Adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines utilisant le système PRIMO pour la micro-modélisation pour étudier les réponses cellulaires aux protéines de matrice extracellulaires

Résumé

Notre objectif global est de comprendre comment les cellules détectent les indices extracellulaires qui conduisent à la croissance axonale dirigée. Ici, nous décrivons la méthodologie de l'adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines, employées pour produire des micro-modèles définis des composants extracellulaires de matrice afin d'étudier des événements spécifiques qui régissent la croissance et l'orientation d'axone.

Résumé

Les cellules détectent une variété de signaux extracellulaires, y compris la composition et la géométrie de la matrice extracellulaire, qui est synthétisée et remodelée par les cellules elles-mêmes. Ici, nous présentons la méthode de l'adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines (LIMAP) utilisant le système PRIMO comme technique de modèle pour produire des substrats de matrice extracellulaire micro-modèle (ECM) utilisant une seule ou combinaison de protéines. La méthode permet l'impression de motifs ECM en résolution micron avec une excellente reproductibilité. Nous fournissons un protocole étape par étape et démontrons comment cela peut être appliqué pour étudier les processus de l'orientation neuronale. LIMAP présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes de micro-impression existantes en termes de facilité de modelage de plus d'un composant et de la capacité de générer un motif avec n'importe quelle géométrie ou gradient. Le protocole peut facilement être adapté pour étudier la contribution de presque n'importe quel composant chimique au destin cellulaire et au comportement cellulaire. Enfin, nous discutons des questions communes qui peuvent survenir et de la façon dont elles peuvent être évitées.

Introduction

Ces dernières années, les sciences biologiques ont de plus en plus profité des progrès réalisés par les sciences du matériel. Un exemple proéminent est le micro-modelage des substrats, qui peut être utilisé pour étudier les réponses cellulaires telles que la prolifération cellulaire^1,2différenciation^3,4,5,6, migration cellulaire^7,8,9et l'orientation^10,11. Il existe un certain nombre de techniques disponibles qui permettent le micro-modelage des substrats, tels que la photochimie multiphoton excité¹², nanolithographie dip-pen de l'AFM¹³, pin et jet d'encre impression directe¹⁴, lithographie de faisceau d'électrons¹⁵ou microfluidique¹⁶. Cependant, deux techniques qui sont largement utilisées dans le domaine biologique sont l'impression par microcontact^17,18,19ou des motifs assistés par laser³(Figure 1). Le modelage assisté par laser est considéré comme un résultat plus fiable en termes de stabilité des protéines et de PEG et de confinement cellulaire sur les modèles, par rapport à l'impression par microcontact²⁰. Une approche plus nouvelle pour le micro-modèle décrit ici est l'utilisation de l'adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines²¹(LIMAP,Figure 1 D) à l'aide d'un système disponible dans le commerce (PRIMO,Tableau des matériaux). Chacune des méthodes a des avantages et des limitations qui sont brièvement décrits ci-dessous. L'impression microcontact utilise des moules PDMS (timbres) avec les micro-caractéristiques souhaitées qui sont générées à partir de maîtres lithographiés. Les timbres sont incubés avec une protéine choisie qui est ensuite transférée (estampillée) sur le substrat de culture cellulaire¹⁸(Figure 1 un). Le modelage assisté par laser utilise la lumière UV pour couper un film anti-encrassement^22,23,24,25, exposant les régions qui peuvent par la suite être recouvertes de la protéine d'intérêt (Figure 1 B). Alors que la résolution obtenue avec des approches de photo-modèle est dans la gamme de microns^25,26, la plupart de ces techniques nécessitent un masque photo, soit en contact avec l'échantillon, soit situé dans le plan objet de l'objectif du microscope^23,27,28. Les exigences relatives aux masques dans l'impression par microcontact et le photo-modèle peuvent être une limitation; des masques spécifiques sont nécessaires pour chaque motif géométrique et taille, qui peut être coûteux et long à générer. Contrairement à ces techniques, LIMAP ne nécessite pas de masque (Figure 1 D). L'utilisation du système PRIMO pour LIMAP peut être coûteuse au début parce qu'elle nécessite l'achat d'équipement. Cependant, le logiciel open-source est utilisé pour concevoir des modèles de n'importe quelle géométrie désirée, donnant beaucoup plus de liberté et permettant des expériences plus complexes, y compris l'utilisation de gradients de concentration de protéines. Le laser PRIMO est contrôlé et dirigé par un dispositif de micromiroir contrôlé numériquement (DMD) pour créer des modèles dans n'importe quel nombre de géométries définies par l'utilisateur. LIMAP exige que la surface de culture soit recouverte de molécules qui empêchent l'attachement cellulaire. Le polyéthylène glycol (PEG) est le plus couramment utilisé comme réactif « antifouling »; il forme un film antiadhésif dense sur la surface en verre ou en plastique²⁹. Par la suite, un photo-initiateur est ajouté qui permet au film PEG d'être enlevé avec une grande précision grâce à un mécanisme de photoscission³⁰par l'exposition locale à la lumière UV sous le contrôle de la DMD. Ces régions sans PEG peuvent être recouvertes de protéines qui adsorbent à la surface gravée au laser, générant un micro-modèle. En variant la puissance laser, différentes quantités de PEG peuvent être retirées de la surface permettant à l'utilisateur de générer des gradients protéiques. L'enlèvement de PEG et la procédure de revêtement peuvent être répétés pour créer des modèles avec deux ou plusieurs protéines distinctes dans le même micro-puits²¹. Les micro-modèles générés fournissent des surfaces adhésives pour les cellules, permettant l'étude du comportement cellulaire. Dans nos études, nous utilisons le micro-modèle pour étudier le neurite ou l'axone pathfinding d'une lignée cellulaire neuronale (CAO (Cathecholaminergic-a différencié) cellules³¹) ou les neurones primaires de ganglion dorsal-root de rat (DRG), respectivement. Ici, nous énoncions un protocole étape par étape pour LIMAP (Figure 2) en utilisant le système PRIMO disponible dans le commerce et en accompagnant le logiciel Leonardo. Nous démontrons comment il peut être utilisé pour la génération de modèles avec des géométries définies et des protéines multiples, que nous utilisons pour étudier l'orientation axonale. Nous discutons des questions communes qui peuvent survenir et de la façon dont elles peuvent être évitées.

Protocole

1. Conception de modèles de modèle

REMARQUE: Les modèles pour le modelage sont générés avec un logiciel de dessin numérique (Tableau des matériaux). Le dessin dans différents niveaux gris déterminera des intensités de laser. L'utilisation d'un logiciel pour concevoir des modèles de modèles permet la génération rapide de modèles avec n'importe quelle géométrie et gradients désirés (Figure 3).

1. Dessinez numériquement le modèle de modèle souhaité à l'aide d'un logiciel de dessin. Sélectionnez une taille d'image de 1824 pixels de longueur et 1140 pixels de largeur (ce qui, dans cette étude, correspond à 415 m de longueur et 260 m de largeur). Enregistrer le modèle de modèle comme un fichier Tiff 8 bits.
   REMARQUE : un protocole étape par étape pour générer des modèles est disponible sur demande à la marque qui commercialise l'équipement de micro-modèle (Tableau des matériaux).

2. Nettoyage plasma

REMARQUE : Les résultats optimaux exigent le nettoyage de plasma des surfaces avant le modelage, qui enlèvera toute matière organique et activera la surface. Dans le cas présent, l'air ambiant est suffisant pour l'activation de la surface. Un nettoyant plasmatique (Table of Materials) a été utilisé avec une pression de processus de 1000-1300 mTorr et une puissance de 29,6 W pour 1-5 min.

1. Utilisez un plat/es en verre avec une taille intérieure de 20 mm et une épaisseur de verre de 0,16 à 0,19 mm. Pour tester plusieurs conditions, utilisez un plat de fond en verre de 6 puits. Sinon, utilisez un seul plat de fond en verre de puits(Table des matériaux).
   REMARQUE : Un protocole étape par étape pour le nettoyage du plasma est disponible sur demande à la marque qui commercialise l'équipement de nettoyage du plasma(Tableau des matériaux).

3. Passivation

REMARQUE : Cette étape génère un film antifouling qui empêche l'adsorption de protéine à la surface de verre. PEG offre une forte résistance à l'adsorption protéique²⁹ comme agent antifouling. LIMAP utilise un photo-initiateur pour supprimer localement PEG par photoscission UV. Les protéines/s d'intérêt adsorb seront ensuite adsorb à ces surfaces SANS PEG²¹, générant des micro-modèles.

1. Passivation avec PLL-PEG
   1. Dans des conditions stériles, couper les pochoirs PDMS (voir La figure 4A,B et Tableau des matériaux)pour s'assurer qu'ils s'intègrent bien dans le fond de verre intérieur, et enlever les remplissages intérieurs micro-puits avec des forceps stériles. Coller les pochoirs sur le verre bien à l'aide de forceps.
   2. Assurez-vous que les pochoirs collent bien sur le verre, empêchant la formation de bulles d'air qui peuvent causer des fuites pendant le processus de passivation.
      REMARQUE : Les pochoirs PDMS peuvent également être fabriqués en interne à l'aide de protocoles publiés^18,32.
   3. Préparer la solution PLL-PEG(tableau des matériaux,0,1 mg/mL) en salin tamponné par phosphate (PBS). Ajouter 20 l de solution PLL-PEG à chaque micro-puits et incuber à température ambiante, pendant 1 h.
   4. Retirez 15 L de PLL-PEG des micro-puits et lavez-les cinq fois avec 20 L de PBS(Tableau des matériaux)sans les laisser sécher.
      REMARQUE : Laissez toujours environ 5 L de PBS entre les lavages. Compte tenu de leur faible volume, les micropuits sont particulièrement sensibles au séchage. Le séchage se traduira par des micro-modèles de mauvaise qualité.
   5. Soit garder le plat de culture en PBS (3 ml par puits) à 4 oC pendant jusqu'à 3 jours, soit continuer avec l'étape suivante (étape 3.1.5).
   6. Retirez 18 L de PBS d'un seul micro-puits (par exemple, le micro-puits supérieur gauche, voir Figure 4D), ajoutez 5 l de photo-initiateur (PLPP, Table of Materials) et laissez 20 'L de PBS dans les micro-puits restants. Ce micro-puits avec PLPP sera utilisé pour créer un modèle de référence (voir Figure 4D,E) pendant l'étape d'étalonnage du système (étape 4). Gardez Le PLPP à l'abri de la lumière.
2. Passivation avec PEG-SVA de longue durée
   REMARQUE : Pour générer la surface anti-adhésif, on peut utiliser : 1) un PEG lié à la Poly-L-Lysine (PLL-PEG, étape 3.1) ou 2) un N-hydroxisuccinimide PEG-succinate (PEG-SVA). La décision de choisir l'une ou l'autre option de passivation dépend des options de stockage (voir l'étape 10). Les plats de culture incubés avec PEG-SVA nécessitent une double quantité de temps de passivation et de photopatterning.
   1. Préparer les pochoirs tels que décrits à l'étape 3.1.1.
   2. Ajouter 20 oL de 0,01 % de poly-L-Lysine (PLL, Table of Materials) à chaque micro-puits et couver à température ambiante pendant 30 min pour pré-enrober de PLL.
   3. Retirer 15 L de PLL des micro-puits et les laver trois fois avec 20 'L de 1 M de tampon HEPES (Tableau des matériaux) sans laisser sécher les puits.
      REMARQUE : Laissez toujours environ 5 L de HEPES ou de PBS entre les lavages. Compte tenu de leur faible volume, les micropuits sont particulièrement sensibles au séchage. Le séchage se traduira par des micro-modèles de mauvaise qualité.
   4. Préparer la solution PEG-SVA. La solution PEG-SVA (50 mg/mL dans le tampon HEPES 1M) doit être préparée fraîche à chaque fois immédiatement avant l'utilisation. Préparer 20 L de PEG-SVA par micro-puits.
   5. Le tampon HEPES doit avoir un pH compris entre 8 et 8,5. Testez le pH HEPES avant de préparer la solution PEG-SVA avec du papier pH. Peser PEG-SVA dans un tube de centrifugeuse à l'aide d'une balance de précision. Ajouter le tampon HEPES et le vortex 30 s jusqu'à dissolution. PEG-SVA est complètement dissous lorsque la solution est transparente.
      REMARQUE: SVA est l'ester qui permet la liaison de PEG à la PLL précédemment enduit. Une fois que le tampon HEPES est ajouté au PEG-SVA, le SVA a une demi-vie de 15 min et doit être utilisé immédiatement.
   6. Ajouter 20 lde de solution PEG-SVA à chaque micro-puits et incuber à température ambiante, pendant 1 h. Retirez 15 l de PEG-SVA des micro-puits et lavez cinq fois avec 20 'L de PBS (Tableau des matériaux)sans laisser sécher les puits.
   7. Préparer le plat de culture pour un stockage à long terme (jusqu'à 1 mois, voir l'étape 10.2) ou passer à l'étape suivante (étape 3.2.8).
   8. Retirez 18 L de PBS d'un seul micro-puits (par exemple, le micro-puits supérieur gauche, voir Figure 4D), ajoutez 5 l de PLPP(Tableau des matériaux)et laissez 20 l de PBS dans les micro-puits restants. Ce micro-puits sera utilisé pour créer un motif de référence (voir Fi gure 4D, E). Assurez-vous que le PLPP est homogène sur toute la surface du micro-puits. Gardez Le PLPP à l'abri de la lumière.

4. Calibrage du système

REMARQUE : Dans ces étapes, l'accent du laser sera ajusté au type particulier de plat de culture (étape 4.1). Un modèle de référence sera généré dans un seul micro-puits (étape 4.2) suivi d'une incubation avec une solution protéique (étape 4.3) afin d'assurer les conditions optimales de mise au point du laser (étape 4.4), nécessaires pour obtenir des modèles pointus et définis.

1. Étalonnage laser
   REMARQUE : Pendant le processus d'étalonnage, une image laser d'étalonnage sera projetée sur une surface en verre surlignée fluorescente (bien calibration, marquée d'un surligneur fluorescent, figure 4C), qui doit être mise au point sur le microscope.
   1. Utilisez un surligneur fluorescent (Table of Materials) pour marquer un puits de verre intérieur vide.
      REMARQUE : Le puits d'étalonnage doit avoir la même épaisseur de verre (0,16-0,19 mm) que le plat de culture sur lequel les micro-modèles seront générés. Si un plat à fond de verre de 6 puits est utilisé, un puits vide peut être utilisé pour l'étalonnage et doit être marqué avec surligneur fluorescent dans des conditions stériles.
   2. Allumez le microscope, la scène et l'ordinateur. Allumez l'équipement de micro-modèle PRIMO, le micro-gestionnaire ouvert et le logiciel Leonardo. Le logiciel Leonardo est exploité par Micro-manager sous Plugins. Vérifiez les numéros de marques/catalogue de l'équipement et des logiciels dans Tableau des matériaux.
   3. Dans le menu initial de Leonardo, sélectionnez Calibrate. Vérifiez que le cube de filtre PRIMO dédié est dans la bonne position (voie optique) dans la tourelle de filtre ; sélectionnez l'objectif 20X (0,75 DIC S Plan Fluor, pas d'anneau de phase) à la fois sur le microscope et sur le logiciel Leonardo.
      REMARQUE : Ce protocole est ajusté à la version 4.4 de Leonardo. Le protocole peut avoir besoin d'être ajusté pour d'autres versions.
   4. Positionner le calibrage précédemment mis en évidence bien (figure 4C) au-dessus de l'objectif. Sélectionnez le chemin de la caméra. Ajuster la mise au point objective jusqu'à ce que la projection laser du logo PRIMO et le slogan Prenez soin de vos cellules sont au point.
   5. Laissez le temps d'exposition de la caméra par défaut à 25 ms. Ajustez l'intensité laser pour voir la lettre I de la projection du logo PRIMO en couleur grise et le reste des lettres en blanc.
   6. Enregistrez la position Z du plan focal (hauteur de l'objectif à l'échantillon) plus tard appelée position Z de l'étalonnage. Il s'agira d'une approximation de la mise au point optimale obtenue après la génération de motifs de référence (voir l'étape 4.2-4.4).
2. Modèle de référence
   1. Placez le plat de culture avec le micro-puits contenant le photo-initiateur (modèle de référence micro-puits, Figure 4D) au-dessus de l'objectif et sélectionnez Modèle maintenant dans le logiciel Leonardo.
   2. Visualisez le bord du micro-puits avec la lumière transmise à travers la caméra et choisissez le symbole de retour sur investissement dans le menu de droite. Fixez le diamètre du cercle de roi-roi à 4000 m et alignez le bord du roi-roi numérique avec le bord du micro-puits actuel.
   3. Assurez-vous qu'il y a un chevauchement précis entre le roi-roi numérique et le micro-puits actuel en déplaçant la scène sur les bords du micro-puits. La position de retour sur investissement sera couplée aux mouvements de scène.
   4. Sélectionnez Verrouiller dans le logiciel Leonardo pour verrouiller le retour sur investissement dans la position désirée. Éteignez la lumière transmise.
   5. Sélectionnez PRIMO pour télécharger le modèle désiré, qui sera projeté sur le roi-roi en tant qu'unité de conception (voir Figure 5). Les modèles apparaîtront dans une liste de déroulants appelée Actions et affichée dans le menu Actions du logiciel.
      REMARQUE : Les modèles de modèle doivent être conçus précédemment (voir l'étape 1) et enregistrés sous forme de fichier Tiff 8 bits avant de charger le modèle dans le logiciel.
   6. Seul un petit modèle est nécessaire pour le modèle de référence; par exemple, 3 lignes, 1 colonne (voir La figure 4E et la figure 5B). Dans le menu Réplication, définir le nombre désiré de colonnes et de lignes(lignes dans le logiciel Leonardo). Cliquez sur Rafraîchir pour observer un aperçu numérique de la conception du modèle.
   7. Définir la dose laser dans le menu Réplication. La dose laser optimale dans ce cadre et en utilisant PLL-PEG est de 1390 mJ/mm².
      REMARQUE : La puissance du laser peut varier entre 5 et 7,5 mW/mm². Dans ce cas, il est de 7,5 mW/mm², ce qui prend environ 30 s pour modeler chaque unité de conception, en utilisant une dose laser de 1390 mJ/mm². Des doses laser plus élevées peuvent être nécessaires si la surface du plat de culture est passivated avec PEG-SVA (environ la double dose de laser par rapport à PLL-PEG). Cela doit être testé à l'avance.
   8. Naviguez vers une région périphérique du micro-puits (par exemple, partie supérieure) loin de la principale région d'intérêt pour la génération de motifs (région centrale) du micro-puits (voir figure 4E) et sélectionnez Verrouillage. Attendez que le motif soit affiché.
   9. Ajuster la mise au point de la position Z de l'étalonnage (voir l'étape 4.1.6).
      REMARQUE : Il est recommandé de faire une étape supplémentaire d'étalonnage du système si un autre utilisateur utilise le même microscope entre les tours de photopatterning.
   10. Sélectionnez le symbole De lecture pour commencer le modelage. Assurez-vous que le laser est allumé dans le logiciel. Attendez que le processus de modelage soit terminé. La durée du modèle sera affichée dans le panneau Temps estimatif. Sur Leonardo version logicielle 4.4 le modèle est terminé lorsque toutes les actions apparaissent en bleu dans le menu visualisation.
3. Incubation de protéines sur le modèle de référence
   1. Dans des conditions stériles, lavez le modèle de référence micro-puits trois fois avec 20 L de PBS pour enlever le PLPP.
   2. Ajoutez 20 l de protéines ECM étiquetées fluorescentes (10 g/mL de laminin, de fibronectine ou de fibrinogène dans le PBS, voir Tableau des matériaux et étape 6) au modèle de référence micro-puits. Incuber à température ambiante de 10 à 20 min (selon la protéine) à l'abri de la lumière (envelopper le plat dans du papier d'aluminium).
   3. Après l'incubation, retirer 18 L de solution protéique et laver trois fois avec 20 lde de PBS; conserver les micro-puits qui ne sont pas utilisés pour créer un modèle de référence (voir la figure 4D,E) dans 20 L de PBS.
4. Visualisation et réglage de mise au point laser optimale
   1. Visualisez le modèle de référence à l'aide d'un microscope épifluorescence, d'un logiciel objectif et approprié 20X (vérifier le logiciel utilisé dans cette étude dans Table of Materials). Le modèle de référence doit être visible dans la région périphérique (par exemple, la région supérieure des puits), dans laquelle le modèle de référence a été généré (voir la figure 4E).
   2. Ajuster la mise au point sur les bords du modèle à travers le chemin de la caméra. Enregistrez la position Z en fonction de la meilleure mise au point sur le modèle de référence. Cette position Z ajustée sera la mise au point laser optimale utilisée pour les motifs ultérieurs.

5. Configuration logicielle et photopatterning

REMARQUE : Une fois l'étalonnage du système atteint (étape 4), l'utilisateur téléchargera les modèles de modèle souhaités (configuration de modèle, figure 5) pour le photopatterning, avec la possibilité de générer des modèles pour une ou plusieurs protéines dans chaque micro-bien. Le processus de micro-modèle implique des étapes de photopatterning et d'incubation de protéines (voir la figure 2).

1. Dans des conditions stériles, retirer 18 L de PBS de tous les micro-puits et ajouter 5 ll de PLPP à chaque micro-puits. Assurez-vous que le PLPP est homogène sur toute la surface des micro-puits.
2. Placez le plat de culture avec le modèle de référence micro-bien (Figure 4D,E) au-dessus de l'objectif et sélectionnez Modèle maintenant dans le logiciel Leonardo.
3. Visualisez le micro-puits avec la lumière transmise à travers le chemin de la caméra et choisissez le symbole du retour sur investissement. Fixez le diamètre du roi-roi à 4 000 m et chevauchez le bord du retour sur investissement numérique au bord du micro-puits actuel. Sélectionnez Verrouillage.
   REMARQUE : la forme et le diamètre du retour sur investissement dépendent de la conception et de la taille du pochoir PDMS utilisé. Par exemple, si vous utilisez 5 000 x 5 000 pochoirs carrés PDMS, utilisez un retour sur investissement de 5 000 x 5 000 m au carré.
4. Répétez l'étape qui se chevauche (étape 5.3) pour chaque micro-puits du plat. Une fois terminé, éteignez la lumière transmise.
5. Naviguez vers le centre du modèle de référence micro-puits, loin de la région de modèle de référence, et sélectionnez PRIMO pour télécharger le modèle de modèle désiré, qui sera projeté sur le roi-roi comme une unité de conception (voir Figure 5). Les modèles apparaîtront dans une liste de déroulants appelée Actions et affichée dans le menu Actions du logiciel.
   REMARQUE : Les modèles de modèle doivent être conçus avant l'expérience et enregistrés sous forme de fichier Tiff 8 bits avant de charger le modèle dans le logiciel.
6. Afin de créer un modèle sur l'ensemble du micro-puits, l'unité de conception doit être reproduite. Une unité de conception couvre environ 0,1 mm² de la zone du micro-puits. Dans le menu Réplication, définir le nombre désiré de colonnes et de lignes(lignes dans le logiciel) (voir Figure 5).
7. Pour générer un modèle continu, ajustez l'espacement entre les colonnes et les lignes; dans cette étude, les modèles de rayures continues sont obtenus en utilisant un espacement de -20 à -35 m (espacement négatif) entre les colonnes. Cet espacement négatif crée un chevauchement entre les unités de conception (Figure 5B,C).
8. Définir la dose laser dans le menu Réplication. La dose laser optimale dans ce cadre et en utilisant PLL-PEG est de 1390 mJ/mm². La durée de la configuration sera affichée dans le panneau Temps estimé.
   REMARQUE: Dans ce cas, la puissance laser est de 7,5 mW/mm², prenant environ 30 s pour modeler chaque unité de conception, en utilisant une dose de 1390 mJ/mm². Par exemple, une unité de conception (0,1 mm²) reproduite en 4 colonnes et 4 lignes (environ 1,6 mm^2),prendrait 8 min pour être modelée. Des doses laser plus élevées peuvent être nécessaires si la surface du plat de culture est passivated avec PEG-SVA (environ la double dose de laser par rapport à PLL-PEG).
9. Sélectionnez Verrouillage et attendez que le modèle soit pratiquement affiché.
10. Pour mettre à jour les paramètres d'un modèle, cliquez sur l'actionconnexe, puis déverrouillez et mettez à jour les paramètres. Sélectionnez à nouveau Verrouiller lorsque la mise à jour du modèle est terminée.
11. Le modelage de protéines multiples dans le même micro-puits (rondes de micro-modèle séquentiels) nécessite un alignement précis des modèles. Pour atteindre un tel alignement, téléchargez simultanément tous les ensembles de modèles de modèles souhaités (modèles de premier et deuxième tours de photopatterning).
12. Définiz les paramètres de réplication et de dose des modèles de modèle. Une fois les paramètres défini, les modèles apparaissent sous forme d'actions dans la liste actions. Enregistrer cette configuration de modèle comme un fichier dans le logiciel (voir Figure 5D).
13. Sur la liste actions, sélectionnez uniquement les actions spécifiques à modeler au cours du premier cycle et désélectionnez les actions qui seront modelées au cours du deuxième cycle (voir figure 5D).
14. Naviguez jusqu'à la zone où le modèle de référence a été produit à l'étape 4.2 (par exemple, région supérieure du modèle de référence micro-puits, voir Figure 4E). Ajuster la mise au point à la position Z optimale (obtenue à l'étape 4.4).
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de choisir le système de mise au point parfait sur le microscope utilisé (si disponible), ce qui garantit que la position Z optimale pour le modelage sera maintenue tout au long du processus de photopatterning.
15. Sélectionnez le symbole De lecture pour commencer le modelage. La durée du modèle sera affichée dans le panneau Temps estimatif. Sur le logiciel Leonardo version 4.4 le modèle est terminé lorsque toutes les actions apparaissent bleues dans le menu visualisation.

6. Incubation de protéines

REMARQUE : Les micropuits sont incubés avec des protéines ECM (de préférence étiquetées fluorescentes). Ceux-ci ne se lieront qu'aux zones où PEG a été clivé par le processus de photopatterning décrit à l'étape 5. Chaque puits contient un pochoir PDMS avec 4 micro-puits, ce qui permettra de tester 4 conditions différentes simultanément, par exemple, l'incubation d'une protéine différente dans chaque micro-puits (voir Figure 4D).

1. Utiliser des protéines fluorescentes (par exemple, lalaminine, fibronectine ou fibrinogène conjuguées à des fluorophores rouges ou verts) afin de visualiser les micro-modèles (voir l'étape 6.7 et 9.4). Alternativement, les protéines non étiquetées adsorbées peuvent être visualisées à des stades ultérieurs utilisant l'immunofluorescence.
   REMARQUE : Les protéines ECM (par exemple, la fibronectine) peuvent être étiquetées à l'aide des protocoles existants³³ et des trousses d'étiquetage de fluorescence disponibles dans le commerce (c.-à-d. le kit d'étiquetage Alexa 488), ou achetées facilement étiquetées (par exemple, fibrinogen conjugué-488 ou rhodamine fluorescente rouge laminin, voir Table des matériaux).
2. Dans des conditions stériles, préparez la concentration désirée de protéines ECM (10 g/mL de laminin, de fibronectine ou de fibrinogène dans le PBS, voir Tableau des matériaux et étape 4.3).
   REMARQUE : Les protéines ECM étiquetées fluorescentes sont sensibles à la lumière et doivent être protégées de la lumière (emballage dans du papier d'aluminium) et doivent être conservées sur la glace en tout temps.
3. Dans des conditions stériles, laver les micro-puits trois fois avec 20 L de PBS pour enlever le PLPP.
4. Retirez 18 L de PBS de tous les micro-puits et ajoutez 20 l de solution protéique ECM à chaque micro-puits. Incuber à température ambiante, de 20 à 30 min et protéger de la lumière.
   REMARQUE : Les temps d'incubation optimaux du revêtement peuvent varier selon le type et la concentration des protéines.
5. Après l'incubation, retirer 15 l de solution protéique ECM et laver les micro-puits trois fois avec 20 ll de PBS.
   REMARQUE : Laissez toujours environ 5 L de PBS entre les lavages.
6. Si le modelage avec une seule protéine (un cycle de micro-modelage), procéder soit au stockage du plat de culture (étape 10) ou au placage cellulaire (étape 11, et voir figure 2). Si vous effectuez une deuxième série de micro-modèles avec une protéine différente dans le même micro-puits, procédez soit au stockage du plat de culture (étape 10) soit au blocage de sites de liaison non spécifiques (étape 7, et voir Figure 2).
7. Étape facultative de contrôle de la qualité : visualiser et imprimer des motifs à l'aide d'un microscope à épifluorescence avant le placage des cellules. Sélectionnez les canaux fluorescents appropriés et ajustez les temps d'exposition en conséquence.
   REMARQUE : Pour comparer l'intensité de fluorescence des modèles entre les expériences, il est essentiel d'utiliser les mêmes temps d'exposition pour les mêmes protéines.

7. Blocage de sites de liaison non spécifiques (seulement pour plusieurs modèles protéiques)

REMARQUE : Le micro-modelage avec plusieurs protéines dans le même micro-puits implique des étapes de modelage séquentielle (voir la figure 2). Un agent de blocage (PLL-PEG ou BSA) est ajouté aux micro-puits pour prévenir la liaison croisée, qui se produit lorsque la deuxième protéine incubée (étape 9) se lie à la première protéine incubée (étape 6), évitant ainsi un mélange de protéines dans les modèles.

1. Dans des conditions stériles, ajouter 20 oL de PLL-PEG (0,1 mg/mL en PBS) ou BSA (1 % de BSA en PBS) comme étape de blocage pour éviter la liaison croisée.
   REMARQUE : L'efficacité du blocage peut varier en fonction de la nature des protéines utilisées et de l'affinité entre elles. Il est recommandé de tester à la fois PLL-PEG et BSA comme agents de blocage à l'avance (figure 10D-I).
2. Incuber l'agent de blocage à température ambiante pendant 1 h et protéger de la lumière. Enlever 15 l d'agent de blocage et laver tous les micro-puits trois fois avec 20 ll de PBS. Laissez toujours environ 5 L de PBS entre les lavages.
3. Retirez 18 L de PBS de tous les micro-puits et ajoutez 5 L de PLPP à chaque micro-puits, en veillant à ce que le PLPP soit homogène sur toute la surface des micro-puits.

8. Deuxième tour de photopatterning (seulement pour plusieurs modèles de protéines)

REMARQUE : Après le premier cycle de photopatterning et d'incubation de protéines, un micro-modèle est généré. Au cours de la deuxième série de photopatterning, le modèle de la deuxième protéine sera généré dans le même micro-puits (voir Figure 2C et Figure 5D). Dans le logiciel, sélectionnez les modèles de modèle corrects (actions), qui seront modelés au cours de ce cycle (voir Figure 5D).

1. Naviguez vers le premier micro-puits (Figure 4D). Assurer un chevauchement approprié entre le roi-roi numérique et le micro-puits.
2. Chargez la configuration du modèle enregistrée précédemment (étape 5.12) et sélectionnez les actions à modeler au cours du deuxième tour de photopatterning (désélectionnez les actions du premier tour, voir Figure 5D).
3. Sélectionnez le symbole De lecture pour commencer le modelage. Assurez-vous que le laser est allumé dans le logiciel.

9. Deuxième cycle d'incubation de protéines (seulement pour plusieurs modèles de protéines)

REMARQUE : Dans cette partie du protocole, les protéines/s fluorescentes seront incubées sur le plat de culture après la deuxième ronde de photopatterning.

1. Dans des conditions stériles, lavez le micro-puits trois fois avec 20 L de PBS pour enlever le PLPP. Enlever 18 L de PBS et ajouter 20 l de solution de protéines ECM à chaque micro-puits. Incuber à température ambiante de 20 à 30 min et protéger de la lumière.
   REMARQUE : Les temps d'incubation optimaux du revêtement peuvent varier selon le type et la concentration des protéines.
2. Après l'incubation, retirer 15 l de solution protéique ECM et laver les micro-puits trois fois avec 20 ll de PBS. Laissez toujours environ 5 L de PBS entre les lavages.
3. Procéder soit à l'entreposage du plat de culture (étape 10) ou au placage cellulaire (étape 11, et voir figure 2).
4. Étape facultative de contrôle de la qualité : à l'aide d'un microscope épifluorescence, de la visualisation et de l'impression d'images avant les cellules de placage. Sélectionnez les canaux fluorescents appropriés et ajustez le temps d'exposition.
   REMARQUE : Pour comparer l'intensité de fluorescence des modèles entre les expériences, il est essentiel d'utiliser les mêmes temps d'exposition pour les mêmes protéines.

10. Stockage des micro-modèles

REMARQUE : Les micro-modèles avec des protéines adsorbed peuvent être stockés pendant différentes étapes du protocole (voir la figure 2). Si le micro-modelage avec plusieurs protéines, les micro-modèles peuvent être stockés après la première série de micro-modèles ou après que les deux cycles séquentiels de micro-modelage ont été achevés (voir la figure 2B).

1. Lorsque le PLL-PEG est passitin, entreposez les micro-modèles en PBS (3 ml par puits) à 4 oC pendant 3 jours.
2. Si le plat de culture a été collé avec PEG-SVA, les micro-modèles peuvent être stockés jusqu'à 1 mois. Pour ce faire, rincer intensivement les micro-modèles avec de l'eau déionisée à double distillation et sécher avec un pistolet à air stérile d'argon ou d'azote, bien que l'air normal puisse également être utilisé. Après le séchage, les micro-modèles peuvent être stockés à 4 oC pendant un mois (équipe de soutien du système PRIMO, communication personnelle).

11. Cellules de placage

REMARQUE : Au cours des prochaines étapes, les cellules seront plaquées sur le plat de culture micro-modèle préparé/es. Dans ces études, une lignée cellulaire neuronale (cellules CAO) est utilisée³¹. Toutefois, ce protocole peut être ajusté pour étudier d'autres types d'intérêt cellulaire (ajuster le protocole de placage cellulaire au besoin).

1. Différencier les cellules CAO pendant 48 h à l'aide du milieu de différenciation (DMEM complété avec 1% de glutamine, sans sérum, et avec 1% Pen/Strep, voir Tableau des Matériaux).
2. Assiette 1 ml de milieu avec des cellules dans le puits de verre intérieur, couvrant tous les micro-puits et placez le plat de culture dans un incubateur de CO₂ de 37 oC et 5 %.

Résultats

Suivant les résultats de protocole ci-dessus dans les surfaces micro-modèles, enduites de protéine d'ECM/s d'intérêt. Nous utilisons ces modèles pour suivre l'orientation neuronale.

Les modèles générés doivent être une représentation précise du modèle. Un exemple est illustré à la figure 6 où un modèle de modèle numérique (figure 6A) représentant une unité de conception (figure 5B), a donné lieu à des micro-modèles définis, d'une largeur de 20 à 2 m, recouverts d'étiquettes Fibrinogen (Figure 6B). À l'aide d'ImageJ, des mesures de l'intensité de la fluorescence ont été obtenues à la fois verticalement (figure 6C) et horizontalement (figure 6E) le long de la bande et à partir d'une région de fond correspondante de 15 m au-dessus de chaque bande. Les mesures de fond ont été soustraites des mesures de modèle pour chaque largeur de bande.

L'une des limites du système est qu'un effet de bord peut être observé (Figure 6B, bande supérieure) lors de l'impression de caractéristiques de 20 m, avec un signal d'intensité plus élevé aux bords du modèle par rapport au centre (Figure 6D, premier pic de profil d'intensité fluorescente). Dans nos expériences, la limite de résolution était d'environ 2 m; à cette largeur, nous avons observé une diminution significative (d'environ 50 %) dans l'intensité de fluorescence du fibrinogène par rapport à l'intensité des rayures plus larges (Figure 6F,G). Le modelage à l'aide du système PRIMO et du protocole décrit ici a produit des modèles reproductibles, avec l'écart standard le plus élevé de l'intensité fluorescente moyenne mesurée pour la largeur de 2 m à partir de quatre unités de conception répliquées individuelles(figure 6 G). La variation dans les rayures à motifs s'est également avérée faible; le coefficient de variation variait de 3 à 10 %, les rayures de 20 m et de 2 m ayant la plus grande variation interne. Cela est susceptible d'être le résultat de l'effet de bord et la limite de résolution du système, respectivement. Notez que pour ces mesures, nous n'avons mesuré l'intensité qu'au centre des rayures, afin d'éviter l'illumination inégale résultant de l'objectif utilisé pour acquérir ces images (vigne, Figure 6E).

Certaines expériences peuvent comporter des questions qui nécessitent des concentrations de protéines définies, qui peuvent être réalisées de deux façons : 1) en variant la concentration en protéines(figure 7A,B). L'incubation avec différentes concentrations de lamininin, a comme conséquence des intensités significativement différentes de fluorescence, augmentant avec des concentrations plus élevées de protéine (figure 7B). 2) La dose de laser qui est utilisée pour couper le film anti-adhésif (PEG) peut être variée. Des doses laser plus élevées enlèveront le film antifoulant dans une plus grande mesure, générant plus de sites de liaison pour les protéines d'intérêt (Figure 7C,D) résultant en des intensités de fluorescence significativement différentes, augmentant avec le laser plus élevé doses (figure 7D).

Varier la dose de laser permet la génération de gradients de protéines dans le même modèle. Ceci est affiché dans la figure 8A, où un modèle de gradient a été conçu en utilisant différents niveaux d'échelle grise, du noir (pas de puissance laser) au blanc (puissance laser maximale).

L'intensité laser est proportionnelle au niveau d'échelle grise du modèle (allant de 0 à 255 dans une image 8 bits), générant des gradients d'éclairage UV. La mesure du profil d'intensité de fluorescence le long de la bande de gradient est linéaire dans le modèle (figure 8B) et dans le modèle de gradient généré (Figure 8C,D). Ceci est reproductible parmi toutes les bandes de gradient dans le même modèle et modèle de gradient (Figure 8B,D). La génération de ces gradients est extrêmement utile et aide à imiter les environnements in vivo où les cellules répondent souvent aux gradients des protéines bioactives^34,35,36,37.

Les cellules sentent des environnements extracellulaires changeants, mais les essais qui permettent l'étude du comportement cellulaire lorsque les cellules rencontrent de tels changements sont limités. LIMAP peut être utilisé pour micro-modèle avec plusieurs protéines dans le même micro-puits. Des exemples sont présentés à la figure 9 où des motifs croisés ont été générés à l'égard de bandes de fibronectine (horizontale) et de lamininin (verticale). Lors de la création de modèles avec plusieurs protéines, il est crucial d'utiliser une étape de blocage entre la première et la deuxième incubation des protéines, pour empêcher la liaison croisée des protéines (voir l'étape 7). L'efficacité de blocage peut varier en fonction des caractéristiques biochimiques des protéines qui sont utilisées pour le revêtement et nous conseillons de tester plusieurs tampons de blocage, y compris PLL-PEG (0,1 mg/mL) et BSA (1%). Pour évaluer cet effet de liaison croisée, nous avons effectué des mesures d'intensité de fluorescence à l'aide d'ImageJ (Figure 9) et nous avons montré que la liaison croisée peut être réduite de façon spectaculaire, en utilisant le tampon PLL-PEG (0,1 mg/mL) pour la fibronectine et la laminine cross-patterns (Figure 9D,H).

Les modèles croisés générés ont été utilisés pour les essais cellulaires avec des cellules CAO (Figure 10A,B) ou des neurones de ganglion de racine dorsal-rat (DRG)(figure 10C). Leurs neurites (CAD) et les axones (DRG) poussent selon des lignes différentes. Les cellules CAO sont utilisées comme modèle neuronal puisqu'elles montrent un profil d'expression intégrine similaire par rapport aux neurones primaires et elles affichent encore des cônes de croissance riches en actine après 48 h en culture (Figure 10B), les rendant aptes à trouver des trajectoires. Études.

Afin d'étudier les effets cytotoxiques possibles des micro-modèles générés vers les neurones primaires, les neurones DRG ont été isolés et cultivés sur des micro-modèles suivant un protocole précédemment publié³⁸. Les résultats démontrent que les neurones primaires tolèrent l'environnement des micro-modèles (figure 10C). Nous étudions actuellement comment une variété de protéines ECM influencent l'axonal (neurite) pathfinding. La preuve préliminaire des concepts trouvés dans les cellules de CAO sera davantage étudiée utilisant des neurones dRG. Afin de valider la qualité des micro-modèles générés, il est souhaitable d'imager les modèles par microscopie fluorescence pour s'assurer que les bords du motif sont bien définis avant de passer au placage cellulaire. Pendant le processus d'imagerie, il est important d'assurer l'ajustement optique entre le microscope et la caméra afin d'éviter l'effet d'obscurcissement périphérique (vignetting) qui affecte l'analyse postérieure et l'interprétation des données. En outre, acquérir une image d'une région sans motif en utilisant les mêmes temps d'exposition qui seront utilisés pour l'image des modèles et soustraire cette image de l'image de modèle.

En résumé, pour une génération de micro-modèles de bonne qualité, il est conseillé d'évaluer la concentration en protéines (Figure 7A,B),les doses laser (Figure 7C,D), les niveaux de fond protéique (Figure 6E,F,H) et un étape de blocage efficace (Figure 9) lors de l'utilisation de plusieurs protéines. De façon concluante, la qualité des micro-modèles générés avec LIMAP est essentielle afin d'obtenir des données fiables et reproductibles à partir d'essais cellulaires.

Figure 1 : Schéma de techniques de micro-modèle : impression par microcontact et modelage assisté au laser. (A) L'impression Microcontact utilise un maître lithographié avec des micro-caractéristiques définies pour générer un timbre PDMS qui est incubé avec la protéine d'intérêt. Cette protéine est ensuite transférée (estampillée) sur une surface de verre, générant des micro-modèles protéiques. (B) Les techniques de modelage assistées par laser comprennent le photopatterning et le modèle laser direct. (C) La plupart des approches de photopatterning utilisent une source de lumière UV et un photomask (soit en contact avec la surface du substrat ou dans le plan focal de l'objectif) avec les géométries souhaitées afin de couper la surface antifouling PEG dans des positions spécifiques, créer un modèle défini. Une étape d'incubation de protéines subséquente entraîne une adsorption protéique uniquement dans les régions à cissons au laser. (D) LIMAP est une technique de photopatterning qui ne nécessite pas de photomasque en contact avec le substrat (c.-à-d., une approche sans masque et sans contact). LIMAP utilise un photo-initiateur, qui est activé par de faibles doses d'un laser, clivage les régions exposées à la lumière de PEG. Cela crée des sites d'attachement pour l'adsorption de protéine séquentielle. (E) Le modèle laser direct utilise la lumière à haute énergie pour émousser directement le film PEG, permettant la liaison des protéines dans ces régions gravées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Schéma montrant un résumé des étapes du protocole de micro-modèle. (A) Le micro-modelage avec une protéine n'implique qu'un seul cycle de micro-modelage (photopatterning et incubation de protéines) et peut être effectué en moins de 8 h. (B) Le micro-modelage avec plusieurs protéines nécessite deux cycles séquentiels de micro-modèle et peut être complété en 1-2 jours, selon le nombre de micro-modèles en cours de préparation. Il est possible de passer par la version B du protocole en 1 jour de travail. Les flèches continues indiquent un flux direct d'étapes dans le protocole. Les flèches discontinues indiquent qu'il y a un écart de temps important entre une étape et l'autre (voir l'étape 6.6 et 9.3). (C) Vue schématique des modèles d'exemple obtenus après un tour de micro-patterning (rayures rouges) ou deux tours séquentiels de micro-motifs (rayures rouges et vertes). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : La génération de modèles de modèles est polyvalente avec LIMAP. (A,B) Exemples de modèles conçus avec ImageJ (A arbalètes, lettres B). Les formes dessinées en blanc ont été projetées à la puissance laser maximale et les formes dessinées en noir n'ont pas été projetées. (C,D) Micro-modèles obtenus avec LIMAP à partir de modèles après l'incubation avec 10 x g/mL de fibrinogen (vert). (C) Les arbalètes mesurent une largeur de 50 m et une hauteur de 50 m espacées de 75 m à l'horizontale et de 50 m à la verticale. (D) Les lettres mesurent une largeur de 80 m et une hauteur de 85 m. Les barres d'échelle en C et D représentent 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Matériaux essentiels pour le protocole LIMAP. (A) Les pochoirs utilisés dans ce protocole mesurent des pièces pDMS de 20 mm de diamètre, de forme circulaire (250 m d'épaisseur) contenant 4 micro-puits (4 mm de diamètre chacun). Les volumes utilisés dans les micro-puits varient de 5 à 20 L, ce qui réduit considérablement la quantité de réactifs et de protéines nécessaires pour chaque expérience. (B) 6 plats en verre où des pochoirs ont déjà été placés dans chaque puits. Les micro-puits contiennent 20 L de PBS pour les rendre visibles. (C) Calibration plat dans lequel le puits de verre intérieur a été marqué avec un surligneur vert, qui sera utilisé pour calibrer la mise au point laser. (D) Vue schématique du haut à gauche bien du plat de fond en verre de 6 puits en B (décrit avec le cercle rouge pointillé). Le fond de verre intérieur est représenté en blanc et le pochoir est représenté en gris. Le pochoir contient 4 micro-puits (numérotés 1-4), pour l'essai de 4 conditions expérimentales différentes (p. ex., différentes concentrations de protéines, géométries de motifs, combinaisons de protéines, etc.). L'astérisque représente le micro-puits contenant le modèle de référence. (E) Vue schématique du micro-puits où un motif de référence a été généré dans la partie supérieure (flèche avec pointe de flèche remplie). Ce modèle de référence est nécessaire pour obtenir la mise au point laser optimale pour le modelage (voir l'étape 4). La flèche avec la pointe de flèche vide indique la zone centrale du micro-puits, qui sera employé pour le modelage suivant après calibrage de système. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Configuration logicielle pour le micro-modèle. (A) Modèle de modèle avec des rayures parallèles conçues avec ImageJ et enregistrées comme un fichier Tiff 8 bits. (B-D) Vue schématique des IA numériques (régions d'intérêt) qui chevaucheront les micro-puits actuels où des micro-modèles seront générés. (B) Le modèle de modèle à utiliser (longueur 1824 pixel 415 m, largeur 1140 pixels et 260 m) est sélectionné sur Leonardo et est projeté sur le roi-roi comme une unité de conception (bandes rouges dans le rectangle pointillé noir), qui couvrira environ 0,1 mm² de la micro-puits. L'unité de conception est reproduite en 4 colonnes et 4 lignes dans le menu de réplication (configuration de modèle), créant un modèle à travers le micro-puits. REMARQUE l'espace entre les colonnes. (C) Pour modeler les rayures continues, l'espacement entre les colonnes doit être ajusté. Dans ce cas, pour atteindre un chevauchement entre les unités de conception de l'espacement entre les colonnes est fixé dans le menu de réplication comme espacement négatif, -20 m. (D) Afin de modeler plusieurs protéines dans le même micro-puits, un alignement précis des modèles est Obligatoire. Pendant l'étape de configuration du logiciel (étape 5), téléchargez tous les modèles de modèle souhaités simultanément. Sur la liste actions, sélectionnez uniquement les actions spécifiques à modeler lors de chaque cycle et désélectionnez le reste des actions (étapes 5.12, 5.13 et 8.2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Analyse de la variabilité des modèles à l'aide de LIMAP. (A) Modèle de modèle conçu avec ImageJ utilisé pour micro-modèle quatre bandes de largeur variable (20, 10, 5, 2 m, de haut en bas). (B) Micro-modèle obtenu après l'incubation avec 10 g/mL de fibrinogène fluorescent (vert). (C) Mesures d'intensité le long d'une ligne verticale traversant les rayures du micro-modèle. (D) Profil vertical d'intensité de fluorescence obtenu à partir de la mesure dans (C). REMARQUE qu'à de plus grandes largeurs (20 m), il y a une variation du profil vertical causée par l'accumulation de protéines aux bords de la bande, ce qui donne deux pics d'intensité de fluorescence distincts (effet de bord). Cet effet n'est observé que sur les largeurs des bandes de 20 m. (E) Mesures d'intensité le long des lignes horizontales représentées (fluorescence et fond). (F) Profils horizontaux d'intensité de fluorescence obtenus à partir de mesures dans (E). (G) Graphique montrant l'intensité moyenne pour chaque largeur de bande, mesurée à partir de quatre unités de conception répliquées individuelles (variation entre les motifs). REMARQUE l'adsorption réduite de protéine aux modèles de la largeur de bande de 2 m. (H) La variation dans les rayures à motifs (coefficient de variation) était faible pour toutes les largeurs de rayures, allant de 3 à 10%. Les données de G et H présentées comme moyennes et SD. L'analyse statistique en G et H a été effectuée à l'aide d'un test non paramétrique ANOVA (Kruskal-Wallis) à sens unique avec de multiples comparaisons. La valeur P est de 0,001 euros pour l'importance de l'indice. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : L'effet des variations de la puissance laser et de la concentration en protéines pour l'efficacité de l'adsorption des protéines. (A) La surface PLL-PEG a été clivée au laser avec une dose laser constante (1390 mJ/mm²) et incubée avec les concentrations indiquées de lamininine fluorescente (magenta). (B) Quantification de l'intensité de fluorescence des rayures de laminin dans (A). (C) Les différentes doses laser indiquées ont été appliquées suivies d'une incubation avec la même concentration (10 g/mL) de fibronectine fluorescente (verte). (D) Quantification de l'intensité de fluorescence des rayures de fibronectine dans (C) montrant que des doses plus élevées de laser se corrèlent à des niveaux plus élevés de protéine adsorbée. Toutes les mesures sont sous-traitances. Les numéros d'échantillon sont indiqués au bas des colonnes; les données sont présentées comme moyennes - SEM. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'un test Mann-Whitney non paramétrique avec calcul à deux queues. P-valeur est lt;0.0001 pour l'importance de '. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Génération d'un gradient de concentration de protéines dans un micro-modèle. (A) Modèle de modèle gradient à l'échelle grise. (B) Profil d'intensité de fluorescence mesuré à partir de (A). (C) Modèle obtenu avec LIMAP à partir du modèle de modèle (A) après l'incubation avec 10 g/mL de fibronectin fluorescent (vert). (D) Profil d'intensité de fluorescence de n 3 rayures et fond représenté sa moyenne , SEM, montrant l'augmentation linéaire de l'intensité du gradient protéique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9 : L'effet de liaison croisée lors du modelage de plusieurs protéines de façon séquentielle. (A-C, E-G) Motifs croisés avec des bandes de 10 m de fibronectine fluorescente (cyan, horizontale) et de lamininine fluorescente (magenta, verticale). (A-C) Échantillons traités avec le tampon de blocage BSA. (E-F) Échantillons traités avec PLL-PEG pour bloquer des sites de liaison non spécifiques (étape 7). (A,E) Canaux de fluorescence fusionnés montrant à la fois la fibronectine et la laminine. (B,F) Image montrant la fibronectinseulement seulement. (C,G) Image montrant laminin seulement. Pour C, notez la présence de laminine également sur les rayures positives horizontales de fibronectin qui est due au blocage inefficace des emplacements de liaison inoccupés avec BSA. Pour G, notez que le blocage avec PLL-PEG empêche de lier efficacement la laminine aux rayures de fibronectine. (D,H) Profils d'intensité de fluorescence obtenus à partir de mesures indiquées (ligne jaune diagonale) en A et E, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10 : Modèles croisés pour étudier le neurite/axone. (A-C) Motifs croisés avec des bandes de 10 m de fibronectine fluorescente (cyan, horizontale) et de lamininine fluorescente (magenta, verticale). (A,B) Images fluorescentes de cellules CAO avec des neurites poussant le long des micro-modèles. Pour visualiser les névrites, les cellules ont été cultivées pendant 48 h, fixées avec 4% de PFA et tachées de tubuline (A) ou de tubuline et d'actine (B). (C) Les neurones de ganglion dorsal-root de rat (DRG) avec des axones se développant le long des micro-modèles. Pour visualiser les axones, les neurones DRG ont été cultivés pendant 72 h, fixés avec 4% de PFA et tachés de tubuline. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 11 : Exemples de résultats négatifs courants obtenus lors de la génération de micro-modèles avec LIMAP. (A-C) Des rayures à motifs sous-optimaux de 10 x g/mL de fibrinogène fluorescent (vert) obtenues dans des circonstances différentes. (A) Le micro-puits s'est desséché pendant la génération du modèle. Notez les niveaux élevés de fluorescence en arrière-plan (flèche) et la présence de cristaux PBS (astérisques). (B) La couture entre les rayures n'a pas été correctement ajustée lors de la configuration du logiciel, ce qui a entraîné des rayures discontinues avec des lacunes (flèche) entre les unités de conception (voir l'étape 3.4.7). (C) La mise au point laser était sous-optimale causant des rayures diffuses (flèches) qui ne représentent pas les largeurs de rayures réelles du modèle, qui devrait être de 20, 10, 5, 2 m de haut en bas, comme dans (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Avantages de micro-modelage LIMAP (PRIMO) et comparaison avec l'impression par microcontact
Alors que l'impression par microcontact est probablement la technique de micro-modèle la plus couramment utilisée dans le domaine biologique³⁹, il semble y avoir un nombre croissant de chercheurs utilisant la technologie LIMAP^{40,41,42 ,43,44}. Ici, nous avons présenté un protocole utilisant PRIMO, un système disponible dans le commerce pour LIMAP. Ci-dessous, nous discutons brièvement des avantages potentiels et des limites de l'impression par microcontact et du photo-patterning LIMAP.

L'impression par microcontact nécessite des maîtres lithographiés produits par spin-enduit un photo-masque (généralement SU-8) sur une plaquette de verre ou de silicium, qui est ensuite gravée au laser avec les micro-caractéristiques souhaitées. Ces maîtres sont utilisés comme modèles pour créer un timbre PDMS⁴⁵. Le timbre est incubé avec une protéine choisie qui adsobe à elle, et est ensuite transféré (estampillé) sur le plat de culture cellulaire. Le processus d'adsorption de la protéine au timbre PDMS dépend de la concentration de protéines, du tampon et du temps d'incubation. Ces paramètres doivent être testés à l'avance pour des résultats optimaux⁴⁶.

Les maîtres peuvent être utilisés dans un nombre important d'expériences, d'une durée de plusieurs mois, voire d'années, s'ils sont correctement conservés. Cependant, un facteur limitant de cette technologie est la nécessité de re-concevoir de nouveaux maîtres lithographiés pour chaque modification désirée. Les changements dans les conceptions expérimentales peuvent entraîner une production fastidieuse de nouveaux maîtres (jusqu'à plusieurs semaines) retardant ainsi les expériences. En comparaison, le photopatterning limaP ne nécessite pas un maître physique; il utilise des modèles de modèles générés par des logiciels qui peuvent être utilisés pour adapter avec souplesse les géométries souhaitées des micro-modèles aux questions de recherche changeantes. LIMAP peut également être utilisé pour générer des gradients protéiques dans le même micro-modèle (Figure 8), qui est plus difficile à obtenir d'une manière reproductible en utilisant l'impression microcontact⁴⁷.

De plus, la résolution micro-modèle obtenue avec LIMAP, dans notre cas, est de 2 m (figure 6B).

L'approche de cette résolution a augmenté la variabilité intra- et inter-modèles. La génération de motifs autour ou au-dessus de 10 m de largeur était hautement reproductible (figure 6G,H). Au contraire, avec l'impression par microcontact, il est difficile d'obtenir systématiquement des résolutions inférieures à 10 m et il est courant de trouver des artefacts lors de l'estampillage de petites caractéristiques (données non affichées).

Nous avons montré que LIMAP peut être utilisé pour micro-modèle protéines multiples (Figure 9) dans le même micro-puits, permettant d'autres niveaux de complexité à ajouter aux expériences. Bien que cela puisse être réalisé avec l'impression par microcontact, aligner différentes protéines avec un haut niveau de précision peut être techniquement assez exigeant. Bien que le modelage de plusieurs protéines à l'aide de LIMAP semble direct, il est important de mentionner que la liaison croisée des protéines par des procédures de revêtement séquentiel peut être réduite par le blocage des réactifs, mais pas entièrement éliminé (Figure 9).

En ce qui concerne le coût de l'une ou l'autre technique, LIMAP tel que décrit ici nécessite l'achat d'équipementde micro-modèle (PRIMO) qui peut être installé sur différents microscopes à fluorescence et nécessite une étape motorisée. Bien que cet investissement soit d'abord coûteux, il n'y a pas d'autres achats que des articles consommables (pochoirs, PEG et PLPP) à long terme associés à LIMAP. Alternativement, les pochoirs PDMS peuvent également être produits en laboratoire par le propre expérimentateur suivant les protocoles publiés^18,32. Les coûts les plus élevés pour l'impression par microcontact peuvent être associés à la production de nouveaux maîtres, ce qui peut devenir substantiel si les expériences nécessitent de nouveaux modèles.

Un inconvénient de LIMAP est l'approche relativement faible de débit de cette technique. L'impression par microcontact peut produire un grand nombre de micro-modèles rapidement et efficacement dans une étape d'estampage simultanée, par rapport au micro-modèle laser séquentiel requis avec LIMAP. Par exemple, il est possible de produire 6 couvercles en verre estampillés en environ 2 h avec impression microcontact à l'aide de timbres PDMS (à l'exclusion de la préparation des timbres); le modelage d'une zone similaire (plat de 6 puits) avec LIMAP prendrait environ 4 h, à l'exclusion de la procédure de passivation de surface (compte tenu de la configuration du modèle décrit à l'étape 5.12 et voir Figure 5B).

Un autre facteur limitant le taux de la technologie LIMAP est le long temps d'éclairage requis pour modeler de grandes surfaces (30 s par unité de conception avec un laser de 7,5 mW/mm^2). Dans ces cas, l'impression par microcontact peut être une option privilégiée. Un nouvel initiateur photo (gel PLPP, Table of Materials)devrait réduire considérablement le temps de modelage, permettant la génération de centaines de micro-modèles dans de grandes surfaces (jusqu'à 8 mm²) en quelques minutes.

Un autre facteur important à prendre en compte lorsque les surfaces de micro-modèle pour la culture cellulaire est la reproductibilité des micro-modèles entre les différentes répétitions expérimentales, par rapport à la variabilité obtenue avec l'impression par microcontact. Par exemple, les graphiques présentés à la figure 7B,D sont des données représentatives de trois répétitions expérimentales indépendantes avec des résultats très similaires (données non affichées). Basé sur notre expérience et les publications précédentes, ce niveau de reproductibilité est difficile à atteindre avec l'impression microcontact^{48,49,50,51,52}.

Contrairement à d'autres techniques de photo-modèle qui nécessitent soit une chimie dédiée à l'ingénierie des matériaux photosensibles ou l'utilisation de photo-sensibiliseurs, qui ne sont généralement pas très biocompatible³, la composante photosensible de LIMAP (PLPP ) est biocompatible et bien toléré par les cellules^21; dans nos mains, nous n'avons pas connu de cytotoxicité dans une variété de cellules, y compris les neurones CAO, DRG (Figure 10), fibroblastes, cellules épithéliales, et les cellules du mélanome (données non montrées). Un autre avantage de LIMAP en utilisant PRIMO par rapport à d'autres techniques de photo-modèle est qu'aucun photomasque n'est nécessaire. Semblable à l'impression par microcontact, de nouveaux masques photo devraient être conçus et générés pour chaque modèle désiré.

Toutes les limitations mentionnées ci-dessus pour l'impression par microcontact, se réfèrent à l'approche manuelle de la technique. Cependant, il est possible d'améliorer le débit et la reproductibilité de l'impression par microcontact à l'aide d'un dispositif automatisé avec charge de timbre et contrôle de pression⁵³.

Étapes clés du protocole et résolution de problèmes pour LIMAP à l'aide de PRIMO
L'un des problèmes les plus courants rencontrés au cours de ce protocole est d'avoir des niveaux élevés de fluorescence de fond dans les micro-modèles. Cela peut être dû à l'assèchement des micro-puits qui se produit souvent en raison de leur faible volume. Lorsque cela se produit, les cristaux DEPBS apparaissent souvent autour des motifs ECM (figure 11A).

Des étapes de lavage insuffisantes ou inefficaces après l'incubation des protéines peuvent également entraîner des niveaux élevés de fluorescence de fond. Cela peut être observé en particulier lors de l'utilisation de concentrations protéiques de 10 g/mL(figure 11B) ou plus. L'excès de protéines en arrière-plan peut être réduit en incluant des étapes de lavage supplémentaires avec PBS.

La présence de fond protéique doit être mesurée et caractérisée dans chaque expérience, en calculant l'intensité de fluorescence de fond (Figure 6E) et en la soustrayant de l'intensité des micro-modèles (Figure 6F-H et figure 7B,D). Le fond de protéine élevée peut avoir un impact dans l'attachement et la germination des cellules de CAO, compromettant l'interprétation des résultats.

Avoir des écarts entre les unités de conception est un problème commun lorsque les utilisateurs ont une expérience limitée (Figure 11B), qui se produit en raison d'un chevauchement insuffisant entre les modèles. Deux paramètres du logiciel Leonardo peuvent être ajustés pour surmonter ceci : 1) un espacement négatif entre les colonnes peut être nécessaire, selon la conception du modèle (étape 5.7 et voir Figure 5B,C). Alternativement, 2) utiliser l'option gradient dans le menu Expert pour coudre les colonnes. Un test rapide pour déterminer les paramètres optimaux d'espacement peut être effectué à l'aide d'adhésif UV (Tableau des matériaux). Une petite goutte de cet adhésif est appliquée sur un toboggan en verre, qui est ensuite recouvert d'une couverture en verre, faisant un film. L'adhésif UV intégré est photopatterned avec le modèle de modèle d'intérêt utilisant une dose laser basse (30 mJ/mm²). Les régions exposées aux UV de l'adhésif intégré seront guéries, devenant visibles sous la microscopie des champs lumineux. Les résultats des tests sont visualisés pour évaluer l'espacement obtenu dans le modèle. Dans nos expériences neuronales, un écart entre les rayures peut nuire au comportement cellulaire, produisant des variations dans la dynamique de croissance (soit une vitesse réduite ou l'abandon du chemin).

Dans la dernière mise à jour du logiciel Leonardo (au moment de la publication, Leonardo 4.11), il est possible de télécharger des modèles de modèles plus grands conçus précédemment qui couvrent une surface beaucoup plus grande (jusqu'à 8 mm² en utilisant l'objectif 20X) de la surface micro-puits par rapport à l'actuel 0,1 mm² par unité de conception, éliminant la nécessité de coudre ensemble les plus petites unités de conception. Les bords non définis peuvent résulter d'un manque d'ajustement de mise au point laser pendant la génération du modèle (Figure 11C). Il est donc essentiel de calibrer le laser et d'effectuer des étapes de modèle de référence (voir l'étape 4) avant le modelage. Les rayures mal définies entraînent des variations de la largeur des bandes, ce qui rend difficile la corrélation entre la dynamique de croissance des axones et la largeur des rayures. Les axones ont également tendance à abandonner les rayures qui ont des bords diffus. En outre, la variabilité des bords peut également être trouvée lors de l'impression de bandes de 10-20 m de largeur ou plus, résultant en une teneur en protéines plus élevée sur les bords par rapport aux régions centrales du modèle (Figure 6B,D). Cet effet de bord est produit par une diffusion non homogène du photo-initiateur pendant le processus de photopatterning. La réaction de photoscission dépend de l'oxygène, qui diffuse plus sur les bords. Cet effet de bord peut être minimisé homogénéisant le photo-initiateur avec une pipette dans le micro-puits pendant le processus de photopatterning. En outre, un nouveau photo-initiateur commercialisé (gel PLPP), peut également réduire l'effet de bord (équipe de soutien du système PRIMO, communication personnelle).

La micro-impression de plus d'une protéine peut entraîner une liaison croisée(figure 9A-D). Cela peut être minimisé en augmentant l'efficacité de blocage qui est utilisé pour occuper des sites de liaison non spécifiques entre les étapes d'incubation pour les deux protéines différentes. La liaison croisée des protéines peut perturber la reproductibilité des résultats expérimentaux et peut conduire à une mauvaise interprétation des données, car il est difficile de déterminer la contribution de chaque protéine à la dynamique de croissance des axones et à d'autres comportements cellulaires.

conclusion
Nous espérons que le protocole fourni à l'aide de LIMAP facilitera la génération de micro-modèles protéiques grâce à l'utilisation du système PRIMO. Alors que notre protocole se concentre sur la façon de produire de façon fiable des micro-modèles dans les surfaces en verre 2D, d'autres ont montré qu'il est possible d'utiliser LIMAP pour le micro-modelage de substrats mous⁵⁴, et les surfaces microstructurées pour les cultures^{3D 42}. Ces micro-modèles peuvent être un outil polyvalent pour étudier les réponses cellulaires aux changements dans leur micro-environnement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa 488 kit de marquage des protéines	Invitrogen	A10235	Concentration de travail : N.A.
Kit de marquage des protéines Alexa 647	Invitrogen	A20173	Concentration de travail : N.A.
Cellules CAD	ECACC	8100805	Concentration de travail : N.A.
Sondes moléculaires	conjuguées fibrinogène-488	F13191	Concentration de travail : 10 &mu ; g/ml
de milieu de culture DMEM	Gibco	11320033	Concentration de travail : N.A.
Microscope à épifluorescence**	Nikon	Eclipse Ti inversé Concentration de	travail : N.A.
Fibronectine	Sigma	F4759	Concentration de travail : 10 &mu ; g/ml (après marquage avec le kit de marquage des protéines Alexa 488, voir ci-dessus) (dilué dans PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Version 2.0.0-rc-54/1.51f	Concentration de travail : N.A.
Surligneur fluorescent	Stabilo	Stabilo Boss Concentration de	travail d’origine : N.A.
HEPES	Gibco 15630080		Concentration de travail : 1M
Logiciel Inkscape	Inkscape Vérifier	la dernière mise à jour	Concentration de travail : N.A.
Cytosquelette	rhodamine fluorescente rouge laminine	LMN01	Concentration de travail : 10 &mu ; g/ml (dilué dans PBS)
Logiciel Leonardo	Alvé ; ole	version 4.11	Concentration de travail : N.A.
L-Glutamine	Sigma	G7513	Concentration de travail : 1 %
Logiciel de micro-gestion	Ouvrir l’imagerie	Vérifier la dernière mise à jour	Concentration de travail : N.A.
Platine x/y motorisée	PRIOR Scientific	Proscan II	Concentration de travail : N.A.
NIS Elements Software	Nikon	NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (Avec jobs Nikon)	Concentration de travail : N.A.
PBS (sans Ca2+, Mg2+)	Sigma	D8537	Concentration de travail : 1X
pochoirs PDMS	Alvé ; ole	visit www.alveolelab.com	Concentration de travail : N.A.
PEG-SVA	Laysan bio, Inc.	MPEG-SVA-5000-1g	Concentration de travail : 50 mg/ml
Phalloïdine 405	Abcam	ab176752	Concentration de travail : 1:1000
Photo-initiateur (PLPP)	Alvé ; ole	Classic PLPP	Concentration de travail : 14,5 mg/ml
Photo-initiateur (gel PLPP)	Alvé ;	Concentration	de travail : 4,76 % dilué dans de l’éthanol
Nettoyant plasma	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)	Concentration de travail : N.A.
PLL-PEG	SuSoS (également distribué par Alvé ; ole)	www.alveolelab.com	Concentration de travail : 0,1 mg/ml (dilué dans du PBS)
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	Concentration de travail : 0.01 %
Primo equipment	Alvé ; ole	www.alveolelab.com	Concentration de travail : N.A.
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Concentration de travail : 1 %
Anticorps anti-alpha de tubuline	Abcam	DM1A	Concentration de travail : 1:1000 cellules CAD
Anticorps anti-bêta 3 de tubuline	Sigma	T8660	Concentration de travail : 1:500 neurones
Adhésif UV	Norland Products	NOA81	Concentration de travail : N.A.
1 cuvette à fond en verre	Cellvis	D35-20-1.5-N	Concentration de travail : N.A.
Plat à fond en verre 6 puits	Cellvis	P06-20-1.5-N	Concentration de travail : N.A.
Objectif 20x**	Nikon	sans bague de phase (consulter le catalogue mis à jour)	Concentration de travail : N.A. **Microscope à épifluorescence : des images ont été acquises et des motifs ont été générés sur un microscope inversé Eclipse Ti (Nikon), couplé à un équipement de micro-structuration PRIMO (Alvé ; ole), à l’aide d’un objectif 20x (0,75 S Plan Fluor (sans anneau, Nikon). Des jeux de filtres spécifiques à Nikon pour GFP, mCherry et Cy5 ont été utilisés et la source de lumière fluorescente était LED (Lumencor), bien que d’autres sources de fluorescence et jeux de filtres puissent être utilisés. Le microscope dispose d’une platine x/y automatisée (PRIOR Scientific) pour l’impression de motifs multi-champs et de Nikon Perfect Focus pour éviter la dérive de la mise au point. Les images ont été collectées à l’aide d’une caméra Retiga R6 (Q-Imaging).