Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes humaines offrent un système puissant pour étudier la fonction génique et modéliser des mutations spécifiques pertinentes à la maladie. La génération de modifications génétiques hétérozygotes précises est difficile en raison de la formation d'indéléves médiées par CRISPR-CAS9 dans le deuxième allèle. Ici, nous démontrons un protocole pour aider à surmonter cette difficulté en utilisant deux modèles de réparation dans lesquels un seul exprime le changement de séquence souhaité, tandis que les deux modèles contiennent des mutations silencieuses pour empêcher la re-coupe et la formation d'indel. Cette méthodologie est plus avantageuse pour l'édition de gènes codant les régions de l'ADN pour générer le contrôle isogénique et les lignées de cellules souches humaines mutantes pour étudier la maladie humaine et la biologie. En outre, l'optimisation des méthodologies de transfection et de dépistage a été réalisée pour réduire le travail et le coût d'une expérience d'édition de gènes. Dans l'ensemble, ce protocole est largement applicable à de nombreux projets d'édition du génome utilisant le modèle de cellules souches pluripotentes humaines.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des outils précieux pour modéliser les maladies humaines en raison de leur capacité de renouvellement, tout en maintenant la capacité de générer des types cellulaires de lignées différentes^{1,2 ,3,4}. Ces modèles ouvrent la possibilité d'interroger la fonction génique, et de comprendre comment des mutations spécifiques et des phénotypes sont liés à diverses maladies^5,6. Cepend....

Protocole

1. Conception et construction de l'ARN de guide (gRNA)

REMARQUE: Chaque gRNA est composé de deux 60 paires de base (bp) oligonucléotides qui sont annealed pour générer un 100 bp double échoué (ds) oligonucléotide (Figure 1A-C). Le délai pour la conception, la génération et l'efficacité de coupe de test de gRNA est d'environ 2 semaines (figure 2).

1. Sélectionnez la région d'adn d'intérêt à modifier le génome et identifiez 3-4 23 bp séquences qui correspondent au format, 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Ces séquences devraient être situées à moins de 20 pb de la r....

Résultats

Génération de gARN et dépistage des indels

Chaque gRNA sera cloné dans un vecteur plasmide et exprimé à l'aide du promoteur U6. L'enzyme de restriction AflII est utilisée pour linéariser le plasmide (addgene #41824) et est située après le promoteur U6. La bande de 100 pb générée après l'annexion des deux oligos de 60 pb est clonée dans le vecteur d'expression gRNA à l'aide de l'assemblage de l'ADN. Une fois que les plasmides gRNA sont générés, ils sont transfectés en .......

Discussion

Dans ce protocole, l'utilisation de CRISPR-CAS9 ainsi que de deux modèles de réparation ssODN pour générer des changements spécifiques du génome hétérozygote ou homozygotes est démontrée dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode a eu comme conséquence la génération réussie des lignées cellulaires isogéniques exprimant des changements génomiques hétérozygotes avec une efficacité proche de 10%. Ce protocole a été optimisé pour les ESC humains et les iPSC cultivés sur des MEF irradiés qui soutiennent l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec capuchon de filtre cellulaire	Corning	352235
Boîtes de culture tissulaire en polystyrène à 6 puits	Corning	353046
AflII endonucléase	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 moyen	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
			tri de cellules activées par fluorescence (FACS)
Kit d’extraction de gel	Macherey-Nagel	740609
Gibson Kit d’assemblage	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB Plaques de gélose contenant 50 &mu ; g/ml de kanamycine
Réactif de tige de lipofectamine	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel à facteur de croissance réduit (DFG)	Corning	354230
Fibroblastes embryonnaires murins (MEF)
Extraction de gel de nucléospine et kit de nettoyage par PCR		Macherey-Nagel
vecteur pCas9_GFP	Addgene	44719
Tubes de bandelettes PCR	USA Scientific	1402-2900
Phusion Haute Fidélité ADN Polymérase et 5× ; Tampon Phusion	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Kit de minipréparation rapide de plasmide	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM Cellules Escherichia coli électrocompétentes	TakaraTM
SOC	New England Biolabs	B9020S
Enzyme express TrypLE	ThermoFisher	12605036
Dichlorhydrate de Y-27632/inhibiteur de ROCK (ROCKi)	Tocris	1254

Appareil de Incubateur à agitation orbitale 740609 Milieu 636763