Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

Résumé

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que médiateurs immunitaires dans des microenvironnements spécifiques.

Résumé

L’état neuroinflammatoire du système nerveux central (SNC) joue un rôle clé dans les conditions physiologiques et pathologiques. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes dans le cerveau, et parfois les macrophages infiltrés dérivés de la moelle osseuse (BMDM), régulent le profil inflammatoire de leur microenvironnement dans le SNC. Il est maintenant admis que les populations extracellulaires de vésicule (EV) des cellules immunitaires agissent comme médiateurs immunitaires. Ainsi, leur collecte et leur isolement sont importants pour identifier leur contenu, mais aussi évaluer leurs effets biologiques sur les cellules bénéficiaires. Les données actuelles mettent en évidence les exigences chronologiques pour l’isolement des ev des cellules de microglies ou des macrophages sanguins, y compris les étapes ultracentrifugation et chromatographie de taille-exclusion (SEC). Une analyse protéomique non ciblée a permis la validation des signatures protéiques comme marqueurs EV et a caractérisé le contenu biologiquement actif de EV. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont également été utilisés fonctionnellement sur la culture primaire des neurones pour évaluer leur importance en tant que médiateurs immunitaires dans la excroissance neurite. Les résultats ont montré que les véhicules électriques dérivés de microglies contribuent à faciliter la excroissance neurite in vitro. En parallèle, les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été fonctionnellement utilisés comme médiateurs immunitaires dans les cultures sphéroïdes des cellules de glioma de C6, les résultats montrant que ces véhicules électriques contrôlent l’invasion de cellules de gliome in vitro. Ce rapport met en évidence la possibilité d’évaluer les fonctions des cellules immunitaires à médiation EV, mais aussi de comprendre les bases moléculaires d’une telle communication. Ce déchiffrement pourrait favoriser l’utilisation de vésicules naturelles et/ou la préparation in vitro de vésicules thérapeutiques afin d’imiter les propriétés immunitaires dans le microenvironnement des pathologies du SNC.

Introduction

Beaucoup de neuropathologies sont liées à l’état neuro-inflammatoire qui est un mécanisme complexe qui est de plus en plus considéré, mais toujours mal compris parce que les processus immunitaires sont divers et dépendent de l’environnement cellulaire. En effet, les troubles du SNC n’impliquent pas systématiquement les mêmes signaux d’activation et les mêmes populations de cellules immunitaires et, par conséquent, les réponses pro ou anti-inflammatoires sont difficiles à évaluer comme causes ou conséquences de pathologies. Les macrophages résidents du cerveau appelés "microglies" semblent être à l’interface entre le système nerveux et le système immunitaire¹. Les microglies ont une origine myéloïde et sont dérivées du sac jaune pendant l’hématopoiesis primitive pour coloniser le cerveau, tandis que les macrophages périphériques sont dérivés du foie foetal pendant l’hématopoiesis définitif pour devenir macrophages périphériques². Les cellules de microglies communiquent avec les neurones et les cellules gliales dérivées de neurones telles que les astrocytes et les oligodendrocytes³. Plusieurs études récentes ont démontré que les microglies sont impliquées dans la plasticité neuronale pendant le développement de CNS et l’homéostasie adulte de tissu, et également dans l’état inflammatoire lié aux maladies neurodegenerative^4,,5. Dans le cas contraire, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique peut être compromise dans d’autres pathologies du SNC. Les réponses immunitaires, en particulier dans le cancer multiforme de glioblastome, ne sont pas soutenues seulement par des cellules de microglie que la barrière hémato-encéphalique est réorganisée par des processus angiogéniques et la présence des vaisseaux lymphatiques^6,7. Par conséquent, une grande infiltration de macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDM) se produit dans la tumeur de cerveau à travers les mécanismes d’angiogenèse tumeur-dépendante⁸. Les cellules cancéreuses exercent une influence significative sur les MMO infiltrés menant aux propriétés immunosuppressives et à la croissance de tumeur^9. Ainsi, la communication entre les cellules immunitaires et leur microenvironnement cérébral est difficile à comprendre car l’origine cellulaire et les signaux d’activation sont divers^10,11. Il est donc intéressant d’appréhender les fonctions des signatures moléculaires associées aux cellules immunitaires dans des conditions physiologiques. À cet égard, la communication cellulaire entre les cellules immunitaires et le microenvironnement cellulaire peut être étudiée par la libération de vésicules extracellulaires (VE).

Les véhicules électriques sont de plus en plus étudiés dans la régulation des fonctions immunitaires dans des conditions saines ainsi que pathologiques^12,13. Deux populations, exosomes et microvess, peuvent être prises en compte. Ils présentent différentes gammes de biogenèse et de taille. Les exosomes sont des vésicules de 30 à 150 nm de diamètre et sont générées à partir du système endosomal et sécrétées lors de la fusion des corps multivesculaires (MVBs) avec la membrane plasmatique. Les microsévères ont environ 100 à 1 000 nm de diamètre et sont générées par un bourgeonnement extérieur de la membrane plasmatique^{cellulaire 14}. Étant donné que la discrimination exosome versus microvesicle est encore difficile à réaliser selon la taille et les modèles moléculaires, nous n’utiliserons le terme DEV que dans le présent rapport. La communication associée à l’EV dans le SNC représente un mécanisme ancestral puisque des études ont montré leur implication dans des espèces d’invertébrés, y compris les nématodes, les insectes ou les annelides^15,16. En outre, les résultats montrant que les véhicules électriques peuvent communiquer avec des cellules de différentes espèces démontrent que ce mécanisme est un système de verrouillage des clés, basé d’abord sur la reconnaissance des molécules de surface entre les vésicules et les cellules de receveur, puis permettant l’absorption des médiateurs^16,17. En effet, les véhicules électriques contiennent de nombreuses molécules comme les protéines (par exemple, les enzymes, la transduction de signaux, le facteur de biogenèse), les lipides (p. ex. le céramide, le cholestérol) ou les acides nucléiques (p. ex., ADN, ARNm ou miARN) agissant comme régulateurs directs ou indirects des activités cellulaires^{bénéficiaires 14}. C’est pourquoi des études méthodologiques ont également été réalisées sur des cellules immunitaires pour isoler les véhicules électriques et caractériser pleinement leurs signatures protéiques^18,19.

Les premières études ont démontré la libération d’exosomes de la microglie de rat de culture primaire comme mécanisme inductible suivant une activation Wnt3a- ou sérotonine-dépendante^20,21. Fonctionnellement dans le SNC, les véhicules électriques dérivés de microglies régulent la libération de vésicule synaptique par des terminaux présynaptiques dans les neurones contribuant au contrôle de l’excitabilité neuronale^22,23. Les véhicules électriques dérivés de microglies pourraient également propager la réponse inflammatoire cytokines-négociée dans les grandes régions du cerveau^24,25. Fait important, les ligands divers pour la famille des récepteurs de péage-comme pourrait activer des productions spécifiques de véhicules électriques dans la microglie²⁶. Par exemple, des études in vitro montrent que les lignées cellulaires BV2 de microglie activées par LPS produisent un contenu EV différentiel comprenant des cytokines pro-inflammatoires²⁷. Par conséquent, la diversité fonctionnelle des sous-populations de cellules immunitaires dans le SNC, les microglies et les BMDM infiltrés, pourrait être évaluée par leurs propres populations de véhicules électriques, y compris l’impact des véhicules électriques sur les cellules bénéficiaires et l’identification du contenu des véhicules électriques.

Nous avons déjà décrit des méthodes pour évaluer les propriétés fonctionnelles des véhicules électriques dérivés des microglies et des BMDM après leur isolement^16,19. Dans le présent rapport, nous proposons d’évaluer indépendamment l’effet des véhicules électriques dérivés de microglies sur la excroissance neurite, et l’effet des véhicules électriques dérivés du macrophage sur le contrôle des agrégats de cellules de gliome. Cette étude propose également une vaste analyse protéomique des fractions EV afin de valider la procédure d’isolement des ev et d’identifier les signatures de protéines biologiquement actives. Les effets bénéfiques et le déchiffrement moléculaire du contenu EV pourraient aider leur manipulation possible et l’utilisation comme agents thérapeutiques dans les troubles du cerveau.

Protocole

1. Culture primaire des Microglies/Macrophages

1. Culture primaire de la microglie
   1. Microglie primaire de rat commercial de culture (2 x 10⁶ cellules) (voir la Table des Matériaux) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10% de sérum sans exosome, 100 U/mL de pénicilline, 100 'g/mL streptomycine, et 9,0 g/L de glucose à 37 'C et 5% de_CO2%.
   2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 48 h et procéder à l’isolement des véhicules électriques.
2. Culture primaire des macrophages
   1. Macrophages primaires de rat commercial de culture (1 x 10⁶ cellules) dans le milieu fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux) à 37 oC et 5% de CO₂, avec sérum exosome-libre.
   2. Recueillir le milieu conditionné après une culture de 24 h et procéder à l’isolement des véhicules électriques.

2. Isolement des véhicules électriques

1. Pré-isolement des véhicules électriques du milieu conditionné
   1. Transférer le milieu de culture conditionné des cultures de microglies ou de macrophage (étapes 1.1.2 ou 1.2.2) dans un tube conique.
   2. Centrifugeuse à 1200 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT) pour pelleter les cellules.
   3. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique. Centrifugeuse à 1200 x g pendant 20 min à RT pour éliminer les corps apoptotiques.
   4. Transférer le supernatant dans un tube en polycarbonate de 10,4 ml et transférer le tube dans un rotor Ti de 70,1. Ultracentrifuge à 100.000 x g pendant 90 min à 4 oC pour pelleter les véhicules électriques.
   5. Jetez le supernatant et réutilisez la granulé contenant des véhicules électriques dans 200 L de 0,20 m de tampon de phosphate filtré (PBS).
2. Isolement des véhicules électriques
   1. Préparation de la colonne d’exclusion de taille maison (SEC)
      1. Vider une colonne de chromatographie en verre (longueur : 26 cm; diamètre : 0,6 cm) (voir la Table des Matériaux),lavez-la et stérilisez-la.
      2. Placez un filtre de 60 m au bas de la colonne.
      3. Empilez la colonne avec la matrice de base de filtration de gel d’agarose liée à la croix pour créer une phase stationnaire d’un diamètre de 0,6 cm et d’une hauteur de 20 cm.
      4. Rincer la phase avec 50 ml de PBS filtré de 0,20 m. Conserver à 4 oC pour être utilisé plus tard si nécessaire.
   2. Placez le granule EV réutilisé au-dessus de la phase stationnaire de la colonne SEC.
   3. Recueillir 20 fractions séquentielles de 250 ll tout en continuant à ajouter 0,20 m PBS filtré sur le dessus de la phase stationnaire pour empêcher le séchage de la colonne. Conservez les fractions à -20 oC si nécessaire.
      REMARQUE: Un stockage plus long d’une semaine peut être effectué à -80 oC pour maintenir l’intégrité evs pour l’analyse moléculaire.
3. Analyse de spectrométrie de masse assistée par matrice au laser (MALDI) des fractions de la SEC
   1. Procéder à l’isolement EV tel que décrit à l’article 2.2.
   2. Réutilisez la granule EV avec 200 L de solution de mélange d’étalonnage de peptide (voir la Table des Matériaux).
   3. Procéder à la collecte ev comme décrit dans les sections 2.2.1 à 2.2.3.
   4. Sécher complètement la fraction avec un concentrateur à vide.
   5. Reconstituer les fractions avec 10 L d’acide trifluorocéacique (TFA) de 0,1 %.
   6. Mélanger 1 L de fraction reconstituée avec 1 L de matrice d’acide hydroxycinnamique (HCCA) sur une plaque cible en acier poli MALDI.
   7. Analyser toutes les fractions à l’égard d’un spectromètre de masse MALDI.
   8. Analyser les spectres générés avec un logiciel dédié (voir Tableau des matériaux).

3. Caractérisation des véhicules électriques

1. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
   REMARQUE : L’analyse NTA est effectuée avec un instrument d’analyse de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux)et une pompe à seringues automatisée.
   1. Faire une dilution (gamme de 1:50 à 1:500) de chaque fraction SEC de l’étape 2.2.3 avec 0.20 'm filtré PBS.
   2. Vortex la solution pour éliminer les agrégats EV.
   3. Mettez la solution diluée dans une seringue de 1 ml et placez-la dans la pompe automatisée de seringue.
   4. Ajuster le réglage de la caméra pour atteindre le niveau de gain (3) et le niveau de la caméra (13).
   5. Cliquez sur Run et lancez le script suivant.
      1. Chargez l’échantillon dans la chambre d’analyse (taux de perfusion : 1 000 pour 15 s).
      2. Diminuer et stabiliser le débit de vitesse pour l’enregistrement vidéo (taux de perfusion : 25 pour 15 s). Capturez trois vidéos consécutives de 60 s du flux de particules.
      3. Ajuster le niveau de la caméra (13) et le seuil de détection (3) avant l’analyse des vidéos. Cliquez sur Paramètres Ok pour commencer l’analyse et cliquez sur Export lorsque l’analyse est effectuée.
   6. Entre chaque analyse de fraction, laver avec 1 mL de PBS filtré de 0,20 m.
2. Analyse de la microscopie électronique (EM)
   1. Isoler les véhicules électriques tels que décrits à la section 2.
      REMARQUE: Les conditions stériles ne sont pas requises.
   2. Répétez la section 3.1 pour quantifier les véhicules électriques.
      REMARQUE: Seules des fractions positives seront utilisées pour l’analyse EM.
   3. Utilisez un filtre centrifuge de 50 kDa (voir tableau des matériaux)pour concentrer les fractions SEC contenant des EV.
   4. Résuspendent des véhicules électriques concentrés dans 30 L de 2% de paraformaldéhyde (PFA).
   5. Charger 10 L de l’échantillon sur une grille de cuivre recouverte de carbone.
   6. Incuber pendant 20 min dans un environnement humide.
   7. Répétez les étapes 3.2.5 et 3.2.6 pour une bonne absorption de l’échantillon sur la grille.
   8. Transférer la grille dans une baisse de 1% glutaraldéhyde dans PBS pendant 5 minutes à RT.
   9. Laver l’échantillon avec de l’eau ultrapure plusieurs fois.
   10. Comparez l’échantillon pendant 10 min sur la glace avec un mélange de 4 % d’acétate d’uranyl et de 2 % de méthylcellulose (1:9, v/v). Supprimer l’excès du mélange à l’aide d’un papier filtre.
   11. Séchez l’échantillon et observez-le sous un microscope électronique de transmission à 200 kV (voir la Table des Matériaux).
3. Analyse de tache occidentale
   1. Extraction de protéines
      1. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.3 pour isoler et concentrer les véhicules électriques.
      2. Mélanger 50 l de tampon RIPA (150 mM de chlorure de sodium [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N,N', acide tétraacetic [EGTA], 2 mM Ethylenediamine-tétraacetic acid [EDTA], 100 mM de fluorure de sodium [NaF], 10 mM de sodium pyrophosphate, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluorure [PMSF], 1x inhibiteur de protéase) avec l’échantillon EV (25 L résultant de la concentration DE EV sur le filtre) pour 5 min sur la glace pour extraire des protéines.
      3. Sonicate pour 5 s (amplitude: 500 W; fréquence: 20 kHz), 3 fois sur la glace.
      4. Enlever les débris vésiculaires par centrifugation à 20 000 x g pendant 10 min, à 4 oC.
      5. Recueillir le supernatant et mesurer la concentration de protéines avec la méthode d’analyse de protéines Bradford.
   2. Electrophoresis de gel de polyacrylamide de sulfate de dodéthyle de sodium (SDS-PAGE) et ballonnement occidental
      1. Mélanger les extraits de protéines (30 g) avec un tampon d’échantillon Laemmli de 5c (v/v).
      2. Chargez le mélange de protéines sur un gel polyacrylamide de 12 %.
      3. Migrer les protéines dans le gel avec tampon TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM glycine, et 0,1% SDS), à 70 V pour 15 min et 120 V pour 45 min.
      4. Transférer les protéines sur la membrane de nitrocellulose avec un système semi-sec à 230 V pendant 30 min.
      5. Saturate la membrane pour 1 h à RT avec tampon de blocage (0,05% Tween 20 w/v, 5% de lait en poudre w/v en 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incuber la membrane pendant la nuit à 4 oC avec la protéine anti-humaine monoclonale anti-choc 90 (HSP90) anticorps dilués dans le tampon de blocage (1:100).
      7. Laver la membrane trois fois avec PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) pour 15 min.
      8. Incuber la membrane pendant 1 h à RT avec le raifort de chèvre peroxidase-conjugué anticorps secondaires IgG dilué dans le tampon de blocage (1:10,000).
         REMARQUE: Un contrôle négatif est effectué à l’aide d’anticorps secondaires seul.
      9. Répétez l’étape de lavage (étape 3.3.2.7).
      10. Révéler la membrane avec une chimioluminescence améliorée (ECL) kit de substrat ballonnement occidental (voir Tableau des matériaux).
4. Analyse protéomique
   1. Extraction des protéines et digestion en gel
      1. Répétez les étapes 3.2.1 à 3.2.3 pour isoler et concentrer les véhicules électriques. Répéter l’étape 3.3.1 pour l’extraction de protéines EV.
      2. Effectuez la migration des protéines dans le gel d’empilement d’un gel polyacrylamide de 12 %.
      3. Fixer les protéines dans le gel avec le bleu coomassie pendant 20 min à RT.
      4. Accisez chaque morceau de gel coloré et coupez-le en petits morceaux de 1 mm³.
      5. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 ll de chaque solution : eau ultrapure pendant 15 min, 100% acetonitrile (ACN) pour 15 min, 100 m d’ammonium bicarbonate (NH₄HCO₃) pour 15 min, ACN:100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) pour 15 min, et 100% ACN pour 5 min en remuant continu.
      6. Sécher complètement les morceaux de gel avec le concentrateur sous vide.
      7. Effectuez une réduction des protéines avec 100 ll de 100 mM NH₄HCO₃ contenant 10 mM dithiothreitol pour 1 h à 56 oC.
      8. Effectuer l’alkylation des protéines avec 100 L de 100 mM NH₄HCO₃ contenant 50 mM iodoacetamide pendant 45 min dans l’obscurité à RT.
      9. Laver successivement les morceaux de gel avec 300 lL de chaque solution : 100 mM de NH₄HCO₃ pour 15 min, ACN:20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) pour 15 min, et 100% ACN pendant 5 min avec une agitation continue.
      10. Sécher complètement les morceaux de gel avec un concentrateur sous vide.
      11. Effectuez la digestion des protéines avec 50 L de trypsine (12,5 g/ml) en 20 mM NH₄HCO₃ pendant la nuit à 37 oC.
      12. Extraire les protéines digérées du gel avec 50 L de 100% ACN pendant 30 min à 37 oC, puis 15 min à RT en remuant continuellement.
      13. Répétez les procédures d’extraction suivantes deux fois : 50 L de TFA de 5 % dans la solution NH₄HCO₃ de 20 mM pour 20 min en remuant continuellement.
      14. Ajouter 100 L de 100% ACN pendant 10 min en remuant continuellement.
      15. Protéines digérées sèches avec un concentrateur sous vide et une résuspendance dans 20 L de 0,1% DT.
      16. Desalt l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de 10 L avec un support de phase inverse C18 pour désalting et concentrer les peptides (voir la Table des Matériaux) et elute peptides avec ACN:0.1% d’acide formique (FA) (80:20, v/v).
      17. Séchez complètement l’échantillon avec un concentrateur sous vide et résutilisez-le dans 20 L d’ACN:0,1% FA (2:98, v/v) pour la spectrométrie de masse tandem de chromatographie liquide (LC-MS/MS).
   2. Analyse LC-MS/MS
      1. Chargez le peptide digéré dans l’instrument LC-MS/MS et effectuez l’analyse de l’échantillon et des données selon les paramètres décrits en détail ailleurs⁴².
   3. Analyse des données brutes
      1. Traiter les données de spectrométrie de masse pour identifier les protéines et comparer les protéines identifiées de chaque échantillon avec un logiciel de protéomique quantitative à l’aide de paramètres standard.
      2. Export, en utilisant des paramètres standard, la liste des protéines exclusives et surreprésentées provenant d’échantillons positifs EV dans un logiciel prévoyant les réseaux protéiques et les processus biologiques.
      3. Comparez la liste des protéines identifiées dans les fractions avec les 100 principaux marqueurs EV de la base de données En libre accès Exocarta (voir le Tableau des matériaux).

4. Effets d’e-ve fonctionnels Assay

1. Essai de excroissance neurite sur la ligne de cellules PC-12
   1. Culture PC12 lignée cellulaire en moyenne DMEM complète (2 mM L-glutamine, 10% sérum de cheval fœtal (FHS), 5% sérum bovin fœtal (FBS), 100 UI/mL pénicilline, 100 g/mL streptomycine).
      REMARQUE: Les sérums sont exosome libre dans toute la procédure.
   2. Ajouter un verre de couverture (tous les puits) dans une assiette de 24 puits; enrober l’assiette de poly-D-lysine (0,1 mg/mL) et de graines 260 000 cellules/puits.
   3. Incuber les cellules à 37 oC sous 5% de CO₂.
   4. Après 24 h d’incubation, changez le milieu au milieu de différenciation DMEM (DMEM avec 2 mM L-glutamine, 0,1% FHS, 100 UI/mL penicillin, 100 g/mL streptomycine) avec 1 x 10⁶ microglia EV (à partir de l’étape 1.1.2).
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans microglie e-temps dans le milieu de différenciation.
   5. Au jour 4 après l’ensemencement, chargez tous les puits avec 100 L de milieu DMEM complet.
   6. Au jour 7 après l’ensemencement, fixez les cellules avec 4% de PFA pendant 20 min à RT et rincez trois fois (10 min chacune) avec PBS.
   7. Tacher les cellules avec de la phalloidine conjuguée à la rhodamine pendant 30 min à 4 oC et rincer 3 fois (10 min chacune) avec PBS.
   8. Tacher les cellules avec Hoechst dilué 33342 (1:10,000) pendant 30 min à RT et rincer 3 fois (10 min chacun) avec PBS.
   9. Monter le verre de couverture sur un toboggan avec le milieu de montage fluorescent (voir Tableau des matériaux).
   10. Analyser la diapositive à l’égard d’un microscope confocal, prendre 5 images aléatoires de chaque diapositive.
   11. Mesurer la excroissance neurite à l’aide d’un logiciel de quantification automatisé (longueur totale de neurite) tel que décrit en détail ailleurs⁴³.
2. Excroissance neurite sur les neurones primaires de rat
   1. Enrober une lame de verre de 8 puits de poly-D-lysine (0,1 mg/ml) et de stratifié (20 g/mL).
   2. Culture rat commercial neurones primaires dans le milieu de culture approprié (voir Tableau des matériaux) en placage 50.000 cellules par puits et incubation des cellules à 37 oC sous 5% CO₂ pour 48 h.
      REMARQUE: Les sérums sont exosome-libres dans toute la procédure.
   3. Ajouter 1 x 10⁶ microglies DE vitesses à la culture neuronale moyenne et incuber à 37 oC sous 5% de CO₂ pour 48 h de plus.
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans microglie EVs dans le milieu de la culture neuronale.
   4. Suivez les étapes 4.1.6 à 4.1.9 pour fixer et tacher les cellules.
   5. Suivez les étapes 4.1.10 et 4.1.11 pour analyser la diapositive.
3. Invasion de cellules Glioma
   1. Cellules de gliome de rat de C6 de réanimée dans le milieu complet de DMEM (DMEM avec 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1x antibiotiques) contenant 5% de collagène à une concentration finale de 8.000 cellules en 20 'L.
      REMARQUE: Les sérums sont exosome-libres dans toute la procédure.
   2. Placez 5 ml de PBS AU fond d’un plat de culture tissulaire de 60 mm. Inverser le couvercle et déposer des gouttes de 20 l (8 000 cellules) de suspension cellulaire sur le fond du couvercle.
   3. Inverser le couvercle sur la chambre inférieure remplie de PBS et incuber la plaque à 37 oC et 5% de CO₂ pour 72 h jusqu’à ce que des sphéroïdes cellulaires soient formés.
   4. Ajouter 1 x 10⁸ véhicules électriques macrophage (de l’étape 1.2.2) à un mélange de collagène de 2,2 mg/mL (2 ml de solution de type I de collagène bovin [3 mg/mL] avec 250 L de milieu essentiel minimum de 10x (MEM) et 500 L de 0,1 M d’oxyde de sodium).
      REMARQUE: L’état de contrôle est effectué sans véhicules électriques macrophage dans le mélange de collagène.
   5. Répartissez le mélange de collagène contenant des véhicules électriques dans une plaque de 24 puits pour intégrer les sphéroïdes cellulaires.
   6. Implanter les sphéroïdes cellulaires nouvellement formés au centre de chaque puits.
   7. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 oC et 5% de CO₂ pour solidifier le gel.
   8. Par la suite, superposer 400 L de support DMEM complet sur la matrice de collagène dans chaque puits.
   9. Incuber le système complet pour un total de 6 jours à 37 oC et 5% de CO₂.
      REMARQUE: L’invasion cellulaire hors du sphéroïde est surveillée par la photographie numérique à l’aide d’un microscope lumineux inversé à l’aide d’un objectif de 4x/0.10 N.A.
   10. Acquérir des images de chaque puits tous les jours.
   11. Traiter les images et quantifier l’invasion des zones sphéroïdes cellulaires à l’aide du logiciel décrit précédemment en détail⁴².
       REMARQUE: Les zones d’invasion et de sphéroïde ont été normalisées pour chaque jour aux zones d’invasion et de sphéroïde mesurées le jour 0.

Résultats

L’un des principaux défis à l’attribution des effets biologiques aux vésicules extracellulaires (VE) est la capacité d’isoler les véhicules électriques de l’ensemble du milieu de la culture. Dans ce rapport, nous présentons une méthode utilisant l’ultracentrifugation (UC) et la chromatographie de taille-exclusion (SEC) qui est couplée à l’analyse à grande échelle des signatures de protéine pour valider des marqueurs EV et identifier des composés bioactifs. Les véhicules électriques dérivés du macrophage ou des microglies...

Discussion

Le système nerveux central (SNC) est un tissu complexe dans lequel la communication cellule-cellule régule les fonctions neuronales normales nécessaires pour l’homéostasie³⁰. Les véhicules électriques sont maintenant largement étudiés et décrits comme des cargaisons moléculaires importantes pour la communication cellule-cellule³¹. Ils livrent spécifiquement un cocktail de médiateurs aux cellules de destinataire affectant ainsi leurs fonctions dans des conditions saines et p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 % Mini-PROTEAN  ; Gels protéiques préfabriqués TGX	Bio-rad	4561045EDU&	nbsp ;
Acétonitrile	Fisher Chemicals	A955-1	;
Filtre centrifuge Amicon 50 kDa	Merck	UFC505024	;
Bicarbonate d’ammonium	Sigma-Aldrich	9830	;
HSP90 &alpha ;/&beta ; (RRID : AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119	;
Supplément B27 Plus	Gibco	A3582801	;
BenchMixer V2 Mélangeur Vortex	Benchmark Scientific	BV1003	;
Concentré de réactif de colorant pour dosage de protéines Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006	;
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096	;
Cellule de gliome de rat C6	ATCC	ATCC CCL-107	;
Tubes canoniques	Sarstedt	62.554.002	;
Centrifugeuse	Eppendorf	5804000010	;
Incubateur CO2	ThermoFisher	;	;
Microscope confocal LSM880	Carl Zeiss	LSM880	;
Verre de protection	Marienfeld	111580	;
Plat de culture (60 mm)	Sarstedt	82.1473	;
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819	;
DMEM	Gibco	41966029	;
EASY-nLC 1000 Chromatographe en phase liquide	ThermoFisher	;	;
Microscope électronique JEM-2100	JEOL	²	;
Acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique	Sigma-Aldrich	03777-10G	;
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma-Aldrich	ED-100G	;
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	FBS appauvrie en exosomes
(100 principales protéines d’Evs)	;	;	http://www.exocarta.org/
Sérum fœtal bovin	Gibco	16140071	;
Sérum Fœtal Cheval	Biowest	S0960-500	;
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001	;
Fisherbrand  ; Sonicateur Q500 avec sonde	Fisherbrand	12893543	;
FlexAnalysis	Brucker	;	;
Support de montage à fluorescence	Agilent	S3023	;
Acide Formique	Sigma-Aldrich	695076	;
Grilles en cuivre revêtues de carbone Formvar	Agar scientific Ltd	AGS162-3	;
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769	;
Glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	340855	;
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT	;
Idoacétamide	Sigma-Aldrich	I1149	;
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L	;
Microscope à lumière inversée CKX53	Olympus		;
L-glutamine	Gibco	25030-024	;
LabTek II 8 puits&	nbsp ; Nunc	154534	;
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737	;
Laminin	Corning	354232	;
Logiciel MaxQuant (logiciel d’identification de protéines)		;	https://maxquant.net/maxquant/
MBT : Stell polonais	Brucker	8268711	;
MEM 10x	Gibco	21090-022	;
Méthylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385-100G	;
Eau MiliQ	Merck Millipore	;	;
Lait	Regilait	REGILAIT300	;
Mini PROTEAN Cellule d’électrophorèse verticale	Bio-Rad	1658000FC&	nbsp ;
MonoP FPLC colonne	GE Healthcare	;	N’est plus disponible
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	NS300	;
Logiciel NanoSight NTA v3.2	Malvern Panalytical	;	;
Pousse-seringue NanoSight	Malvern Panalytical	;	;
Gibco Neurobasal		21103-049	;
Membrane nitrocellulosique	GE Healthcare	10600007	;
Nonidet P-40	Fluka	56741	;
Nunc multi-parabole 24 puits	ThermoFisher	82.1473	;
Paraformaldéhyde	Electro microscopie Science	15713	;
Lignée cellulaire PC-12	ATCC	ATCC CRL-1721	;
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140-122	;
Mélange d’étalonnage des peptides	LaserBio Labs	C101	;
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003	;
Logiciel Perseus (Traitement des protéines identifiées)	;	;	https://maxquant.net/perseus/
Conjugué phalloïdine-tétraméthylrhodamine	Santa-cruz	sc-362065	;
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Sigma-Aldrich	78830	;
Tampon phosphate Saline	Invitrogen	14190094	sans calcium, sans magnésium
pluriStrainer M/ 60 µ ; m	pluriSelect	43-50060	;
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	;
Tubes à centrifuger en polycarbonate	Beckman Coulter	355651	;
Inhibiteur de protéase	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB	;
Systèmes de cellules	PureCol	5005	;
Spectromètre de masse Q-Exactive	ThermoFisher	;	;
spectromètre de masse rapifleX	Brucker	;	;
Neurones corticaux de rat	Applications cellulaires	R882N-20	Origine cellulaire : Dérivé des cortex cérébraux du jour 18 embryonnaire Sprague Dawley cerveaux de rat
Rat Macrophage & Culture de microglie Cellules moyennes	Applications	R620K-100	Origine cellulaire : Moelle osseuse de rat normale et saine
Macrophages primaires de rat	Applications cellulaires	R8818-10a	;
Microglie primaire du rat	Lonza	RG535	;
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Trypsine modifiée de qualité séquençage	Promega	V5111	° ;
Slide	Dustsher	100204	;
Chlorure de sodium	Scharlau	SO0227	;
Dodécylsulfate de sodium	Sigma-Aldrich	L3771	;
Fluorure de sodium	Sigma-Aldrich	S7920-100G	;
Hydroxyde de sodium	Scharlab	SO0420005P	;
Pyrophosphate	de sodium Sigma-Aldrich	S6422-100G	;
Concentrateur sous vide SpeedVac	ThermoFisher		;
Logiciel de chaîne (réseaux d’association de protéines fonctionnelles)	;	;	https://string-db.org/
Substrat SuperSignal West Dura à durée prolongée	ThermoFisher	34075	;
Seringue 1,0 mL	Terumo	8SS01H1	;
Cellule de transfert semi-sèche Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940	;
Acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	T6508	;
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glycine	Euromedex	EU0550	;
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	;
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	A95765	;
Rotor d’ultracentrifugeuse 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184	;
Acétate d’uranyle	Agar Scientific Ltd	AGR1260A	;
Papier filtre Whatman	Sigma-Aldrich	WHA10347510	;
&alpha ;-Acide cyano-4-hydroxycinnamique	Sigma-Aldrich	C2020-25G	;