Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.

Résumé

La surface oculaire (OS) se compose d'une feuille épithéliale avec trois parties reliées : conjonctive palpébrale, conjonctive bulbar et épithélium cornéen. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Dans les modèles animaux expérimentaux avec certaines modifications génétiques ou opérations artificielles, il est utile d'examiner toutes les parties de la feuille épithéliale OS pour évaluer les changements pathogénétiques relatifs de chaque partie en parallèle. Cependant, la dissection du tissu d'OS dans son ensemble sans distorsion ou dommages a été difficile, principalement en raison de la douceur et la minceur de l'OS apposé sur les paupières physiquement séparées mais mobiles et globe oculaire. En outre, la douille oculaire profonde formée par le crâne dur / os orbitaux est entièrement occupé par le globe oculaire laissant un espace limité pour l'exploitation des dissections. En conséquence, la dissection directe du globe oculaire avec les tissus associés os du côté facial conduirait souvent à des dommages de tissu, particulièrement la conjonctive palpébrale et bulpale. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement d'une tête de souris coupée en deux, laissant des paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tout à fait en une seule pièce. L'intégrité de la feuille d'OS était bien préservée et pouvait être examinée par histologie ou immunostaining dans une seule section.

Introduction

La surface oculaire se compose d'une feuille continue d'épithélium régionalisé comprenant la conjonctive palpébrale, la conjonctive bulbar et la cornée^1. Beaucoup de structures glandulaires sont associées à l'épithélium de surface oculaire et génèrent ensemble une couche de film lacrymal protégeant la surface de cornée du séchage et des invasions environnementales^2. La perturbation du système d'exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Les facteurs génétiques et les irritants environnementaux ou leurs interactions contribuent à des altérations pathologiques de l'OS^3,4. En conséquence, une variété de modèles animaux génétiquement modifiés et d'origine physique ou chimique ont été utilisés pour étudier les processus de la maladie de l'OS humain.

La structure et la fonction de l'OS de souris est similaire à celle des humains à bien des égards. Les composants du film lacrymal sécrétépar par les glandes oculaires sont également similaires entre les souris et les humains. Une multitude d'études a été menée à l'aide de modèles murins pour élucider les mécanismes des maladies humaines OS^5,6,7. Dans de nombreuses occasions, il est essentiel d'analyser les changements moléculaires globaux au lieu des changements moléculaires locaux de l'OS pour obtenir des informations complètes sous le même traitement expérimental. Par conséquent, la préparation de l'échantillon avec une bonne intégrité est nécessaire pour s'assurer que chaque partie du système d'exploitation doit être analysée simultanément.

Le système d'exploitation de souris s'associe étroitement avec le globe oculaire qui a été incorporé dans la prise/orbite d'oeil (une tasse osseuse faite de plusieurs os différents de crâne) et se connecte à lui par des tissus conjonctifs minces. Il existe d'énormes défis pour disséquer toute la surface oculaire sans endommager la conjonctive palpébrale ou bulbe. Ces défis descendent de: (i) l'OS est doux et mince et apposé sur les paupières et les globes oculaires physiquement séparés mais mobiles, donc vulnérables pour la distorsion et les dommages; et (ii) l'espace limité entre les os orbitaux et le globe oculaire limitent les opérations de dissection. Les défis sont beaucoup plus grands pour la souris adulte. Chez la souris embryonnaire, l'ossification orbitale osseuse n'est pas complète et les tissus environnants sont relativement lâches⁸. La tête peut être enlevée et coupée en deux, puis directement soumise à la fixation du paraformaldéhyde (PFA) et à l'intégration⁹. En revanche, les os orbitaux postnatals et adultes de souris sont entièrement ossifiés avec les tissus environnants épais, rendant la pénétration des fixatifs moins efficace. En outre, les os orbitaux/crâne sont durs et cassants, facilement cassés en les sectionnant dans les composés mous d'embedding tels que la paraffine. Les morceaux cassés d'os déchireront unanimement les tissus voisins ayant pour résultat la morphologie inférieure de tissu.

Beaucoup d'études éditées ont souvent montré la surface oculaire partielle, qui peut être suffisante pour leurs buts particuliers de recherche^10,11. Un examen brut des littératures a trouvé seulement peu d'études montrant la surface oculaire intacte entière étant démontrée sans description détaillée des protocoles de dissection^12,13. Dans ce protocole, nous avons détaillé une méthode de dissection pour obtenir la surface oculaire postnatale intégrale, dans laquelle les os orbitaux et de crâne ont été ordonnés enlevés, laissant la surface oculaire intacte avec le globe oculaire et les paupières, minimisant les dommages physiques. Nous avons examiné en outre l'histologie d'OS et avons exécuté l'immunohistochimie utilisant les sections de tissu préparées avec ce protocole.

Protocole

Toutes les procédures impliquant l'utilisation de souris ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux, zhongshan Ophthalmic Center, et ont adhéré à l'énoncé ARVO pour l'utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Dissection du globe oculaire avec la surface oculaire intacte et les paupières

1. Disséquer la tête.
   1. Euthanasier les souris postnatales 10 (P10) et P28 (voir le Tableau des matériaux pour les souches de souris) par luxation cervicale, couper la tête du cou par une paire de ciseaux pointus.
   2. Tête de bisect avec une paire de ciseaux droits le long de la ligne médiane sagittale commençant à l'os interpariétal rostalement au nasillard (Figure 1A,B).
      REMARQUE: L'os du crâne durcit avec le vieillissement de la souris, attention à garder les ciseaux de coupe le long de la ligne médiane autant que possible.
   3. Placer chaque moitié de la tête coupée dans un plat Petri propre, couper la mâchoire et la langue d'abord à l'aide de ciseaux pointus. Libérez le nerf optique en le coupant du cerveau avant l'emplacement du chiasme optique, et enlevez tous les tissus cérébraux, y compris l'ampoule olfactive attachée à la paroi du crâne.
   4. Maintenant, les tissus restants doivent avoir tous les os du crâne / orbitale associée à la globe oculaire (Figure 1C,D). Laver la partie restante avec PBS pour nettoyer le sang et les débris de cheveux.
   5. Préfixe des tissus avec 4% de paraformaldéhyde (PFA, en saline tamponnée de phosphate [PBS], pH 7.4) dans un tube conique de 50 ml à température ambiante (RT) avec rotation. Le temps de fixation approximatif est le suivant : 10 min pour P0 à P7 ; 20 min pour P8 à P28; et 30 min pour P29 et plus.
      REMARQUE : La préfixation offre la rigidité de tissu rendant la dissection suivante plus facile. En outre, la préfixation évite de laisser les tissus frais non fixés trop longtemps avant que la dissection soit terminée.
      CAUTION: PFA est dangereux et doit être manipulé avec soin.
2. Enlever le crâne/les os orbitaux.
   1. Après la préfixation, lavez rapidement la tête disséquée dans PBS trois fois pour éliminer davantage les poils cassés et les fixatifs afin de procéder à une dissection ultérieure.
      CAUTION: L'exposition aux fixatifs pendant la dissection peut être préjudiciable à la santé.
   2. Placez le tissu dans un plat Petri de 10 cm, coupez le crâne en trois parties le long des plans indiqués dans la figure 1D, E. Le globe oculaire dans la douille est caché dans la partie centrale du crâne sous les os éthmoïdes, frontaux et maxillaires (Figure 1D,E).
   3. Utilisez deux paires de forceps droits no 4 pour décoller l'os éthmoïde afin d'exposer pleinement les os frontaux et maxillaires (Figure 1F).
   4. Diviser géographiquement la surface du crâne (y compris les os maxillaires et les os frontaux) en 4 zones (figure 1F). Insérer l'extrémité des forceps incurvés horizontalement dans chaque zone pour enlever les os maxillaires et frontaux de façon séquentielle (Figure 1F).
      REMARQUE : Les os maxillaires ne peuvent pas tous être enlevés en même temps. Disséquez patiemment les pièce par pièce. L'os frontal est directement relié au globe oculaire par des tissus conjonctifs mous. Soyez prudent lorsque vous le retirez du globe oculaire pour éviter d'étirer le globe oculaire et d'endommager la conjonctive.
   5. Après l'ablation de l'os maxillaire partiel et de tous les os frontaux, les os lacrymaux et jugal sous-jacents seraient exposés (Figure 1G). Enlever les deux os et les muscles sous-cutanés et les graisses qui entourent le globe oculaire, couper le globe oculaire avec les paupières et la peau attachées dans un petit bloc de forme carrée pour réduire le volume des tissus et faciliter l'orientation du tissu lors de l'intégration(figure 1 H).
   6. Placez le globe oculaire et les tissus associés dans 4 % de PFA et continuez à fixer toute la nuit à 4 oC. Le tissu fixe peut être conservé pendant au moins un mois à 4 oC en PBS avec l'ajout de 0,02% NaN₃. Alternativement, procéder à l'analyse histologique immédiatement.
      REMARQUE : Si le tissu doit être stocké pendant de plus longues périodes, il peut facilement être stocké dans 70% d'éthanol.

2. Analyse histologique

1. Section de paraffine et hématoxylin et éosine (H et E) coloration
   1. Suivez le protocole standard décrit ailleurs⁹ pour effectuer l'encastrage et la sectionnement de paraffine.
2. Immunohistochimie (IHC)
   1. Décire les sections de paraffine avec xylène et réhydrater les sections par série d'alcool (100%, 95%, 80%) dans l'eau distillée (dH₂O).
   2. Effectuer la récupération d'antigène par le traitement par micro-ondes des diapositives de tissu dans un tampon d'acide citrique de 0,01 M (3 g de citrate trisodique, 0,4 g d'acide citrique par 1 L double distillé H₂O) dans un pot de glissière en verre à faible puissance (120 W). L'énergie doit être livrée par intermittence pendant un total de 5-10 min avec chaque intervalle d'une durée d'environ 2 min.
      REMARQUE : Le micro-ondes de haute puissance ou le chauffage constant conduirait au détachement des sections de tissu de la glissière.
   3. Choisissez les diapositives dans un bocal en verre, essuyez soigneusement le liquide résiduel entourant chaque section à l'aide de tissus faciaux et placez-les sur le porte-diapositives dans une boîte d'histologie. Dessinez un carré autour de chaque section avec un stylo histologique imperméable à l'eau. Placer 100 l de tampon de blocage (0,1 % de triton X-100 et 10 % de sérum d'âne dans 1 x PBS) sur chaque carré, et couver pendant 30 min à RT.
   4. Retirez soigneusement la solution de blocage avec le vide, ajoutez l'anticorps primaire (voir le tableau des matériaux)avec la dilution désirée dans le tampon de blocage, et continuez à couver les diapositives à 4 oC pendant 24 h ou plus.
      REMARQUE : La concentration de chaque anticorps primaire utilisé pour le CSI varie et doit être testée dans le le but d'effectuer des expériences pilotes.
   5. Laver les lames de tissu avec pBST (0,1% Triton en PBS) trois fois, pendant 10 min chacun. Répétez l'étape 2.2.4 à l'aide de l'anticorps secondaire (voir Tableau des matériaux) avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) remplaçant le tampon de blocage. Continuer à couver pendant au moins 4 h ou plus à température ambiante (RT).
   6. Retirer l'anticorps secondaire, laver les sections de tissu avec la solution PBST trois fois, pendant 10 min chacun, puis laver avec du PBS propre pendant encore 5 min.
   7. Essuyez les sections résiduelles de PBS entourant les tissus, montez les couvertures sur les sections avec le milieu de montage. Effectuer une microscopie fluorescente pour obtenir des images (voir le Tableau des matériaux).

Résultats

Les principaux os du crâne vus sous différents angles ont été illustrés dans la figure 1A-E, avec des couleurs dénotant différents os. Nous avons utilisé un animal de quatre semaines pour la démonstration des processus de dissection. Après les étapes de dissection 1.1.1-1.1.3 et une préfixation courte (étape 1.1.4), le globe oculaire avec les os faciaux associés sont démontrés dans la figure 1E. ...

Discussion

Un rappel critique pour la préparation du globe oculaire intact est que tous les os orbitaux doivent être enlevés complètement, en particulier les os juga et lacrimal, qui sont petits et situés près du fond de la douille oculaire. Les os restants peuvent compliquer l'histologie qui s'ensuit. Dans le cas où un petit morceau d'os n'a pas été complètement enlevé de la dissection par accident, il peut être choisi à partir du bloc de paraffine d'emcasterie utilisant une paire de sharptweezers. Le trou laissé derrière doit êtr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1& fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01
Tube à centrifuger 50ml	Corning	430829
Lames de microscope adhésives	Divers
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Concentration suggérée 1:500 - 1 000
Alexa Fluor 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Concentration suggérée 1:500 - 1 000
Anticorps anti-K12	Abcam	ab124975	Concentration suggérée 1:1 000
Anticorps anti-K14	Abcam	ab7800	Concentration suggérée 1:800
Acide citrique	Divers
Lame de couverture	Divers
Pinces courbes	World Precision Instruments	14127
Microscope à dissection.	Olmpus	SZ61
Alcool éthylique	Divers
Microscope fluorescent	Zeiss	AxioImager.Z2
Fluoromount-G Supports de montage	SouthernBiotech	0100-01
Micro dissection ciseaux-lame droite	World Precision Instruments	503242
Fours à micro-ondes	Galanz	P70D20TL-D4
Souches de souris	C57/BL6 et Sv129 mixtes
N° 4 pince droite	World Precision Instruments	501978-6
Sérum de chèvre normal	Divers
Paraformaldéhyde (PFA)	Divers		Préparez une solution à 4 % en 1& fois ; PBS et filtre avec 0,45&mu ; m membrane filtrante
Boîte de culture tissulaire	Divers
Citrate trisodique	Divers
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818