Présenté ici est un protocole pour l’utilisation de l’alginate comme un polymère dans la microencapsulation des cellules immortalisées pour la livraison à long terme des produits biologiques aux yeux de rongeur.
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Article de méthode
Technologie cellulaire encapsulée pour la livraison de produits biologiques à l’œil de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Beaucoup de thérapies actuelles en cours de développement pour les maladies du pôle postérieur de l’œil sont des produits biologiques. Ces médicaments doivent être administrés fréquemment, généralement par injections intravitréennes. Les cellules encapsulées exprimant le produit biologique de choix deviennent un outil de production et de libération de protéines locales (p. ex., par l’entremise de l’administration de médicaments à long terme). En outre, les systèmes d’encapsulation utilisent des matériaux perméables qui permettent la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules. Cela se produit tout en masquant les cellules de la réponse immunitaire de l’hôte, en évitant la nécessité de la suppression du système immunitaire hôte. Ce protocole décrit l’utilisation de l’alginate comme polymère dans la microencapsulation couplée à la méthode d’électrospray comme technique de microencapsulation. Les cellules ARPE-19, une lignée de cellules humaines de RPE qui se produisent spontanément, ont été utilisées dans des expériences de thérapie cellulaire à long terme en raison de sa fonctionnalité de vie, et il est utilisé ici pour l’encapsulation et la livraison des capsules aux yeux de souris. Le manuscrit résume les étapes de la microencapsulation cellulaire, du contrôle de la qualité et de la livraison oculaire.
Introduction
Les thérapies à base de cellules représentent des techniques biologiques révolutionnaires qui ont été largement appliquées en médecine. Récemment, ils ont été appliqués avec succès dans le traitement des maladies neurodégénératives, des maladies oculaires et du cancer. Les thérapies cellulaires couvrent un large éventail de domaines allant du remplacement cellulaire à l’administration de médicaments, et ce protocole se concentre sur ce dernier. Les microcapsules alginate biodégradables (MC) ont montré leur efficacité en tant que système d’administration, et elles sont de plus en plus largement utilisées dans le domaine biomédical. L’alginate a été utilisé en microencapsulation en raison de son processus de gélification simple, biodégradabilité, excellente biocompatibilité, et la stabilité dans des conditions in vivo1,2,3,4.
La méthode de l’électrospray, en tant que technique de microencapsulation, a été utilisée avec succès pour encapsuler les peptides et les protéines à l’aide d’alginate (polymère de base) et de poly-l-ornithine (polymère de revêtement secondaire). Les deux polymères sont naturellement trouvés et utilisés pour leur biocompatibilité5,6,7. Cependant, le principal défi dans les thérapies à base de cellules est la suppression du système immunitaire hôte pour éviter les effets secondaires causés par les médicaments immunosuppresseurs. La perméabilité des microcapsules alginées est considérée comme une propriété appropriée pour l’encapsulation cellulaire, qui permet la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules tout en les masquant de la réponse immunitaire hôte8,9,10.
Dans l’œil, des cellules encapsulées ont été utilisées dans des essais cliniques pour l’administration constante de produits biologiques (c.-à-d. les facteurs de croissance11,12 et les antagonistes du facteur de croissance13) pour le traitement de la rétinite pigmentaire ou de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. D’autres cibles telles que les inhibiteurs de complément14 sont également actuellement explorées dans des contextes précliniques.
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Protocole
Toutes les expériences ont été effectuées conformément à l’Énoncé ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et de la recherche sur la vision et ont été approuvées par le Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee en vertu du protocole ID 00399.
1. Culture cellulaire
- Générer des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (ARPE-19) lignée cellulaire exprimant de façon stable le gène de choix selon les protocoles publiés14,15.
- Maintenir les cellules dans le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS).
- Incuber les cellules à 37 oC et 5% DE CO2.
- Remplacer le milieu tous les 2 à 3 jours.
- Passer les cellules après avoir atteint 70%-80% confluence en utilisant des procédures de culture tissulaire standard.
2. Encapsulation cellulaire
- Mélanger l’alginate de sodium avec de l’eau déionisée (DI) pour une concentration finale de 2 % w/v et purifier par filtration avec un filtre à seringue stérile de 0,2 m.
- Préparer les cellules à être mélangées avec la solution alginate en trypsinisant, centrifugant, et en les lavant avec 10 mM HEPES solution saline tamponnée (pH - 7,4). À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et ajustez la concentration de cellules finales à 1 x 106 dans la solution alginate.
REMARQUE: Le processus d’encapsulation doit être exécuté à l’intérieur d’une hotte stérilisée. - Chargez les aliquots d’alginate et de cellules de 3 ml et attachez-le à une pompe à seringues. La solution sera pompée à travers une aiguille de pointe émoussée de 30 G à un bain de gélifiant stérile placé dans un bécher stérile de 50 ml sous la pointe de la seringue à 7 mm pour une distance de pulvérisation d’aiguille à la baignoire.
- Le bain gélifié contient un volume de 40 ml de saline tampon HEPES de 10 mM contenant 100 mM de chlorure de calcium (CaCl2) et 0,5 % w/v poly-L-ornithine (OLP). L’OLP est un revêtement polymère secondaire qui peut être omis ou modifié en fonction des besoins de l’enquêteur.
- Ajustez la tension et le débit et maintenez-les constants pendant le processus d’encapsulation à un débit de 60 mm/h et une tension initiale de 6,0 kV pour produire des microcapsules de 150 m.
- Connectez le clip de fil d’anode (rouge) d’une pointe d’aiguille de générateur à haute tension à l’aiguille et connectez le coup de sol (noir) au fil de cuivre qui est à mi-chemin immergé dans le bain de gélification. Un lot du mélange alginate et cellulaire (1 ml) prend environ 30 minutes pour préparer les cellules encapsulées (environ 25 000 microcapsules).
- Laver les microcapsules formées contenant des cellules avec une solution de lavage (10 mM HEPES saline tamponnée contenant 1,5 mM CaCl2, pH - 7,4) deux fois. N’utilisez pas PBS pour le lavage.
- Incuber les cellules encapsulées avec 10% FBS complété DMEM médias dans un incubateur humidifié à 37 oC et 5% DE CO2.
REMARQUE: Les instruments de processus d’encapsulation sont représentés dans la figure 1.
3. Confirmation que l’encapsulation n’affecte pas la viabilité cellulaire
- Après avoir incubé les cellules encapsulées pendant 24 h dans les médias, préparer un petit échantillon de 500 L (30 microcapsules) pour la coloration.
- Laver les microcapsules 2x à l’aide d’une solution de lavage (10 mM HEPES saline tamponnée contenant 1,5 mM CaCl2) et les tacher pour la viabilité des morts-vivants à l’aide d’un kit d’essai vivant/mort.
- Préparer un mélange de colorants de calcéine AM (acétyoxymethyl) et d’éthidium homodimer-1 à des concentrations finales de 2 M et 4 m, respectivement.
- Ajouter 2 ml du mélange de coloration aux cellules encapsulées et incuber pendant 30 à 45 minutes dans l’obscurité à température ambiante (RT).
- Avec une aspiration prudente, aspirez la solution de coloration et lavez les microcapsules 2x avec la solution de lavage. Utilisez un système de microscope fluorescent pour observer et imager les cellules encapsulées.
REMARQUE: La documentation de l’encapsulation est représentée dans la figure 2.
4. Confirmation que les capsules sont la taille appropriée pour la livraison et la livraison de la
- Les injections intravitréales dans un œil de souris sont généralement effectuées avec une aiguille à pointe émoussée de 27 G (diamètre intérieur de 210 m) attachée à une seringue Hamilton de 2,5 L.
- Générez des capsules allant de 100 à 200 m, diluez-les dans des supports sans sérum et tirez-les soigneusement vers le haut dans la seringue de Hamilton. PBS n’est pas un véhicule approprié, car les capsules d’alginate se dissolvent dans PBS.
- Éjectez lentement des gouttes de 1 L contenant des capsules sur une glissière de microscope et déterminez leur intégrité à l’aide d’un microscope à champ lumineux droit.
- Ajuster la taille de la capsule (voir étape 2.3) en ajustant la tension et le débit en conséquence. Les microcapsules plus petites sont produites de façon non linéaire en augmentant la tension et en diminuant légèrement le débit8. Dans nos mains, des capsules de 150 m de diamètre se sont avérées les plus appropriées. L’ajustement de la taille de la capsule dépend également du maintien de la concentration alginate constante tout en changeant les autres paramètres.
- Maintenir un ensemble séparé de cellules dans des capsules de la taille appropriée dans le milieu sans sérum pour déterminer la quantité de sécrétion du biologique désiré. Utilisez des ELISA sensibles ou des ballonnements occidentaux pour déterminer la concentration des produits biologiques dans le supernatant.
- Déterminer la quantité requise de capsules qui doivent être injectées en fonction du PK/PD connu (pharmacocinétique/pharmacodynamique) de la thérapeutique. Dans nos mains, 10 capsules par œil de souris se sont avérées les plus efficaces.
5. Livraison de capsule dans la souris Vitous
- Effectuez des injections intravitréales à l’aide d’un microscope disséquant. Voir la figure 3 pour l’adion chirurgicale et les matériaux utilisés pendant l’intervention. Un protocole détaillé pour les injections intravitrées peut être trouvé ailleurs16.
- Anesthésiez les souris par injection intrapétoninenelle de xylazine et de kétamine (20 mg/kg et 80 mg/kg) ou d’autres anesthésiques préférés approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement spécifique. Assurer la profondeur appropriée de l’anesthésie à l’aide d’une pincéed’ateil 17.
- Dilater les pupilles de souris avec la phényléphrine HCL (2.5%) et le sulfate d’atropine (1%) pour permettre une bonne visibilité de la chambre vitrée et appliquer un gel pour les yeux lubrifiant aux yeux pour les garder hydratés pendant la procédure.
- Perforez la sclérose au limbe avec une aiguille de 26 G comme trou de guidage, en s’assurant que 1) l’aiguille est à un angle de 45 degrés avec l’œil et la table et 2) la pointe biseautée est pointée vers le haut pour éviter de perforer la lentille.
- Injectez soigneusement les capsules à l’aide d’une aiguille à pointe émoussée de 27 G fixée à une seringue Hamilton à un angle de 45 degrés sous inspection visuelle, en veillant à éviter de toucher l’aiguille à la lentille. Une blessure de la lentille entraînera une formation de cataracte. Les capsules doivent être visibles dans le vitré à l’aide du microscope disséquant(figure 4A).
- Après la rétraction de l’aiguille, traiter le site d’injection avec des onguents antibiotiques néomycine et polymyxine B sulfates en plus de la pommade antibiotique ophtalmique dexaméthasone.
- Appliquer la solution ophtalmique goniotaire hypromellose (2,5 %) aux deux yeux pour empêcher les cornées de se dessécher pendant la période de récupération.
- Placer la souris sur un coussin chauffant maintenu à 37oC et surveiller jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée.
- Une injection réussie de cellules ARPE-19 encapsulées devrait révéler la présence de capsules intactes dans la chambre vitrée de la souris avec seulement des quantités mineures de débris lors de l’imagerie de l’œil par tomographie de cohérence optique ou d’autres méthodes(figure 4B).
- L’œil de souris injecté, après quelques jours de récupération en raison de la chirurgie, est maintenant prêt pour le paradigme expérimental à portée de main.
REMARQUE: L’agle-up chirurgical et la documentation des capsules dans l’œil sont représentés respectivement dans la figure 3 et la figure 4.
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Résultats
Les cellules ARPE-19 sont une lignée cellulaire humaine de RPE spontanément immortalisée qui s’est avérée favorable à l’encapsulation et à la survie à long terme lors de l’implantation de capsules dans l’œil. Les outils d’encapsulation alginate sont indiqués à la figure 1. Dans cette étude, il a été démontré qu’encapsulation dans l’alginate, les cellules des capsules d’alginate ont été confirmées par l’imagerie à champ lumineux(figure 2A). Des essais morts-vivan...
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Discussion
Cette technique d’encapsulation cellulaire est relativement rapide et facile à exécuter; toutefois, il faut garder certains points à l’esprit pour obtenir des résultats précis en aval. Les cellules doivent être maintenues en culture dans un plat Petri avant l’encapsulation et maintenues à la confluence appropriée. L’encapsulation doit être effectuée dans un capot de ventilation approprié avec le flux d’air réglementé, si possible. Un courant d’air trop fort peut affecter la formation de capsules, en particulier dans les ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
L’étude a été appuyée en partie par des subventions accordées à B. R. par les National Institutes of Health (R01EY019320), le ministère des Anciens Combattants (RX0004444 et BX003050) et la South Carolina SmartState Endowment.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringue de 3 mL | BD | 309656 | |
| 30 G Aiguille émoussée de 1 po | SAI Technologie d’infusion | B30-100 | |
| Sel de sodium d’acide alginique, d’algues brunes | Sigma | A0682 | |
| Sulfate d’atropine Solution ophtalmolique (1 %) | Akorn | NDC 17478-215-15 | pour la dilatation de la pupille |
| BD Seringue de 1 mL 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson et L’entreprise | DG518105 500029609 REF 309625 | pour générer le trou de guidage |
| Chlorure de calcium, anhydre, granulaire | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | pour lubrifier les yeux pendant l’anesthésie |
| Goniotaire : Hypromellose (2,5 %) Solution émolliente ophtalmolique (stérile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | pour lubrifier les yeux pendant l’anesthésie |
| Hamilton Aiguille/seringue Pointe : 27 G, petit moyeu RN NDL, longueur du custum (12 mm), style de pointe 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | pour l’administration intravitréenne de gélules |
| Hamilton Seringue : 2,5 & micro ; L, Modèle 62 RN SYR, NDL Vendu séparément | Hamilton | 7632-01 | pour l’administration intravitréenne de gélules |
| Tampon HEPES, 1 M | Fisher Bioréactifs | BP299100 | |
| Générateur haute tension | ESD Technologie CEM | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Kit de viabilité/cytotoxicité | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| Chlorhydrate de L-Ornithine, 99 % | Alfa Aesar | A12111 | |
| Sulfates de néomycine et de polymyxine B et onguent ophtalmique de dexaméthasone | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotique pour prévenir l’infection après injection intravitréenne |
| Chlorhydrate de phénoléphrine Solution ophtalmolique (2,5 %) | Akorn | NDC 17478-201-15 | pour la dilatation de la pupille |
| Chlorure de sodium | Sigma | S-5886 | |
| Seringue stérile filtres, 0,2 &mu ; m | VWR | 28143-312 | |
| Pompe à seringue | GRASEBY | MS16A |
Références
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Réimpressions et autorisations
