 120 mg/kg de kétamine et 16 mg/kg de xylazine. L'animal doit être vérifié pour l'absence complète de réactivité en pinçant les réflexes avant de procéder à la chirurgie (par exemple, réflexe de pincement d'orteil).
  7. Une fois que l'animal a atteint un plan chirurgical d'anesthésie, placez-le sur son dos sous le microscope disséquant. Ouvrez chirurgicalement l'abdomen avec une incision abdominale de midline utilisant des ciseaux d'opération et exposez l'aorte abdominale.
  8. Clamp l'aorte abdominale juste au-dessus de la ramification à l'artère iliaque avec un hemostat courbé. Puis serrer l'aorte abdominale juste en dessous des artères rénales avec un micro serrefine. Faire une petite incision (1 mm) sur l'aorte abdominale entre les deux pinces avec des ciseaux vannas. Insérez l'aiguille de papillon dans l'incision lentement et faites attention de ne pas déchirer l'aorte abdominale ouverte.
  9. Ligate l'artère rénale droite avec une suture de soie 5-0 et enlever le rein droit pour une autre analyse si un seul rein est nécessaire pour la perfusion et la fixation.
  10. Retirez la micro serrefine, transectez la veine du portail avec des ciseaux vannas, et perfillez immédiatement avec 50 ml de PBS contenant de l'héparine, puis changez et perflez avec 50 ml de 3 % de PFA.
    REMARQUE: Une pression de perfusion élevée par l'aorte abdominale est nécessaire pour ouvrir les tubules rénaux pour une meilleure diffusion des anticorps par le tissu. La perfusion par le cœur peut ne pas ouvrir les tubules rénaux.
  11. Ramassez soigneusement le rein perfusé et évitez de perforer ou de presser le tissu.
  12. Retirer la capsule et couper le rein en tranches coronales de 1 mm d'épaisseur. Utilisez une matrice de trancheur (Table of Materials) pour normaliser l'épaisseur des tranches.
    REMARQUE: Sinon, pensez à utiliser un vibratome.
  13. Immerger les tranches de rein avec le PFA préparé dans le tube conique étiqueté de 15 ml.
  14. Distribuer 10 mL de PFA à un autre tube conique étiqueté de 15 ml. Rincer le stopcock à trois voies et l'aiguille papillon avec PBS avant de passer à la souris suivante.
  15. Effectuer la post-fixation pendant la nuit à RT à l'abri de la lumière.

2. Préparation des tissus et immunostaining

  1. Après la post-fixation, laver la tranche de rein deux fois avec 1x tampon de lavage (Table of Materials) pendant 1 h sur un rocker horizontal à RT.
  2. Effectuer la récupération d'antigène. Chauffer 300 mL de solution antigène démasquée 1x (Tcapable de matériaux) dans un bécher de 500 ml à 92-98 oC. Enfermer la tranche dans la cassette d'intégration perméable au tampon chauffé en remuant pendant 1 h à 92-98 oC. Retirer le bécher du feu et laisser refroidir à RT.
    REMARQUE: Certains fournisseurs testent leurs anticorps pour l'application d'immunohistochimie et incluront une méthode suggérée de récupération d'antigène dans la feuille de données. Par conséquent, certaines épitopes peuvent nécessiter un tampon plus basique (p.p.ph 9).
  3. Transférer la tranche dans 10 ml de tampon de lavage 1x avec 0,1% Triton X-100 et la roche pendant la nuit à RT. Laver les tranches 2x avec 10 ml de tampon de lavage 1x frais pour 1 h le lendemain.
  4. Diluer l'anticorps primaire dans 500 l de diluant normal d'anticorps (Tableau des matériaux). Commencez par une concentration de 1:50-1:100. Incorporer délicatement la tranche de rein dans un anticorps primaire dilué pendant 4 d à 37 oC.
    REMARQUE: Étant donné que chaque anticorps a des propriétés uniques, la température pendant l'incubation des anticorps et les dilutions d'anticorps doivent être optimisées pour les sondes individuelles. Pour les contrôles secondaires d'anticorps seulement, incuber le tissu rénal dans le diluant sans anticorps primaire. Au lieu du diluant commercial d'anticorps, 1x PBS avec 0.1% Triton X-100 et 0.01% azide de sodium peuvent être employés.
  5. Laver la tranche de rein dans 10 ml de 1x tampon de lavage pendant la nuit à RT avec un changement de tampon de lavage après 8 h.
  6. Diluer les anticorps secondaires (p. ex. 1:100 pour les anticorps secondaires conjugués par Alexa Fluor) dans 500 L de diluant normal d'anticorps. Incuber les tranches de rein dans des anticorps secondaires dilués pendant 4 jours à 37 oC. À partir de cette étape, protégez les tranches de rein de la lumière.
  7. Laver les tranches de rein dans 10 ml de 1x tampon de lavage pendant la nuit à RT avec un changement de tampon de lavage après 8 h.

3. Défrichement des tissus

  1. Transférer la tranche de rein à 5 ml d'éthanol 100% de haute qualité (Table of Materials) pendant 2 h à RT avec bascule douce (avec un changement à l'éthanol frais après 1 h). Cette étape est pour la déshydratation des tissus.
    REMARQUE: L'éthanol de haute qualité est nécessaire pour atteindre une translucidité de tissu élevée dans l'étape suivante. Le méthanol ou le tétrahydrofuran sont des réactifs de déshydratation alternatifs à fort potentiel de délipidation.
  2. Immerger tranche de rein dans 2 ml d'ECi (Table of Materials) avec bascule douce à RT (avec un changement à ECi frais après 2 h) pendant la nuit.
    REMARQUE: Le point de congélation/fusion de l'ECi est de 6 à 8 oC. Par conséquent, ne pas stocker les échantillons dans le réfrigérateur. Conduisez l'immersion dans une hotte de fumée correctement ventilée et évitez le contact direct avec les vêtements et la peau (ECi est un composé non toxique approuvé par la Food and Drug Administration, mais a une forte odeur). Utilisez des tubes eppendorf réguliers ou des récipients en verre (pas de récipients en polystyrène).
  3. La translucidité tissulaire peut être atteinte après l'immersion d'ECi et lorsque les tranches de rein sont prêtes pour l'imagerie.

4. ConfocalImaging et analyse d'image

REMARQUE: Pour l'imagerie, d'autres techniques de microscopie peuvent être utilisées tant que la solution de correspondance de l'indice réfractif est compatible avec la lentille objective. Ce protocole utilise un microscope confocal inversé.

  1. Ajouter 600 à 1 000 l d'ECi dans le plat en verre (Tableaudes matériaux).
    REMARQUE: Évitez d'utiliser des plats réguliers de culture cellulaire, car eCi est un solvant organique qui va dissoudre les plats en plastique. De même, ECi pourrait attaquer les pièces en plastique / anneaux d'isolation sur les lentilles objectives. Consultez les rapports appropriés pour un aperçu des plats d'imagerie compatibles30 et des chambres imprimées 3D autofaites28.
  2. Transférer la tranche de rein translucide dans le plat. Placer un bordereau rond sur la tranche de rein pour appliquer une légère pression vers le fond de verre. Sceller le plat avec du film de paraffine (Table of Materials) pour éviter les fuites d'ECi.
    REMARQUE: Des organes entiers ou plusieurs tranches de tissu d'épaisseur millimétrique peuvent nécessiter une bordure (ciment dentaire ou élastomère de silicone; voir Tableau des matériaux)autour du tissu pour faire un eCi-pool pour l'échantillon.
  3. Placer le plat sur la plate-forme d'imagerie au microscope.
  4. Prenez plusieurs z-stacks et effectuez la couture. Commencez par une taille z-step de 5 m.
    REMARQUE: Envisagez d'utiliser de longues distances de travail (à partir de 5 mm) et des objectifs d'ouverture numérique élevée (0,9) pour l'imagerie de tranches ou d'organes de tissus très épais. Après l'imagerie, transférer le tissu à l'éthanol et le stocker dans un tampon de lavage ou un PBS avec 0,02 % d'azide de sodium.
  5. Analyser l'image à l'aide du rendu 3D avec un logiciel (Tableau des matériaux).

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Résultats

Les reins sont des organes complexes composés de 43 types de cellules différents31. La plupart de ces cellules forment de grandes structures multicellulaires telles que le glomeruli et les tubules, et leur fonction dépend fortement des interactions les unes avec les autres. Les techniques histologiques classiques 2D capturent partiellement ces grandes structures et peuvent manquer des changements focaux dans les structures intactes31. Ainsi, l'analyse 3D utilisant des techn...

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Discussion

Les techniques de compensation optique ont reçu une grande attention pour la visualisation 3D et la quantification de la microanatomie dans divers organes. Ici, la méthode de compensation solvant-basée (ECi) a été combinée avec l'immunolabeling pour l'imagerie 3-D des tubules entiers dans des tranches de rein. Cette méthode est simple, peu coûteuse et rapide. Cependant, d'autres questions de recherche peuvent être mieux répondues avec d'autres protocoles de compensation5. Il est également importan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

T. S. est soutenu par des subventions de la DFG German Research Foundation (332853055), else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197), et de la Faculté de médecine de la RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. est soutenu par des bourses de recherche de la Deutsche Gesellschaft fourrure Nephrologie, la Fondation Alexander von Humboldt, et le National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E est soutenu par la Fondation LeDucq. R. K. est soutenu par des subventions du DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de l'État de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) et du Centre interdisciplinaire de recherche clinique de l'Université RWTH Dachen (O3-11).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m filtreFisher Scientific09-761-112
15 mL tube coniqueFisher Scientific339650
21 G aiguille papillonBraunVenofix
3 voies robinet d’arrêtFisher ScientificK420163-4503
Logiciel d’analyse 3DBitplane AGIMARIS Logiciel d’analyse
3DCellprofilerlogiciel open source gratuit
5-0 suture de soieFine Science Tools18020-50
Seringues en plastique de 50 mLFisher Scientific14-817-57
Anticorps monoclonal anti-BrdURoche11296736001
Diluant d’anticorpsDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
Solution de récupération d’antigène à base de citrateVector LaboratoriesH-3300
Hémostat incurvéFisher Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
Microscope de dissectionMoticDSK-500
Cassettes d’enrobageCarl RothE478.1
ÉthanolMerck
Cinnamate d’éthyleSigma-Aldrich112372
Film flexible/Parafilm MSigma-AldrichP7793
Chèvre anti-AQP2Santa Cruz Biotechnologysc-9882
Cobaye anti-NKCC2N/A/ADOI : 10.1681/ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
HéparineSagent Pharmaceuticals401-02
HemostatAgnthos312-471-140
Bascule horizontaleLabnetS2035-E
Antenne d’imagerieIbidi81218
KétamineMWI Santé animale501090
Micro serrefineOutils de science fine18052-03
NaOHFisher ScientificS318-500
Ciseaux opératoiresMerit97-272
ParaformaldéhydeThermo Fischer ScientificO4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
Élastomère de siliconeWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
Azoture desodiumSigma-AldrichS2002
Trancheuse de tissusZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Ciseaux Acros OrganicsAC215682500
VannasFine Science Tools15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI Animal HealthAnaSed Inj SA (Xylazine)
100983 N

Références

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