Isolement des sous-ensembles macrophages et des cellules stromales des spécimens myocardiques humains et de souris

Résumé

Présenté ici est un protocole pour isoler divers sous-ensembles de macrophages et d'autres cellules non immunisées du myocarde humain et de souris en préparant une suspension de cellules simples par la digestion enzymatique. Des schémas de gating pour l'identification et la caractérisation basées sur la cytométrie de flux sont également présentés.

Résumé

Les macrophages représentent les populations de cellules immunitaires les plus hétérogènes et abondantes dans le cœur et sont au cœur de l'inflammation et des réponses réparatrices après une blessure cardiaque. La façon dont divers sous-ensembles de macrophages orchestrent les réponses immunitaires après une lésion cardiaque est un domaine de recherche actif. Présenté ici est un protocole simple que notre laboratoire effectue régulièrement, pour l'extraction des macrophages à partir de spécimens de myocarde de souris et de myocardes humains obtenus à partir d'individus sains et malades. En bref, ce protocole implique la digestion enzymatique du tissu cardiaque pour générer une suspension de cellules simples, suivie de la coloration d'anticorps, et de la cytométrie de flux. Cette technique convient aux essais fonctionnels effectués sur les cellules triées ainsi qu'au séquençage de l'ARN en vrac et à cellule unique. Un avantage majeur de ce protocole est sa simplicité, la variation minimale au jour le jour et la grande applicabilité permettant l'étude de l'hétérogénéité macrophage à travers divers modèles de souris et entités de maladie humaine.

Introduction

Les macrophages représentent le type de cellules immunitaires le plus abondant dans le cœur, et ils jouent un rôle significatif dans la génération de réponses inflammatoires et réparatrices robustes à la suite d'une blessure cardiaque^1,2,3^,4. Auparavant, notre groupe a identifié deux sous-ensembles principaux de macrophages dans le coeur murine dérivé des origines développementales distinctes^5,6. De façon générale, des populations distinctes de sous-ensembles de macrophage cardiaque ....

Protocole

Le protocole présenté a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tous les sujets donnent un consentement éclairé avant la collecte de l'échantillon et les expériences sont effectuées conformément au protocole d'étude approuvé. Le protocole présenté est exécuté avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de la Washington University School of Medicine et suit les lignes directrices décrites dans le Guide des NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation de spécimens de tissus cardiaques humains

1. Rincer les cœ....

Résultats

Le protocole décrit permet l'isolement des macrophages de la souris et du myocarde humain. En utilisant le même protocole, mais avec une stratégie différente de coloration et de gating, les cellules stromales peuvent également être récoltées à partir du myocarde humain. Les résultats de FACS présentés ici ont été acquis soit sur la plate-forme BD LSRII ou BD FACS ARIA III. Des contrôles de compensation ont été produits à partir d'échantillons de contrôle de couleur unique des splenocytes .......

Discussion

Le protocole permet l'extraction de divers sous-ensembles de macrophages à partir du myocarde humain. Le protocole est simple et prend de 3 à 4 heures pour préparer une suspension à cellule unique prête pour l'analyse FACS. Bien que le protocole soit relativement simple à exécuter, il y a certains aspects techniques qui doivent être considérés qui minimiseront la variabilité. Tout d'abord, travailler en temps opportun avec les tissus humains est nécessaire pour une viabilité cellulaire optimale. Il est important de garde.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
15 mL Tubes conocaux	Thermo Fisher	14-959-53A
40 & micro ; m Filtres à cellules	Thermo Fisher	50-828-736
50 mL Tubes coniques	Thermo Fisher	352098
Tampon de lyse ACK	Gibco	A10492-01
Albumine sérique bovine	Sigma	A2058
Collagénase 1	Sigma	C0130-1G
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM 1x	Gibco	11965-084
DNAse 1	Sigma	D4527-20KU
DRAQ5	Thermo Fisher	62251
EDTA 0,5 M pH 8	Corning	46-034-CI
		désactivation des enzymes	490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Tampon			976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0,5 m)
Fœtal Sérum bovin	Gibco	A3840201
Forceps	VWR	82027-406
HBSS 1x	Gibco	14175-079
Hémostatiques	VWR	63042-052
Hyaluronidase type 1-s	Sigma	H3506-500MG
PBS 1x	Gibco	14190-136
Boîtes de Pétri	Thermo Fisher
lame de rasoir	VWR	55411-050
Ciseaux	VWR	82027-578

Tampon de172931