Ici nous présentons un protocole mécanique de dissociation pour isoler rapidement des macrophages du ganglion de racine dorsal pour le phénotypage et l'analyse fonctionnelle.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il y a des intérêts croissants pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels dans les ganglions de racine dorsal après des dommages périphériques de nerf. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages, sont connues pour répondre à une lésion tissulaire par phagocytose, présentation d'antigène, et libération de cytokine. Les preuves émergentes ont impliqué la contribution des macrophages de ganglions de racine dorsale au développement neuropathique de douleur et à la réparation axonale dans le contexte des dommages de nerf. Le phénotypage rapide (ou « isolement rapide de ») la réponse des macrophages de ganglions de racine dorsal dans le contexte des dommages de nerf est désirée pour identifier les facteurs neuroimmuns inconnus. Ici, nous démontrons comment notre laboratoire isole rapidement et efficacement les macrophages des ganglions de racine dorsal à l'aide d'un protocole de dissociation mécanique sans enzymes. Les échantillons sont conservés sur la glace tout au long pour limiter le stress cellulaire. Ce protocole prend beaucoup moins de temps que le protocole enzymatique standard et a été couramment utilisé pour notre analyse de tri cellulaire activée par fluorescence.
Introduction
Il existe maintenant des preuves considérables que les cellules immunitaires contribuent à la douleur neuropathique suite à une lésion nerveuse périphérique1,2. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages mûrs, sont connues pour répondre aux dommages de tissu et à l'infection systémique par la phagocytose, la présentation d'antigène, et la libération de cytokine. Parallèlement à l'activation des microglies induites par les lésions nerveuses dans la corne dorsal spinale, les macrophages dans les ganglions de racine dorsal (DRG) se développent également de manière significative après des dommages de nerf3,4. Notamment, il y a des intérêts croissants pour déterminer si les macrophages contribuent au développement neuropathique de douleur après la blessure périphérique de nerf en interagissant avec des neurones sensoriels dans le DRG5,6,7, 8 Annonces , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. En outre, des études récentes impliquent également la contribution des macrophages de DRG dans la réparation axonale après des dommages de nerf12,13. Une autre étude suggère en outre que les sous-populations de macrophages (c.-à-d. CD11b-Ly6Csalut et CD11b-Ly6Cfaible /- cellules) peuvent jouer un rôle différent dans l'hypersensibilité mécanique14. Par conséquent, le phénotypage rapide de la réponse des macrophages de DRG dans le contexte des dommages de nerf peut nous aider à identifier des facteurs neuroimmuns contribuant à la douleur neuropathique.
Conventionnellement, le protocole pour isoler les macrophages dans le DRG implique plusieurs étapes, y compris la digestion enzymatique15,16. La technique prend souvent beaucoup de temps et peut être coûteuse pour des expériences à grande échelle. Bien que la digestion douce avec le type II de collagène (4 mg/mL) et le type de dispase II (4.7 mg/mL) pendant 20 min ait été recommandée précédemment15,il est concevable que les cellules après l'exposition à cette enzyme soient sujettes aux dommages cellulaires ou à la mort cellulaire, qui peuvent mener à de bas produire. En outre, la différence dans la qualité des enzymes d'un lot à l'autre peut avoir un impact supplémentaire sur l'efficacité de ce processus. Plus important encore, les macrophages exposés à la digestion enzymatique pourraient être stimulés de façon irréprossable et peuvent donc être très différents du statut in vivo. Les changements peuvent potentiellement compliquer les résultats de l'étude fonctionnelle.
Ici nous décrivons un protocole enzyme-libre pour isoler rapidement des macrophages de DRG à 4 oC utilisant la dissociation mécanique. Les échantillons sont conservés sur la glace pour limiter le stress cellulaire. En conséquence, notre approche fournit un avantage pour maintenir la cohérence de l'isolement, et les cellules isolées sont probablement plus saines et moins stimulées. Nous présentons en outre les preuves pour valider la qualité des cellules isolées avec l'analyse de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie à San Francisco et ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Recueillir d'autres DRG lombaires à partir de souris expérimentales
- Avant de commencer l'expérience, préparez la solution de travail du milieu de gradient de densité (par exemple, Percoll) en mélangeant 9 volumes du milieu avec 1 volume de Ca/Mg- sans 10x HBSS. Gardez-le sur la glace.
- Anesthésiez la souris avec 2,5% D'Avertin. Confirmez que l'animal est entièrement anesthésié par l'absence de réponse à la pince de patte arrière.
REMARQUE: Des souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées. - Perfil la souris transcardialement avec 10 ml de 1x PBS pré-réfrigéré.
- Placez la souris en position de supine avec quatre pattes fixées avec le ruban adhésif à l'intérieur d'une hotte de fumée chimique. Soulevez la peau sous la cage thoracique par les forceps, et faites une petite incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer le foie et le diaphragme.
- Continuer à utiliser des ciseaux pour couper le diaphragme et la cage thoracique, ouvrir la cavité pleurale pour exposer le cœur battant.
- Coupez rapidement l'appendice auriculaire droit avec des ciseaux d'iris. Une fois que le saignement est noté, insérez une aiguille de 30 G dans l'extrémité postérieure du ventricule gauche, et injectez lentement 10 ml de 1x PBS pré-réfrigéré pour perfuser l'animal.
- Effectuer lalactomie dorsal15 sur la souris placée à la position couchée.
REMARQUE : Si la culture cellulaire est planifiée, vaporisez la souris avec 70 % d'éthanol avant l'incision et utilisez des instruments chirurgicaux pré-stérilisés pour la dissection.- Utilisez un scalpel de taille 11 pour faire une incision latérale longitudinale profonde à partir de la région thoracique jusqu'à la région sacrée. Enlever la peau par les ciseaux pour exposer la couche musculaire dorsal.
- Utilisez Friedman-Pearson Rongeur pour décoller les tissus conjonctifs et les muscles jusqu'à ce que les processus de la colonne vertébrale lumbosacrale et les processus transversaux bilatéraux soient exposés.
- Utilisez un ciseaux de ressort Noyes pour ouvrir soigneusement la colonne vertébrale dorsale, puis passez à un Rongeur Friedman-Pearson pour enlever les os vertébraux pour exposer la moelle épinière avec les nerfs rachidiens intacts attachés.
- Disséquez soigneusement le DRG lombaire ipsilatéral et contralatéral (L4/L5 DRG dans notre étude)et placez-le dans 1 ml de Ca glacé-/Mg-sans 1x HBSS dans un homogénéisateur de tissu de Dounce. Maintenant, les tissus sont prêts pour l'étape 2.
REMARQUE : Couper le nerf spinal attaché au DRG si possible.
2. Isoler les cellules simples de la souris lombaire DRG
- Homogérisez le tissu DRG avec un pilon lâche dans l'homogénéisateur Dounce 20-25 fois.
- Placer une passoire stérile à cellules de nylon de 70 m dans un tube conique stérile de 50 ml. Mouillez la passoire cellulaire avec 800 l de 1x HBSS à froid, et l'écoulement est recueilli dans le tube conique.
- Recueillir la suspension de tissu homogénéisé de l'homogénéisateur à l'aide d'une pipette et passer à travers la passoire humide de 70 m en nylon dans le tube conique de 50 ml.
- Rincer l'homogénéisateur deux fois avec 800 l de 1x HBSS glacé, puis décander dans le même tube conique de 50 ml avec une passoire cellulaire pour augmenter le rendement.
- Ajouter 1,5 ml de milieu de gradient isotonique de densité isotonique glace-froid récalcitré (préparé à l'étape 1.1) dans un tube stérile de 5 ml de polystyrène FACS.
- Transférer l'homogénéité cellulaire du tube conique de 50 ml (à l'étape 2.4) dans le tube FACS, bien mélanger avec le milieu de gradient de densité par pipetting de haut en bas. Ajouter 500 l de 1x HBSS supplémentaires pour sceller le dessus.
- Pelleter les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 20 min à 4 oC.
- Aspirez soigneusement le supernatant contenant de la myéline dans le milieu sans déranger la pastille cellulaire au fond du tube FACS.
- Resuspendre les cellules dans le tampon PBS ou FACS contenant 5% de sérum bovin fœtal (FBS) pour l'analyse FACS.
REMARQUE : Au moins 50 000 à 100 000 cellules sont attendues de L4 /L5 DRG d'une souris.- Resuspendre les cellules DRG isolées mécaniquement (L4/L5) dans 100 OL de PBS contenant 5 % de sérum bovin fœtal, puis couver avec un anticorps CX3CR1-APC (1:2 000) dans l'obscurité à 4 oC pour 1 h.
- Laver les cellules avec 5 ml de PBS une fois; centrifugeuse des cellules 360 x g pendant 8 min à 4 oC.
- Aspirez le supernatant, puis suspendez la pastille cellulaire en 300 L de PBS pour l'analyse FCAS. Si le tri cellulaire est planifié, resuspendre les cellules dans le tampon FACS à la place.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Pour valider les cellules isolées, nous avons d'abord choisi les souris transgéniques Macrophage Fas-Induced Apoptosis (MAFIA)17. Cette ligne exprime un gène de fusion de suicide FK506-Fas inductible de drogue-inductible (FKBP)-Fas et protéine fluorescente verte (eGFP) sous le contrôle du promoteur du récepteur CSF1 (CSF1R), qui est spécifiquement exprimé dans les macrophages et les microglies. L'injection systémique du dimerizer de protéine FK-contraignant, AP20187 (AP), induit l'apoptosis des ce...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ici, nous introduisons une nouvelle méthode pour enrichir efficacement les macrophages isolés de la souris DRG. L'approche conventionnelle pour isoler les cellules immunitaires DRG nécessite une digestion enzymatique15,18, qui est maintenant remplacé par l'homogénéisation mécanique dans notre protocole pour limiter les dommages cellulaires indésirables et augmenter le rendement. Par conséquent, le nouveau protocole prend beaucoup moins de temps. Plus important en...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent lié à ce manuscrit.
Remerciements
L'étude a été soutenue par : Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); le Département d'anesthésie et de soins périopératoires de l'UCSF (XY); et 1R01NS100801-01(GZ). Cette étude a été appuyée en partie par le Laboratoire d'analyse cellulaire des ressources partagées du CCSDHc grâce à une subvention des NIH (P30CA082103).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α ;-souris CX3CR1-APC anticorps | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Crépine cellulaire (nylon 70 mm) | Falcon | 352350 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5810R | |
| Homogénéisateur de tissus Dounce | Wheaton | 357538 ( 1ml) | |
| Tubes FACS (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, sans Ca++/Mg++) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Iodure de propidium | Sigma | P4864-10ml |
Références
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029(2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460(2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Étiquettes
Isolement des macrophagesdissociation sans enzymeprotocole de dissociation mécaniquetri cellulaire activé par fluorescencecentrifugation sur gradient de densitémarquage par anticorps CX3CR1évaluation de la viabilité cellulairehomogénéisation du tissu des ganglions racines dorsalesmodèle de lésion nerveuse
