Article de méthode

Génération d'axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants par le biais de greffeembryonnaire

DOI :

10.3791/60156

⸱

29 janvier 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet objectif de ce protocole est de produire des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes dérivés du tissu donneur cas9-mutagérisé utilisant des techniques embryonnaires de greffe de tissu.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un ensemble croissant de techniques et de ressources génétiques permet aux chercheurs de sonder les origines moléculaires de la capacité de certaines espèces de salamandres, comme les axolotls, à régénérer des membres entiers à l'âge adulte. Ici, nous dénoncons les techniques utilisées pour générer des axolotls chimériques avec des membres antérieurs héloïdes mutagérisés Cas9 qui peuvent être utilisés pour explorer la fonction génique et la fidélité de la régénération des membres. Nous combinons plusieurs techniques embryologiques et génétiques, y compris la génération d'haploïdes par l'activation in vitro, la mutagénèse DE CRISPR/Cas9, et la greffe de tissu dans un protocole pour produire un système unique pour le criblage génétique d'haploid dans un organisme modèle de régénération. Cette stratégie réduit le nombre d'animaux, l'espace et le temps requis pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans la régénération des membres. Ceci permet également l'étude des fonctions spécifiques de régénération des gènes qui peuvent être exigées pour d'autres processus essentiels, tels que l'organogenèse, la morphogenèse de tissu, et d'autres processus embryonnaires essentiels. La méthode décrite ici est une plate-forme unique pour effectuer le dépistage génétique des haploïdes dans un système de modèle vertébré.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historiquement, la greffe de tissu embryonnaire chez les amphibiens a été une technique importante pour explorer les mécanismes fondamentaux de la biologie du développement et de la régénération. L'axolotl, une espèce de salamandre, possède une capacité impressionnante à régénérer les tissus et les structures complexes telles que les membres et les organes après une blessure ou une amputation. De même, ils peuvent recevoir, sans rejet, des greffes de tissus d'autres individus aux stades embryonnaires, juvéniles et adultes1,2,3. Les régions d'embryons qui produisent des structures entières telles que les membres, la queue, les yeux et les têtes, et des tissus plus spécifiques, tels que le neuroectoderm et les somites, peuvent être greffés entre les embryons pour produire des animaux chimériques1,2,4,5,6. Pendant près d'un siècle, les études de ces animaux chimériques ont fourni des aperçus cruciaux dans la régénération, la différenciation de tissu, le contrôle de taille, et le modelage1,7,8.

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études transcriptionnelles sur les tissus régénérants ont permis de mieux comprendre les programmes génétiques sous-jacents à la régénération de la salamandre9,10,11,12,13. Ces études ont ajouté à une liste croissante de gènes candidats qui, à ce jour, sont en grande partie non caractérisés dans le contexte de la régénération. Les techniques ciblées de mutagénèse, telles que CRISPR/Cas, permettent maintenant l'étude de tels gènes, et de telles approches génétiques sont grandement facilitées par le séquençage et l'assemblage récents du grand génome d'axolotl14,15,16.

Nous avons cherché à développer des techniques qui associait la biologie du développement classique à une nouvelle technologie génétique dans le but de disséquer les mécanismes de régénération. Des méthodes pour produire des embryons d'axolotls et d'autres salamandres sont établies depuis des décennies17. Bien que ces techniques aient longtemps été considérées comme des avantages des salamandres en tant qu'organismes modèles génétiques18, peu d'études génétiques ultérieures ont incorporé des animaux haploïdes. Nous utilisons l'activation in vitro dans l'axolotl pour produire des embryons haploïdes qui servent de donneurs de tissus pour la greffe19. À l'aide d'embryons porteurs de marqueurs génétiques fluorescents, nous avons mis au point des méthodes fiables pour générer des membres provenant presque entièrement de tissus donneurs (figure 1A). En combinant ces deux techniques, nous avons contourné la létalité embryonnaire tardive associée à l'héloïdie, permettant la production de membres haploïdes entièrement développés et greffés(figure 1B, Figure 1B', et Figure 2).

En menant la mutagénèse CRISPR/Cas-négociée dans les embryons haploïdes avant la greffe pour créer des axolotls chimériques avec des membres haploïdes mutants, nous pouvons étudier la fonction de gène spécifiquement dans le contexte du développement et de la régénération de membre. Cela permet de sauver les membres de phénotypes mutants potentiellement embryonnaires-létaux. Tandis que la microinjection de CRISPR/Cas peut produire des animaux qui sont fortement mutants, de tels animaux sont typiquement fortement mosaïque, avec un certain degré de conservation des alloues sauvages de type et une série de mutations distinctes aux emplacements visés14,20. La mutagénèse basée sur CRISPR dans les cellules haploïdes augmente la pénétration des mutations de perte de fonction d'allèle simple, car elles ne peuvent pas être masquées par les allèles de type sauvage retenus. Pour cette raison, le dépistage à base de CRISPR dans les lignées de cellules haploïdes est de plus en plus utilisé pour étudier la base génétique de nombreux processus cellulaires21,22,23. En combinant la lignée à base de CRISPR traçant avec nos protocoles de greffe de bourgeons de membres haploïdes, l'approche décrite ici peut servir de plate-forme pour les écrans génétiques haploïdes chez les animaux vivants20.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les procédures expérimentales utilisées dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Yale (IACUC, 2017-10557) et étaient conformes à toutes les politiques et lignes directrices fédérales régissant l'utilisation des animaux vertébrés. Toutes les expériences animales ont été menées sur Ambystoma mexicanum (axolotls) dans des installations de l'Université Yale.

1. Génération d'embryons diploïdes

  1. Obtenir des embryons diploïdes GFPMD pour servir d'hôtes de greffe par l'accouplement naturel en utilisant un ou deux parents gfp 24.
  2. Recueillir les œufs diploïdes fraîchement pondus et les placer dans un tamis en métal.
  3. Rincer soigneusement les œufs avec la solution de 40% Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH à 7,4).
  4. Placer les œufs dans la solution de Holtfreter frais à 40 % et les conserver à 12 oC.
    REMARQUE : Les embryons diploïdes doivent toujours être obtenus avant de passer à la génération d'embryons haploïdes.

2. Génération d'embryons haploides

  1. Préparation féminine de donneur de gamètes
    1. 48 h avant de procéder à l'activation in vitro, anesthésier un axolotl femelle blanc ou blanc/RFP sexuellement mature par immersion dans 1 g/L DEPHE-tamponné MS-222 dans la solution de 40% Holtfreter25.
    2. Assurez-vous que l'animal est entièrement anesthésié après environ 30 min d'immersion en pinçant fermement sa queue entre le pouce et l'index. Les animaux entièrement anesthésiés ne répondront pas physiquement à une pincée.
    3. Préparer une solution de gonadotropine chorionique humaine (HCG) contenant 10 000 U/mL en saline stérile.
    4. À l'aide d'une seringue à insuline de 30 G, injectez 0,15 CC de HCG (1 500 unités) dans la dorsale de la musculature au membre postérieur de la femelle anesthésié à un angle de 45 degrés par rapport à la ligne médiane afin d'éviter tout contact avec la moelle épinière.
    5. Remettre la femelle dans la solution de Holtfreter fraîche de 40 % et la placer dans un réfrigérateur de 8 à 12 oC.
    6. Après 48 h, remettre la femelle à température ambiante. Placez quelques pierres ou des plantes en plastique dans son récipient comme surfaces pour la ponte.
      REMARQUE : Les femelles injectées avec HCG déposent souvent des caisses vides de gelée pendant plusieurs heures avant de pondre des oeufs.
    7. Enlever les pierres ou les plantes en plastique après que la femelle a commencé à pondre régulièrement des œufs.
    8. Laisser la femelle s'asseoir dans le réservoir vide de 30 min à 1 h.
      REMARQUE : Le fait de retenir les matériaux sur lequel l'animal peut pondre permettra un contrôle plus serré de la collecte des ovocytes.
  2. Collection de gamètes masculins
    1. Pendant que la ponte de la femelle est au point mort, anesthésiez un axolotl mâle GFPMD sexuellement mature pour servir de donneur de sperme, comme à l'étape 2.1.1.
    2. Placez le mâle entièrement anesthésié sur son dos sur des serviettes en papier humide sous un microscope à disséquer.
    3. Si l'expérimentateur est droitier, placez la pointe d'une pipette P1000 à la base du cloaque avec la main droite.
    4. Placer l'index gauche et le pouce de la main gauche de 2 à 3 cm de rostral au bassin. Presser doucement l'animal tout en déplaçant les doigts vers les pattes postérieures pour rincer les échantillons d'urine spermique.
    5. Recueillir chacun qui est évacué du cloaque dans un tube de microcentrifuge individuel. Répétez ce processus pour prélever 6 à 10 échantillons.
    6. Pipette 5.0 L de chaque échantillon sur un plat de Pétri pour inspecter la qualité du sperme à l'aide d'un microscope inversé.
      REMARQUE : Les échantillons concentrés de sperme sont d'une couleur blanche laiteuse, vont généralement de 5 à 20 L, et sont habituellement récupérés après que plusieurs échantillons d'urine spermique de volume plus élevé soient extraits. Le sperme s'accumule au fond des tubes dans des échantillons à volume plus élevé lorsqu'il n'est pas perturbé. Les échantillons concentrés de spermatozoïdes sains sont très motiles et perdent de l'activité à mesure que leur concentration diminue. Les mâles en bonne santé peuvent produire jusqu'à 50 l de sperme concentré.
  3. Collection de gamètes féminins
    1. Après avoir obtenu et confirmé un échantillon sain de sperme, anesthésier l'axolotl femelle HCG-injecté comme à l'étape 2.1.1.
    2. Placez la femelle entièrement anesthésiée sur des essuie-tout humides sur son dos.
    3. Extraire les œufs non fécondés de la femelle à l'aide d'un mouvement de la main semblable à celui de l'étape 2.2.4.
    4. Recueillir les œufs à l'aide de forceps humides et les transférer dans un plat de pétri de 10 cm. Traiter les œufs avec du sperme irradié dans les 15 minutes de la collecte.
  4. Préparation des gamètes masculins et activation in vitro
    1. Utilisez une pipette P10 ou P20 pour pipette le sperme de haut en bas, décomposant les amas pour former une suspension homogène.
    2. Approximer le pourcentage de spermatozoïdes motiles en plaçant une goutte de 0,5 l de suspension de sperme non diluée sur un couvercle de boîte de Pétri ou une glissière en verre et en examinant avec un microscope inversé.
    3. Ajouter 9,5 L de la solution Ringer modifiée de 0,1x Marc (MMR; Tableau des matériaux) à cet échantillon pour faire une dilution de sperme 20x. Doucement pipette de haut en bas pour mélanger.
    4. Avec un microscope inversé, comptez le sperme dans trois gouttes de 1,0 L de l'aliquot dilué 20x sur une couverture de boîte de Pétri ou un hémocytomètre pour estimer la concentration de sperme de la suspension non diluée.
    5. Préparer le sperme pour l'irradiation en diluant un aliquot de l'échantillon original de sperme à environ 80.000 cellules motiles/mL dans le ROR stérile de 0.1x.
    6. Comptez le nombre d'ovules obtenus au cours des 15 dernières minutes. Ajouter 0,5 l de sperme fraîchement dilué de l'étape 2,4,5 par œuf à un plat de pétri. Utilisez la pointe de la pipette pour étendre cette suspension en une couche de 1 mm d'épaisseur.
    7. À l'aide d'un ascenseur en plastique, placer l'échantillon à 4 cm des ampoules d'un lien de 254 nm. Inactiver génétiquement le sperme en irradiant l'échantillon avec 800 000 uJ/mm2.
    8. À l'aide d'une pipette P10, pipette la suspension sur les œufs non fécondés, enrobant chaque œuf de 0,25 à 0,5 l de sperme irradié. Laisser reposer les œufs à température ambiante pendant 30 min.
    9. Après 30 min, inonder les œufs de 0,1x ROR. Placez immédiatement les œufs dans un incubateur de 8 à 10 oC pour les injections le lendemain ou à 18 oC pour les injections dans les 7 heures suivant l'activation (hpa).
    10. Dejelly haploids à l'aide de forceps pointus 30 min après l'hydratation. Placez immédiatement les œufs dans un incubateur de 8 à 10 oC pour les injections le lendemain ou à 18 oC pour les injections le jour même.

3. Haploid Mutagenesis et maintenance

  1. Microinjections CRISPR/Cas9
    1. Conception sgRNAs en utilisant CRISPRscan et synthétiser26,27.
    2. Pour la mutagénèse multiplexe, préparer un stock de 5 sgARN (10 ng/L pour chaque sgRNA) et de protéines Cas9 (1 g/L). Préparer une dilution 100 fois de ce stock (0,1 ng/L par sgRNA, 10 ng/L Cas9) pour l'injection. Pour le gène simple, la mutagénèse de fréquence de mutation élevée, suivez le protocole décrit précédemment28.
    3. Injecter des embryons d'haploïdes à l'étape de la cellule unique 7 hpa s'ils sont entreposés à 18 oC ou injecter des embryons le lendemain au stade de la cellule 2 à 8 s'ils sont entreposés à 8 à 10 oC.
    4. Transférer les embryons à 1,0x ROR avec 20% de polysucrose 400.
    5. Si une seule cellule, injectez à chaque embryon une goutte de 5 nL de la solution d'injection (environ 1/4 de rayon de l'ovule) contenant une masse totale de 0,5 pg/sgRNA et 50 pg de protéines Cas9. Si multicellulaire, distribuez cette masse en injectant de plus petits volumes dans plusieurs cellules.
    6. Laisser les embryons guérir dans le polysucrose 400 pour un minimum de 4 h et un maximum de 18 h à 18 oC.
  2. Logement d'embryon sécaloïde
    1. Transférer les embryons à 0,1x ROR avec antibiotique-antimycotique.
    2. Loger chaque embryon dans un puits individuel d'une plaque de 24 puits, car certains mourront ou se développeront anormalement. Maintenir à 16-18 oC. Des températures plus basses peuvent être utilisées pour prolonger le développement, si nécessaire.
    3. Remplacez les médias par un ROR frais de 0,1x par un antibiotique-antimycotique tous les deux jours.

4. Préparation d'embryons d'hôtes diploïdes

  1. Maintenir les embryons dans le revêtement de gelée à 12 à 16 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 22 à 26.
  2. Ramassez les embryons prêts à être greffés, placez-les dans un tamis (taille de maille de 4 mm) et rincez-les doucement avec la solution de 40 % de Holtfreter.
  3. Transférer les embryons dans un ROR de 0,1x térisoir e filtrant contenant 1,5 % d'eau de Javel jusqu'à 2 min. Immerger complètement les embryons dans la solution d'eau de Javel et les faire tourbillonner doucement pour s'assurer que le revêtement de gelée entre en contact complet avec la solution d'eau de Javel pour tuer les microbes. présents sur les embryons.
  4. Après 2 min, diluer la solution d'eau de Javel contenant les embryons avec un volume égal de 0,1x ROR stérilisé par filtre.
  5. Versez délicatement les embryons dans un tamis saillisé (taille de maille de 4 mm) et rincez les embryons cinq fois à l'effet d'un TOR de 0,1x stérilisé par filtre.
  6. Placer les embryons dans des boîtes stériles de 10 cm de Pétri avec 0,1 x MMR avec des antibiotiques pour le déjellying (pénicilline 100 unités/mL, streptomycine 100 g/L, 0,25 g/mL, gentamicine 25 g/mL).
  7. Sous un stéréomicroscope fluorescent, retirer les manteaux de gelée et les membranes vitelline des embryons gFPMD à l'aide de forceps pointus (dimensions de pointe 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Transférer les embryons de GFPMD dans un nouveau plat de pétri. Minimisez la quantité de liquide transférée du plat de Pétri où ils ont été déjellied.
  9. Rincer les embryons hôtes GFPMD avec des ROR stériles de 0,1x avec des antibiotiques quatre à six fois afin d'éliminer les contaminants.
  10. Placer les embryons propres à 4 oC pendant la nuit avant de les greffer.
    REMARQUE : Le refroidissement des embryons les rend plus rigides et plus propres de séparation du mésoderme de l'endoderm faisable.

5. Génération de chimères haploid-diploïde

  1. Plat chirurgical et préparation des médias
    1. Préparer des plats chirurgicaux stériles d'opération en versant autoclaved 2% agarose dans 0.1x MMR dans stérile 35 mm facile-grip boîtes de Pétri. Remplir les boîtes de pétri à mi-cuisson avec l'agarose.
    2. Après le refroidissement de l'agarose, utilisez un scalpel stérile pour couper une auge inclinée de 25 mm de long dans l'agarose pour maintenir les embryons en place.
    3. Remplir le plat de supports chirurgicaux stériles (0,1x MMR avec antimycoplasme 2,5 g/mL, amphotericin B 0,25 g/mL, et ciprofloxacine 10,0 g/mL) et réfrigérer à 4 oC.
  2. Procédure de greffe d'embryons
    1. Placez un donneur d'haploïdes en bonne santé avec un ou deux embryons diploïdes GFPMD assortis à l'étape à l'intérieur de l'auge du plat d'opération préréfrigéré contenant des supports chirurgicaux (figure 3).
      REMARQUE : Effectuer la procédure sur une phase de refroidissement (10 oC ou moins) si possible.
    2. Utilisez deux forceps ultra-fins et autoclaved (pointe droite, dimensions de pointe 0,05 x 0,02 mm2) pour enlever les couches d'ectoderm et de mesoderm de l'hôte avec le bourgeon des membres près du centre (Figure 4).
      REMARQUE : La région rectangulaire de greffe de tissu englobe le bourgeon de membre et s'étend de la neuvième somite à la moitié postérieure du renflement branchial, environ 2 millimètres, le long de l'axe postérieur antérieur. Le long de l'axe dorsoventral, la région greffée s'étend sur environ 1,5 mm, y compris les somites juste au-delà du bord ventral du renflement branchial. La région greffée comprend tous les mésodermes de plaque latérale et les moitiés latérales des somites, sans perturber l'endoderm sous-jacent. Voir la figure 4 et la vidéo qui l'accompagne pour plus de détails.
    3. Réserver le tissu hôte et retirer une feuille de tissu de taille équivalente du donneur d'haploïdes en utilisant les mêmes méthodes.
    4. Placez la feuille de tissu du donneur haploïde sur la région correspondante de l'embryon donneur.
    5. Fixez le tissu en le recouvrant d'un éclat de verre rectangulaire autoclave d'un verre de couverture de microscope écrasé et en le pressant doucement dans le corps de l'embryon hôte.
    6. Retournez l'embryon du donneur d'haploïdes de l'autre côté pour récolter le bourgeon des membres pour le deuxième embryon hôte. Répétez les étapes 5.2.2 à 5.2.5.
    7. Retirez soigneusement les tissus de l'hôte excédentaire restants et l'embryon du donneur du plat.
    8. Laissez les greffons avec les ancres en éclats de verre en place pendant 60 à 75 min, en vérifiant toutes les 20 min pour s'assurer que le verre n'a pas glissé.
    9. Après que les greffes de tissu adhèrent entièrement, emploient les forceps pour décoller lentement outre des ancres en éclat de verre.
  3. Entretien de la chimère
    1. Transférer les embryons greffés dans des supports chirurgicaux frais et les maintenir à 8 à 12 oC pendant la nuit pour guérir. Hébergez individuellement des embryons greffés dans des assiettes de 12 ou 24 puits.
    2. Après 36 à 48 h, transférer les embryons greffés à l'antibiotique-antimycotique stérile 0,1x MMR. Les antibiotiques forts dans les médias chirurgicaux causent la toxicité dans les embryons engrafted après 3 jours.
    3. Remplacez les médias par du ROR frais de 0,1x et des antibiotiques tous les deux jours et trois jours.
    4. Maintenir les embryons greffés à 18 oC jusqu'à ce qu'ils soient en mesure de nourrir28.
    5. Après 1 à 2 mois de développement et de soins, les membres haploïdes peuvent être marqués pour la pureté de la greffe à l'aide d'un microscope de dissection fluorescente.
      REMARQUE : La présence du gFP-tissu non-neural ou non-sang d'hôte-dérivé dans des membres est un indicateur de greffe impure et est souvent associée au développement anormal de membre. Ces animaux devraient être exclus de toute analyse.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement d'embryons haploïdes peut être distingué des embryons diploïdes par leur phénotype29du « syndrome haploïde ». Au stade de la greffe, les embryons haploïdes présentent une courbure réduite le long de l'axe antérieur-postérieur et une enclos incomplet du bouchon jaune (Figure 3A). Un microscope fluorescent peut être utilisé pour s'assurer que les embryons d'haploïdes sont exempts d'expression GFP dérivée...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il y a quelques étapes critiques dans notre protocole pour produire des chimères haploïdes-diploïdes que le technicien d'opération devrait considérer pour des résultats cohérents de greffe.

La raison la plus probable de l'échec de la génération d'haploïdes est due à de mauvaises conditions d'activation in vitro. Les quantités appropriées de sperme motile doivent être utilisées pour activer les œufs. Pour prolonger la motilité, les échantillons de sperme doivent toujours être maintenus à 4 oC. ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Katherine Roberts pour son soin de la colonie d'axolotl. Le financement de ces travaux a été fourni par le Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 et 15-RMB-YALE-01) et le Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Bourse F32HD086942).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#55 Dumont ForcepsFine Science Tools11295-1Utiliser uniquement le matériau Dumostar (peut être autoclave)
Amphotéricine BSigma AldrichA2942-20ML20 mL
Antibiotique-Antimycosique 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacineSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polysaccharose 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
Incubateur de chauffage/refroidissementRevSciRS-IF-233
Gonadotrophine chorionique humaineMerkChorulon
Megascript T7 Transcription KitThermo FisherAM133440 réactions
Miroscope Cooling StageBrook IndustriesPersonnalisé
NLS Cas9 ProteinPNAbioCP01-2004 flacons de 50 µ ; g protéine
chaque PlasmocinInvivogenant-mpt-1Niveau
de traitementRecipes
1.0x solution de Ringer modifiée de Marc (MMR)0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), pH 7,4
de20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH à 7,4
Solution Holtfreter à 40 %

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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