Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

Résumé

Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.

Résumé

L’une des principales modalités de diagnostic de la rage est la détection du complexe viral de ribonucléoprotéines (RNP) (antigène) dans les échantillons de tissus infectés. Bien que le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) ou le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) soient le plus souvent utilisés pour la détection de l’antigène, les deux tests nécessitent des tissus frais et / ou congelés pour les empreintes sur les lames avant la détection de l’antigène à l’aide d’anticorps. Si les échantillons sont prélevés et fixés dans du for formel, aucun des deux tests n’est optimal pour la détection de l’antigène, cependant, les tests peuvent être effectués par immunohistochimie conventionnelle (IHC) après intégration dans des blocs de paraffine et sectionnement. Avec cette méthode IHC, les tissus sont colorés avec des anticorps antirabiques, les sections sont déparaffinisées, l’antigène récupéré par protéolyse partielle ou d’autres méthodes, et incubé avec des anticorps primaires et secondaires. Les antigènes sont colorés à l’aide de peroxydase de raifort / carbazole d’éthyle aminé et contre-colorés avec de l’hématoxyline pour la visualisation à l’aide d’un microscope optique. En plus de la détection spécifique de l’antigène, la fixation du formoin offre d’autres avantages tels que la détermination des changements histologiques, des conditions détendues pour le stockage et le transport des échantillons (à température ambiante), la possibilité de tester des cas rétrospectifs et l’amélioration de la sécurité biologique grâce à l’inactivation d’agents infectieux.

Introduction

La rage est une encéphalite progressive aiguë causée par les virus à ARN à sens négatif appartenant au genre lyssavirus¹. Près de 99% de tous les décès humains causés par l’infection par le virus de la rage (RABV), le type membre du genre, sont transmis par les chiens². Le diagnostic de la rage chez les animaux suspects repose sur la détection d’antigènes (principalement des nucléoprotéines codées virales, protéine N) en complexe avec de l’ARN génomique (complexe ribonucléoprotéique, RNP) dans le tissu cérébral³. La détection de l’antigène par le test d’anticorps fluorescents directs (DFA) est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic de la rage⁴. La méthode utilise du matériel cérébral congelé frais ou frais, une empreinte tactile sur une lame, une fixation dans l’acétone, une coloration à l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux marqués à l’isothiocyanate fluorescent (FITC) disponibles dans le commerce (mAbs / pAbs) et lus par la microscopie à fluorescence⁵. Le test DFA est rapide, sensible et spécifique à la détection de l’antigène de la rage dans les tissus cérébraux frais. Récemment, il a été démontré qu’un test immunohistochimique rapide direct (DRIT), une technique d’immunohistochimie modifiée (IHC), présentait une sensibilité similaire à celle du DFA, mais offre l’avantage de la microscopie optique pour la visualisation^6. Bien que la méthode de détection utilisée dans le DRIT soit similaire à l’IHC, l’étape initiale utilise des tissus frais ou congelés pour générer des empreintes tactiles de l’échantillon, suivies d’une fixation dans du formain.

L’IHC est une technique largement utilisée pour déterminer les changements histologiques et la détection des protéines à l’aide d’anticorps spécifiques dans des tissus fixés au for formel incorporés dans des blocs de paraffine. L’IHC est un test alternatif établi pour la détection de l’antigène de la rage dans les coupes tissulaires⁷. L’IHC a été particulièrement utilisé pour le diagnostic des cas rétrospectifs présentant des maladies neurologiques afin de déterminer le fardeau de la rage⁸. Les tissus fixés au for formel incorporés dans la paraffine préservent les protéines pour la détection même après plusieurs années lorsqu’ils sont stockés à température ambiante⁹. Le traitement au forme modifie les protéines en réticulant et en modifiant les chaînes latérales des acides aminés, ce qui pourrait rendre les épitopes non réactifs contre les anticorps¹⁰. Alors que le test IHC pour la détection de l’antigène de la rage implique soit mAbs, soit pAbs, ce dernier est avantageux car plusieurs épitopes et lyssavirus divergents peuvent être détectés¹¹.

Les étapes standard impliquées dans l’IHC sont la fixation des tissus par forgé, l’incorporation dans des blocs de paraffine, la section des tissus, la déparaffinisation et l’hydratation, la récupération de l’épitope, la réactivité contre les anticorps primaires et secondaires et le développement à l’aide de substrats chromogènes. Ce manuscrit décrit un compte rendu détaillé du protocole de diagnostic de la rage. Pour la détection de l’antigène de la rage, le sérum de souris immunisé avec le RABV (pAbs) généré aux Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis à Atlanta, en Géorgie, en combinaison avec des anticorps secondaires biotinylés anti-souris est utilisé. Les abdominaux biotinylés sont détectés par l’ajout du complexe streptavidine-peroxydase de raifort (HRP) suivi du développement de la couleur avec un substrat d’amino-éthylcarbazole.

Protocole

Bien que le protocole IHC ait été effectué sur des tissus fixés au for formel, qui inactivent le RABV s’il est présent, les protocoles de biosécurité appropriés doivent être correctement suivis. Toutes les procédures de biosécurité sont décrites dans la 5e édition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) de La biosécurité dans les laboratoires microbiologiques et biomédicaux (BMBL), y compris le port d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et l’exigence de vaccination telle que décrite¹². De plus, il faut bien contenir et manipuler les produits chimiques dangereux (comme le forme, la CEA et le xylène)(p. ex., les hottes).

1. Fixation des tissus au for formel

1. Placer les tissus cérébraux de 3 à 5 mm prélevés après l’autopsie¹³ dans une solution de formoin tamponnée à 10 % de phosphate (rapport tissu/formoline de 1:20 à 1:50) pendant 24 à 72 h.
   ATTENTION : Le for formel est un fixateur toxique.
2. Notez le poids approximatif des tissus (taille), le type de tissu (zones du cerveau) et le volume de for forme. Il est important que les laboratoires documentent et tiennent des registres sur les temps de fixation.
3. Pour un stockage plus long des tissus après la fixation du forgé et avant le traitement, placez le tissu dans de l’éthanol à 70%.

2. Traitement des tissus

1. Après la fixation de l’échantillon, disséquez le tissu pour inclure les zones importantes du cerveau, par exemple les coupes transversales du tronc cérébral, du cervelet (3 lobes) ou de l’hippocampe (les deux hippocampes), chacun coupé de 3 à 5 mm d’épaisseur et placé dans des cassettes de traitement.
2. Traiter les cassettes tissulaires pour l’infiltration de cire de paraffine, incorporées dans des blocs de paraffine et sectionnés (3 à 6 μm) sur un microtome.

3. Préparation des matériaux / Plats de coloration

1. Installez le plat de coloration¹⁴ (Tableau des matériaux) comme illustré à la figure 1. Remplir chaque plat avec 250 mL de la solution.
2. Préparation de la solution stock de substrat de 3-Amino-9-éthylcarbizole (AEC)
   1. Dissoudre un comprimé de 20 mg de 3-amino 9-éthylcarbazole (AEC) dans 5 mL de N,N, diméthylformamide à l’aide d’une pipette en verre.
      ATTENTION : L’AEC est cancérigène.
3. Préparation de la solution souche de protéase (p. ex. Pronase) pour la récupération de l’antigène
   1. Dissoudre 7 mg de protéase dans 200 mL de PBS.
4. Préparation du tampon de rinçage PBS-T
   1. Ajouter 10 mL de Tween 80 à 990 mL de PBS. Mélangez bien pour former une solution homogène.

4. Déparaffinisation et réhydratation des tissus

1. Faire une section de paraffine de 5 μm à l’aide d’un microtome, la faire flotter au bain-marie à 38 °C et la recueillir sur des lames de verre. Étiquetez les diapositives avec un stylo/marqueur résistant aux réactifs.
2. Placer les lames sur un plateau et les faire fondre dans un four à 55-60 °C pendant 1 h. N’élevez pas la température au-dessus de 60 °C car cela pourrait détruire l’antigène viral.
3. Retirer les lames du four et déparaffiner immédiatement en 3 rinçages consécutifs au xylène de 5 min chacun dans les plats 1, 2 et 3.
4. Réhydraté les sections sur la lame par immersions séquentielles dans une dilution décroissante de l’éthanol dans de l’eau désionisée: (4 à 11 est un rinçage par immersion) plat 4: xylène / éthanol à 100% (1: 1); plat 5: 100% éthanol; plat 6: 100% éthanol; plat 7: éthanol à 95%; plat 8: éthanol à 95%; plat 9: éthanol à 80%; plat 10: 70% d’éthanol; plat 11 : eau désionisée (Figure 1. Mise en place du plat).
   ATTENTION : Le xylène est un produit chimique dangereux et le travail doit être effectué dans une hotte aspirante.

5. Récupération de l’antigène protéolytique

1. Traiter les lames avec la protéase (2,5 μg/mL de PBS) pendant 30 min pour la récupération de l’antigène protéolytique dans la boîte 12.
2. Rincer ensuite dans PBS-T pendant 10 min (plat 13).
3. Traiter avec 3% de peroxyde d’hydrogène pendant 10 min (plat 14).
4. Encore une fois, laver avec PBS-T pendant 10 min (plat 15).

6. Procédure de coloration

1. Manipulez les diapositives une à la fois en gardant les diapositives restantes immergées dans le tampon (ne retirez pas tout le support de diapositive - gardez les diapositives humides). Retirez une lame et épongez l’excès de tampon (à l’aide d’une serviette en papier) autour de la section de tissu en prenant soin de ne pas déranger la section de tissu. Incuber des lames dans une chambre d’humidité, faite en plaçant des serviettes en papier humidifiées, sur le banc de laboratoire¹⁴ à température ambiante avec du sérum de chèvre normal (blocage) pendant 15 min.
2. Incuber avec l’anticorps antirabique primaire à dilution prédéterminée optimale (dilution 1:250 du sérum antirabique de souris, non publié) (contrôle positif) et anticorps témoins négatifs à température ambiante identique à celle ci-dessus (étape 6.1.) pendant 60 min sans lavage entre les deux.
3. Après 60 min, laver avec du PBS-T pendant 10 min (plat 16).
4. Incuber avec l’anticorps biotinylé (spécifique à l’espèce) dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 15 min (manipulation identique à l’étape 6.1.).
5. Laver avec PBS-T pendant 10 min (plat 16).
6. Incuber avec le complexe Streptavidin-HRP dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 15 min (manipulation identique à 6.1.).
7. Laver avec PBS-T pendant 10 min (plat 16).
8. Incuber avec un substrat de peroxydase, l’amino-éthylcarbazole (AEC), dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 10 min. Faites AEC juste avant l’utilisation. Pour ce faire, ajouter 1 mL de solution mère AEC à 14 mL de tampon d’acétate de 0,1 M, pH 5,2. Ajouter 0,15 mL de 3%_H2O₂. Filtrer le mélange juste avant utilisation (filtre de 0,45 μm).
   REMARQUE: La solution de travail de l’AEC n’est stable que pendant 2-3 h. La solution d’AEC peut être conservée au réfrigérateur pendant de plus longues périodes.
9. Laver à l’eau désionisée 10 min (plat 17)
10. Contre-teinté avec de l’hématoxyline de Gill diluée 1:2 avec de l’eau désionisée pendant 2 min (plat 18).
11. Rincer l’excès d’hématoxyline avec un rinçage à l’eau désionisée (plat 19 et 20).
12. Rincer dans l’eau du robinet Scott’s 30 s (solution de bleuissement) plat 21.
13. Laver à l’eau désionisée 10 min (plat 22)
14. Retirez les glissières une à la fois - montez avec un support de montage soluble dans l’eau.
15. Lire des diapositives sur un microscope optique.

Résultats

La figure 2 montre les résultats représentatifs de coloration IHC d’échantillons témoins positifs et négatifs dans différents tissus cérébraux testés. La figure 2A, D, G représente des échantillons positifs à 200x, tandis que la figure 2B, E, H correspond à un grossissement de 400x, respectivement. Figure 2A-C correspond...

Discussion

En raison du taux élevé de mortalité de la rage après l’apparition des symptômes, le diagnostic d’animaux suspects d’infection par le RABV est extrêmement critique pour un traitement prophylactique post-exposition approprié. Le diagnostic de la rage dépend principalement des techniques basées sur le DFA, le DRIT et la PCR utilisant des tissus frais ou congelés. Pour tester les tissus fixés au for formel, le test IHC fournit une méthode alternative pour la détection sensible et spécifique de l’antigène RABV. Alors que les...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3 % peroxyde d’hydrogène	Marques Pharamacy Sur		étagère 3 % H2O2
3-Amino-9-éthylcarbazole (AEC)	Millipore Sigma	A6926
Tampon d’acétate pH 5.2	Poly Scientific R& D Corp.	s140
Formol tamponné 10 % phosphate Tamponné	Fisher Scientific	SF100-4
Certifié Bordereaux de protection Corning	Fisher Scientific	12-553-471	24 X 50 mm
Éthanol 190 Proof	Pharmco-AAPER	111000190
Éthanol 200 Proof	Pharmco-AAPER	111000200
Gill’s hematoxylin formulation #2	Fisher Scientific	CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit	seracare	71-00-18	Anticorps primaire de souris  ;
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	Média de montage
N,N, Diméthyl formamide GR	Fisher Scientific	D119
Phosphate Tamponné Saline  ;	HyClone	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objectif	fournisseurs
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objectif	Plusieurs fournisseurs
Pronase	Millipore Sigma	53702	Protéase, Streptomyces griseus
Scott’s Tap Water  ;	Poly Scientific R& D Corp.	s1887
Tissue-Tek Set de coloration pour lames	Fisher Scientific	50-294-72
TWEEN-80  ;	Millipore Sigma	P1754
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Histological
Grade Zeiss Axioplan 2 imagerie - microscope	fournisseurs