Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Summary

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) utilise la cytométrie du débit pour détecter sensible les différences dans l'abondance des interactions protéines-protéines ciblées entre deux échantillons. QMI peut être effectué en utilisant une petite quantité de biomatériau, ne nécessite pas d'étiquettes génétiquement modifiées, et peut être adapté pour tout réseau d'interaction protéique précédemment défini.

Abstract

Les interactions dynamiques protéines-protéines contrôlent le comportement cellulaire, de la motilité à la réplication de l'ADN en passant par la transduction du signal. Cependant, il est techniquement difficile de surveiller les interactions dynamiques entre plusieurs protéines dans un réseau d'interaction protéique. Ici, nous présentons un protocole pour l'immunoprécipitation multiplexe quantitative (QMI), qui permet l'évaluation quantitative des changements de pli dans les interactions protéiques basées sur des mesures relatives de fluorescence des protéines dans les complexes partagés détectés par Exposed Épitopes de surface (PiSCES). Dans QMI, les complexes protéiques des lysates cellulaires sont immunoprécipités sur les microsphères, puis sondés avec un anticorps étiqueté pour une protéine différente afin de quantifier l'abondance du PiSCES. Les anticorps immunoprécipitations sont conjugués à différentes régions spectrales magbead, ce qui permet à un cytomètre de flux de différencier plusieurs immunoprécipitations parallèles et de quantifier simultanément la quantité d'anticorps de sonde associée à chacune. QMI n'exige pas le marquage génétique et peut être effectué en utilisant un biomatériau minimal par rapport à d'autres méthodes d'immunoprécipitation. QMI peut être adapté pour n'importe quel groupe défini de protéines en interaction, et a jusqu'à présent été utilisé pour caractériser les réseaux de signalisation dans les lymphocytes T et les synapses neuronales de glutamate. Les résultats ont mené à la nouvelle génération d'hypothèse s'est chargée d'applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Ce protocole comprend des instructions pour effectuer QMI, de la sélection initiale du panneau d'anticorps jusqu'aux essais en cours d'exécution et à l'analyse des données. L'assemblage initial d'un test QMI consiste à filtrer les anticorps pour générer un panneau et à déterminer empiriquement un tampon de lyse approprié. La préparation subséquente de réactif inclut covalently accouplement des anticorps d'immunoprécipitation aux MagBeads, et anticorps de sonde de biotinylating de sorte qu'ils puissent être étiquetés par un fluorophore streptavidin-conjugué. Pour exécuter l'essai, le lysate est mélangé avec des MagBeads pendant la nuit, puis les perles sont divisées et incubées avec différents anticorps de sonde, et puis une étiquette de fluorophore, et lues par cytométrie de flux. Deux tests statistiques sont effectués pour identifier les PiSCES qui diffèrent considérablement entre les conditions expérimentales, et les résultats sont visualisés à l'aide de cartes thermiques ou de diagrammes de nœuds.

Introduction

Les interactions protéines-protéines dynamiques constituent les cascades de signalisation moléculaire et les structures motiles qui sont la base fonctionnelle de la plupart des physiologie cellulaires¹. Ces processus sont souvent représentés comme des voies de signalisation linéaires qui passent d'un état stable à partir d'entrées uniques, mais les données expérimentales et de modélisation montrent clairement qu'elles fonctionnent comme des réseaux intégrés^{2,3, 4}. Dans le cas des protéines G, différents récepteurs ont souvent la capacité d'activer la ....

Protocol

1. Conception d'assay

1. Préparation d'anticorps candidat
   1. Pour chaque protéine d'intérêt, choisissez 3 à 5 anticorps à l'écran. Dans la mesure du possible, utilisez des anticorps monoclonaux qui reconnaissent différents épitopes. Inclure également un anticorps de contrôle non spécifique.
   2. Pour supprimer Tris, effectuez un échange de mémoire tampon en ajoutant l'anticorps à un filtre de rotation de 30 kDa, en tournant jusqu'à son volume minimum, en ajoutant 500 l de salin tamponné par phosphate (PBS), et en répétant 3 fois. Pour enlever les protéines porteuses, effectuer la purification des anticorps selon le protocole du fabricant (voir

Results

Dépistage des anticorps
Figure 2 B montre les résultats d'un écran pour la protéine Connexin36. La plupart des combinaisons IP-probe ne produisent aucun signal sur les commandes IgG. Ip avec l'anticorps monoclonal 1E5 et sonde avec 1E5 ou l'anticorps polyclonal 6200 produit un décalage vers la droite dans la distribution de perles par rapport aux contrôles IgG. Ici, IP 1E5 et sonde 6200poly ont été sélectionnés pour éviter d'utiliser le même anticorps que.......

Discussion

L'analyse QMI exige des investissements substantiels dans le développement de panneaux d'anticorps, l'équipement et les réactifs, mais une fois l'analyse établie, on peut recueillir des données de haute dimension observant les réseaux d'interaction protéique lorsqu'ils répondent à des Stimuli. Techniquement, l'Agence QMI exige un tuyautage minutieux et un suivi des emplacements des puits d'échantillons et d'anticorps. L'étiquetage minutieux des plaques d'analyse est utile, tout comme la fabrication d'un modèle détaillé d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaques à fond plat 96 puits	Bio Rad	171025001
Plaques PCR 96 puits	Système VWR	82006-704
Bioplex 200 avec HTF	Bio Rad	171000205	modifié pour conserver partiellement réfrigéré, voir Figure S1 pour plus de détails
Station de lavage Bio-Plex Pro Bio	Rad	30034376
BSA	Sigma
Perles CML	Invitrogen	C37481
EDTA	Sigma	E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	A39256
MagPlex Microspheres	Luminex	MC12xxx-01	xxx est la région de perle à 3 chiffres
Melon Gel IgG Spin Purification Kit	Thermo Scientific	45206	utilisé pour la purification
MES	Sigma	M3671
Film microplaque, non stérile	USA Scientific	2920-0000
Cocktail inhibiteur de phosphotase #2	Sigma	P5726
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma	P8340
Sandwich Prep Réfrigérateur	Norlake	SMP 36 15	pour la réfrigération sur mesure de Bioplex 200
Sodium fluorure	Sigma	201154
Orthovanadate de sodium	Sigma	450243
Streptavidin-PE	BioLegend	405204
Sulfo	NHS Thermo Scientific	A39269
Tris	Fisher Scientific	BP152