Method Article

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que médiateurs immunitaires dans des microenvironnements spécifiques.

Abstract

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L’état neuroinflammatoire du système nerveux central (SNC) joue un rôle clé dans les conditions physiologiques et pathologiques. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes dans le cerveau, et parfois les macrophages infiltrés dérivés de la moelle osseuse (BMDM), régulent le profil inflammatoire de leur microenvironnement dans le SNC. Il est maintenant admis que les populations extracellulaires de vésicule (EV) des cellules immunitaires agissent comme médiateurs immunitaires. Ainsi, leur collecte et leur isolement sont importants pour identifier leur contenu, mais aussi évaluer leurs effets biologiques sur les cellules bénéficiaires. Les données actuelles mettent en évidence les exigences chronologiques pour l’isolement des ev des cellules de microglies ou des macrophages sanguins, y compris les étapes ultracentrifugation et chromatographie de taille-exclusion (SEC). Une analyse protéomique non ciblée a permis la validation des signatures protéiques comme marqueurs EV et a caractérisé le contenu biologiquement actif de EV. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont également été utilisés fonctionnellement sur la culture primaire des neurones pour évaluer leur importance en tant que médiateurs immunitaires dans la excroissance neurite. Les résultats ont montré que les véhicules électriques dérivés de microglies contribuent à faciliter la excroissance neurite in vitro. En parallèle, les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été fonctionnellement utilisés comme médiateurs immunitaires dans les cultures sphéroïdes des cellules de glioma de C6, les résultats montrant que ces véhicules électriques contrôlent l’invasion de cellules de gliome in vitro. Ce rapport met en évidence la possibilité d’évaluer les fonctions des cellules immunitaires à médiation EV, mais aussi de comprendre les bases moléculaires d’une telle communication. Ce déchiffrement pourrait favoriser l’utilisation de vésicules naturelles et/ou la préparation in vitro de vésicules thérapeutiques afin d’imiter les propriétés immunitaires dans le microenvironnement des pathologies du SNC.

Introduction

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Beaucoup de neuropathologies sont liées à l’état neuro-inflammatoire qui est un mécanisme complexe qui est de plus en plus considéré, mais toujours mal compris parce que les processus immunitaires sont divers et dépendent de l’environnement cellulaire. En effet, les troubles du SNC n’impliquent pas systématiquement les mêmes signaux d’activation et les mêmes populations de cellules immunitaires et, par conséquent, les réponses pro ou anti-inflammatoires sont difficiles à évaluer comme causes ou conséquences de pathologies. Les macrophages résidents du cerveau appelés "microglies" semblent être à l’interface entre le système nerveux et le système immunitaire

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Protocol

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1. Culture primaire des Microglies/Macrophages

  1. Culture primaire de la microglie
    1. Microglie primaire de rat commercial de culture (2 x 106 cellules) (voir la Table des Matériaux) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum sans exosome, 100 U/mL de pénicilline, 100 'g/mL streptomycine, et 9,0 g/L de glucose à 37 'C et 5% deCO2%.
    2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 48 h et procéder à l’isolement des véhicules électriques.
  2. Culture primaire des macrophages
    1. Macrophages primaires de rat co....

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Results

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L’un des principaux défis à l’attribution des effets biologiques aux vésicules extracellulaires (VE) est la capacité d’isoler les véhicules électriques de l’ensemble du milieu de la culture. Dans ce rapport, nous présentons une méthode utilisant l’ultracentrifugation (UC) et la chromatographie de taille-exclusion (SEC) qui est couplée à l’analyse à grande échelle des signatures de protéine pour valider des marqueurs EV et identifier des composés bioactifs. Les véhicules électriques dérivés du macrophage ou des microglies.......

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Discussion

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Le système nerveux central (SNC) est un tissu complexe dans lequel la communication cellule-cellule régule les fonctions neuronales normales nécessaires pour l’homéostasie30. Les véhicules électriques sont maintenant largement étudiés et décrits comme des cargaisons moléculaires importantes pour la communication cellule-cellule31. Ils livrent spécifiquement un cocktail de médiateurs aux cellules de destinataire affectant ainsi leurs fonctions dans des conditions saines et p.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Les travaux présentés ont été soutenus par le Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche et l’INSERM. Nous remercions l’installation BICeL- Campus Scientific City pour l’accès aux instruments et aux conseils techniques. Nous remercions Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard et Isabelle Fournier pour l’assistance à la spectrométrie de masse. Nous remercions Tanina Arab, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli et Pierre-Eric Sautière pour leur forte contribution aux développements scientifiques et techniques.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 % Mini-PROTEAN  ; Gels protéiques préfabriqués TGXBio-rad4561045EDU&nbsp ;
AcétonitrileFisher ChemicalsA955-1  ;
Filtre centrifuge Amicon 50 kDaMerckUFC505024  ;
Bicarbonate d’ammoniumSigma-Aldrich9830  ;
HSP90 &alpha ;/&beta ; (RRID : AB_675659)Santa-cruzsc-13119  ;
Supplément B27 PlusGibcoA3582801  ;
BenchMixer V2 Mélangeur VortexBenchmark ScientificBV1003  ;
Concentré de réactif de colorant pour dosage de protéines Bio-Rad (Bradford)Bio-Rad5000006  ;
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096  ;
Cellule de gliome de rat C6ATCCATCC CCL-107  ;
Tubes canoniquesSarstedt62.554.002  ;
CentrifugeuseEppendorf5804000010  ;
Incubateur CO2ThermoFisher  ;  ;
Microscope confocal LSM880Carl ZeissLSM880  ;
Verre de protectionMarienfeld111580  ;
Plat de culture (60 mm)Sarstedt82.1473  ;
DithiothreitolSigma-Aldrich43819  ;
DMEMGibco41966029  ;
EASY-nLC 1000 Chromatographe en phase liquideThermoFisher  ;  ;
Microscope électronique JEM-2100JEOL²  ;
Acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétiqueSigma-Aldrich03777-10G  ;
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-AldrichED-100G  ;
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1FBS appauvrie en exosomes
(100 principales protéines d’Evs)  ;  ;http://www.exocarta.org/
Sérum fœtal bovinGibco16140071  ;
Sérum Fœtal ChevalBiowestS0960-500  ;
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001  ;
Fisherbrand  ; Sonicateur Q500 avec sondeFisherbrand12893543  ;
FlexAnalysisBrucker  ;  ;
Support de montage à fluorescenceAgilentS3023  ;
Acide FormiqueSigma-Aldrich695076  ;
Grilles en cuivre revêtues de carbone FormvarAgar scientific LtdAGS162-3  ;
GlucoseSigma-AldrichG8769  ;
GlutaraldéhydeSigma-Aldrich340855  ;
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT  ;
IdoacétamideSigma-AldrichI1149  ;
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L  ;
Microscope à lumière inversée CKX53Olympus  ;
L-glutamineGibco25030-024  ;
LabTek II 8 puits&nbsp ; Nunc154534  ;
Laemmli 2xBio-Rad1610737  ;
LamininCorning354232  ;
Logiciel MaxQuant (logiciel d’identification de protéines)  ;https://maxquant.net/maxquant/
MBT : Stell polonaisBrucker8268711  ;
MEM 10xGibco21090-022  ;
MéthylcelluloseSigma-AldrichM6385-100G  ;
Eau MiliQMerck Millipore  ;  ;
LaitRegilaitREGILAIT300  ;
Mini PROTEAN Cellule d’électrophorèse verticaleBio-Rad1658000FC&nbsp ;
MonoP FPLC colonneGE Healthcare  ;N’est plus disponible
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300  ;
Logiciel NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  ;  ;
Pousse-seringue NanoSightMalvern Panalytical  ;  ;
Gibco Neurobasal21103-049  ;
Membrane nitrocellulosiqueGE Healthcare10600007  ;
Nonidet P-40Fluka56741  ;
Nunc multi-parabole 24 puitsThermoFisher82.1473  ;
ParaformaldéhydeElectro microscopie Science15713  ;
Lignée cellulaire PC-12ATCCATCC CRL-1721  ;
Pénicilline-StreptomycineGibco15140-122  ;
Mélange d’étalonnage des peptidesLaserBio LabsC101  ;
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-035-003  ;
Logiciel Perseus (Traitement des protéines identifiées)  ;  ;https://maxquant.net/perseus/
Conjugué phalloïdine-tétraméthylrhodamineSanta-cruzsc-362065  ;
Fluorure de phénylméthanesulfonyleSigma-Aldrich78830  ;
Tampon phosphate SalineInvitrogen14190094sans calcium, sans magnésium
pluriStrainer M/ 60 µ ; mpluriSelect43-50060  ;
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407  ;
Tubes à centrifuger en polycarbonateBeckman Coulter355651  ;
Inhibiteur de protéaseSigma-AldrichS8830-20TAB  ;
Systèmes de cellulesPureCol5005  ;
Spectromètre de masse Q-ExactiveThermoFisher  ;  ;
spectromètre de masse rapifleXBrucker  ;  ;
Neurones corticaux de ratApplications cellulairesR882N-20Origine cellulaire : Dérivé des cortex cérébraux du jour 18 embryonnaire Sprague Dawley cerveaux de rat
Rat Macrophage & Culture de microglie Cellules moyennesApplicationsR620K-100Origine cellulaire : Moelle osseuse de rat normale et saine
Macrophages primaires de ratApplications cellulairesR8818-10a  ;
Microglie primaire du ratLonzaRG535  ;
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001
Trypsine modifiée de qualité séquençagePromegaV5111° ;
SlideDustsher100204  ;
Chlorure de sodiumScharlauSO0227  ;
Dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichL3771  ;
Fluorure de sodiumSigma-AldrichS7920-100G  ;
Hydroxyde de sodiumScharlabSO0420005P  ;
Pyrophosphatede sodium Sigma-AldrichS6422-100G  ;
Concentrateur sous vide SpeedVacThermoFisher  ;
Logiciel de chaîne (réseaux d’association de protéines fonctionnelles)  ;  ;https://string-db.org/
Substrat SuperSignal West Dura à durée prolongéeThermoFisher34075  ;
Seringue 1,0 mLTerumo8SS01H1  ;
Cellule de transfert semi-sèche Trans-Blot SDBio-Rad1703940  ;
Acide trifluoroacétiqueSigma-AldrichT6508  ;
TrisInterchimUP031657
Tris-GlycineEuromedexEU0550  ;
Tween 20Sigma-AldrichP2287  ;
UltracentrifugeuseBeckman CoulterA95765  ;
Rotor d’ultracentrifugeuse 70.1 TiBeckman Coulter342184  ;
Acétate d’uranyleAgar Scientific LtdAGR1260A  ;
Papier filtre WhatmanSigma-AldrichWHA10347510  ;
&alpha ;-Acide cyano-4-hydroxycinnamiqueSigma-AldrichC2020-25G  ;
Base de données

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

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