Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.
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Article de méthode
Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie
Dans cet article
Résumé
Résumé
La surface oculaire (OS) se compose d'une feuille épithéliale avec trois parties reliées : conjonctive palpébrale, conjonctive bulbar et épithélium cornéen. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Dans les modèles animaux expérimentaux avec certaines modifications génétiques ou opérations artificielles, il est utile d'examiner toutes les parties de la feuille épithéliale OS pour évaluer les changements pathogénétiques relatifs de chaque partie en parallèle. Cependant, la dissection du tissu d'OS dans son ensemble sans distorsion ou dommages a été difficile, principalement en raison de la douceur et la minceur de l'OS apposé sur les paupières physiquement séparées mais mobiles et globe oculaire. En outre, la douille oculaire profonde formée par le crâne dur / os orbitaux est entièrement occupé par le globe oculaire laissant un espace limité pour l'exploitation des dissections. En conséquence, la dissection directe du globe oculaire avec les tissus associés os du côté facial conduirait souvent à des dommages de tissu, particulièrement la conjonctive palpébrale et bulpale. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement d'une tête de souris coupée en deux, laissant des paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tout à fait en une seule pièce. L'intégrité de la feuille d'OS était bien préservée et pouvait être examinée par histologie ou immunostaining dans une seule section.
Introduction
La surface oculaire se compose d'une feuille continue d'épithélium régionalisé comprenant la conjonctive palpébrale, la conjonctive bulbar et la cornée1. Beaucoup de structures glandulaires sont associées à l'épithélium de surface oculaire et génèrent ensemble une couche de film lacrymal protégeant la surface de cornée du séchage et des invasions environnementales2. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Les facteurs génétiques et les irritants environnementaux ou leurs interactions contribuent à des altérations pathologiques de l'OS
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Protocole
Toutes les procédures impliquant l'utilisation de souris ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux, zhongshan Ophthalmic Center, et ont adhéré à l'énoncé ARVO pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Dissection du globe oculaire avec la surface oculaire intacte et les paupières
- Disséquer la tête.
- Euthanasier les souris postnatales 10 (P10) et P28 (voir le Tableau des matériaux pour les souches de souris) par luxation cervicale, couper la tête du cou par une paire de ciseaux pointus.
- Tête de bisect avec une paire de ciseaux droi....
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Résultats
Les principaux os du crâne vus sous différents angles ont été illustrés dans la figure 1A-E, avec des couleurs dénotant différents os. Nous avons utilisé un animal de quatre semaines pour la démonstration des processus de dissection. Après les étapes de dissection 1.1.1-1.1.3 et une préfixation courte (étape 1.1.4), le globe oculaire avec les os faciaux associés sont démontrés dans la figure 1E. .......
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Discussion
Un rappel critique pour la préparation du globe oculaire intact est que tous les os orbitaux doivent être enlevés complètement, en particulier les os juga et lacrimal, qui sont petits et situés près du fond de la douille oculaire. Les os restants peuvent compliquer l'histologie qui s'ensuit. Dans le cas où un petit morceau d'os n'a pas été complètement enlevé de la dissection par accident, il peut être choisi à partir du bloc de paraffine d'emcasterie utilisant une paire de sharptweezers. Le trou laissé derrière doit êtr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les auteurs remercient le professeur Rong Ju pour la lecture critique du manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, Chine), le Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), « Plan 100 personnes » de l'Université Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), et le financement de la recherche du State Key Laboratory of Ophthalmology du Zhongshan Ophthalmic Center (30306020202400339; Guangzhou, province du Guangdong, Chine).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1& fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| Tube à centrifuger 50ml | Corning | 430829 | |
| Lames de microscope adhésives | Divers | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Concentration suggérée 1:500 - 1 000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Concentration suggérée 1:500 - 1 000 |
| Anticorps anti-K12 | Abcam | ab124975 | Concentration suggérée 1:1 000 |
| Anticorps anti-K14 | Abcam | ab7800 | Concentration suggérée 1:800 |
| Acide citrique | Divers | ||
| Lame de couverture | Divers | ||
| Pinces courbes | World Precision Instruments | 14127 | |
| Microscope à dissection. | Olmpus | SZ61 | |
| Alcool éthylique | Divers | ||
| Microscope fluorescent | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Supports de montage | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissection ciseaux-lame droite | World Precision Instruments | 503242 | |
| Fours à micro-ondes | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Souches de souris | C57/BL6 et Sv129 mixtes | ||
| N° 4 pince droite | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Sérum de chèvre normal | Divers | ||
| Paraformaldéhyde (PFA) | Divers | Préparez une solution à 4 % en 1& fois ; PBS et filtre avec 0,45&mu ; m membrane filtrante | |
| Boîte de culture tissulaire | Divers | ||
| Citrate trisodique | Divers | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
Références
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al.
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Réimpressions et autorisations
