L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.
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Article de méthode
Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Définir le modèle idéal pour une étude in vitro est essentiel, principalement si l'étude des processus physiologiques tels que la différenciation des cellules. Dans le stroma tumoral, les fibroblastes hôtes sont stimulés par les cellules cancéreuses pour se différencier. Ainsi, ils acquièrent un phénotype qui contribue au microenvironnement tumoral et soutient la progression tumorale. En utilisant le modèle sphéroïde, nous avons mis en place un tel système de modèle in vitro 3D, dans lequel nous avons analysé le rôle de la laminin-332 et son récepteur integrin 3-1 dans ce processus de différenciation. Ce système de modèle sphéroïde reproduit non seulement les conditions de microenvironnement de tumeur d'une manière plus précise, mais est également un modèle très polyvalent puisqu'il permet différentes études en aval, telles que la coloration immunofluorescente de l'intra- et de l'extracellulaire marqueurs, ainsi que les protéines de matrice extracellulaire déposées. En outre, les analyses transcriptionnelles par qPCR, la cytométrie de flux et l'invasion cellulaire peuvent être étudiées avec ce modèle. Ici, nous décrivons un protocole d'un modèle sphéroïde pour évaluer le rôle de l'integrin de CAFs '3'1 et son ligand ectopique déposé, laminin-332, dans la différenciation et en soutenant l'invasion des cellules cancéreuses pancréatiques.
Introduction
Le microenvironnement tumoral est une niche très complexe et extrêmement importante pour le maintien et la progression des cellules tumorales1. Il est formé non seulement par les cellules cancéreuses, mais aussi par les fibroblastes stromaux. Les cellules tumorales sont entourées d'un stroma qui est spécifique et différent du stroma des tissus normaux2. Lalaminin-332 est une protéine de matrice extracellulaire ectopiquement exprimée dans le stroma de différentes tumeurs, telles que de l'adénocarcinome pancréatique3. En outre, la composition biochimique de l'ECM et aussi ses propriétés biophysiques....
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Protocole
1. Les sphéroïdes 3D comme modèle in vitro pour la différenciation fibroblaste/CAF à l'aide de différents composés inhibiteurs du TGF-1
- Mélanger 1 partie de la solution de méthylcellulose de 6 mg/mL et 3 parties du support de culture cellulaire, MEM complétée avec 1% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine pour obtenir la solution de formation sphéroïde.
- Resuspendre les fibroblastes normaux immortalisés fraîchement décongelés (iNF), les CAF immortalisés (iCAFs) ou l'intégrine de l'iCAF KO 3-1 (passage jusqu'à 25) dans la solution de formation sphéroïde. Si vous préparez une plaque de puits de 96, prépa....
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Résultats
Les résultats de cette conception expérimentale sont publiés dans Martins Cavaco et al.13, qui est recommandé pour une lecture plus approfondie des conclusions qui ont été tirées de ces expériences.
Figure 1, image représentative d'un sphéroïde immunofluorescent, montre l'immunostaining de la sous-unité integrin no 3 des fibroblastes normaux immortalisés et des CAF immortalis.......
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Discussion
Développer un modèle in vitro approprié pour étudier la différenciation des FAC est une tâche difficile. Après avoir utilisé différentes approches, nous avons conclu qu'un modèle sphéroïde 3D est le modèle le plus pratique, physiologique et cliniquement pertinent, dans lequel l'interaction entre les cellules du carcinome pancréatique avec des CAF immortalisés peut être étudiée. Ce modèle a empêché la différenciation spontanée des fibroblastes, due aux facteurs de stress artéfactuels tels que la rigidité du plastique de c.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts. Ce matériel ne reflète que les vues de l'auteur et l'Union européenne n'est pas responsable de toute utilisation qui peut être faite des informations qui y sont contenues.
Remerciements
Nous reconnaissons l'aide de Barbara Schedding dans la préparation du BM2 et du lebein-1. Nous remercions Àgnes Noel d'avoir partagé son expertise dans les essais sphéroïdes. Nous remercions Sonja Schelhaas et Michael Schàfers pour leur aide dans la gestion de la transfection lentivirale dans des conditions S2. Nous reconnaissons l'insistance de Sabine von Ràden dans la préparation des CAF à partir de tissus cancéreux pancréatiques.
La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Programme des personnes (Actions Marie Curie) du septième programme-cadre de l'Union européenne, le 7e PC/2007-2013/ dans le cadre de l'accord de subv....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminine &bêta ; 3 sous-unité Souris (monoclonale) | Maison | ||
| A3IIF5 Anti-&alpha ; 3 sous-unité d’intégrine Souris (monoclonale) | Aimablement fourni par Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acétone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumine Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Chèvre (polyclonale) anti-souris | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Chèvre (polyclonale) Lapin | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminine &gamma ; 2 sous-unité Souris (monoclonale) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Lapin (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-&alpha ;-SMA-Cy3 Souris (monoclonale) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Aimablement donné par le prof. Jorg Haier | |
| Lab Bench | centrifuge Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminine & alpha ; 3 sous-unité Souris (monoclonale) | Aimablement fourni par le Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifugeuse | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Tubes à centrifuger 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagénase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagène-I, queue de rat | Gibco | A10483-01 | |
| Microscope confocal | Zeiss | LSM 700 et 800 | |
| DMEM (High glucose 4,5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Matrice gélifiante | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Chèvre IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Sérum de cheval | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Fibroblastes pancréatiques primaires humains | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubateur | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplaque, 96 puits, fond en U | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Lames de microscope | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Souris IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Mélangeur rotatif multi-axes | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Aimablement offert par Prof. Jorg Le laboratoire de Haier | |
| : le paraformaldéhyde | Riedel-de Haëuml ; n | 16005 | |
| Pénicilline/streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Kit de transcription inverse | Qiagen | 205310 | |
| IgG de rat, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Tubes de réaction, 1,5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Cycleur de PCR en temps réel | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Ajouter du glucose à 4,5 g (filtre de 0,2 μm) et du pyruvate de sodium à 1 % |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vó ; rtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| &mu ;-Slide Angiogenesis, non revêtu | Ibidi | 81501 |
Références
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High inters....
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Réimpressions et autorisations
