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Article de méthode

Un système microphysiologique intestinal/hépatique pour l’évaluation pharmacocinétique et toxicologique des médicaments

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DOI :

10.3791/60184

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3 décembre 2020

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1Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 2Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM), 3Grupo Boticário, 4Institute of Biology, University of Campinas

Dans cet article

Résumé

Nous avons exposé un système microphysiologique (MPS) avec des organoïdes intestinaux et hépatiques à l’acétaminophène (APAP). Cet article décrit les méthodes de production d’organoïdes et d’évaluations des biens pharmacocinétiques et toxicologiques de l’APAP dans le SPM. Il décrit également les analyses de fonctionnalité tissulaire nécessaires pour valider les résultats.

Résumé

On s’attend à ce que les systèmes microphysiologiques (MPS) récemment introduits cultivant des organoïdes humains obtiennent de meilleurs résultats que les animaux dans la phase de tests précliniques du processus de développement de médicaments parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Dans cette étude, la barrière intestinale humaine (imitée par une co-culture des cellules Caco-2 et HT-29) et l’équivalent hépatique (imité par des sphéroïdes faits de cellules hepaRG différenciées et de cellules stellates hépatiques humaines) ont été intégrées dans un dispositif microfluidique à puce à deux organes (2 OC) pour évaluer certaines propriétés pharmacocinétiques (PK) et toxicologiques de l’acétaminophène (APAP). Le MPS a eu trois assemblées : intestin seulement 2-OC, foie seulement 2-OC, et intestin/foie 2-OC avec le même média perfusant les deux organoïdes. Pour les évaluations pk, nous avons dosé l’APAP dans les médias à des points de temps prédéfinis après l’avoir administré soit au-dessus de la barrière intestinale (émulation de la voie orale) ou dans les médias (émulsionnant la voie intraveineuse), à 12 μM et 2 μM respectivement. Les échantillons de médias ont été analysés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) en phase inversée. Des organoïdes ont été analysés pour l’expression de gène, pour des valeurs de TEER, pour l’expression et l’activité de protéine, et puis rassemblés, fixés, et soumis à un ensemble d’évaluations morphologiques. La technique MTT a bien fonctionné dans l’évaluation de la viabilité organoïde, mais les analyses à haute teneur (HCA) ont pu détecter des événements toxiques très tôt en réponse au traitement d’APAP. Nous avons vérifié que le flux de médias n’affecte pas significativement l’absorption apap alors qu’il améliore considérablement la fonctionnalité équivalent foie. L’absorption intestinale humaine d’APAP et le métabolisme hépatique pourraient être imités dans le MPS. L’association entre les données MPS et dans la modélisation silico a un grand potentiel pour améliorer la prévisibilité des méthodes in vitro et fournir une meilleure précision que les modèles animaux dans les études pharmacocinétiques et toxicologiques.

Introduction

En raison des différences génomiques et protéomiques, les modèles animaux ont une valeur prédictive limitée pour plusieurs résultats humains. En outre, ils sont longs, coûteux et éthiquement discutables1. MPS est une technologie relativement nouvelle qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Ce sont des dispositifs microfluidiques cultivant des organoïdes (unités fonctionnelles mimétiques artificielles d’organes) sous flux médiatique qui favorise la communication organoïde-organoïde. Les organoïdes faits de cellules humaines augmentent la pertinencetranslationnelle 2,3,4. On s’attend à ce que mps exécute mieux que les essais animaux parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Lorsqu’il sera pleinement fonctionnel, le SPM fournira des résultats plus significatifs, à une vitesse plus élevée et à des coûts et à des risquesmoins élevés 4. De nombreux groupes développent le SPM à plusieurs fins, en particulier des modèles de maladies pour évaluer l’efficacité du médicament.

Le niveau d’exposition est l’un des paramètres les plus critiques pour évaluer l’efficacité et latoxicité des médicaments 5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permet l’intégration organoïde qui imite l’exposition systémique et devrait être plus performante que la culture traditionnelle des tissus humains 2D. Cette technologie peut améliorer considérablement la prédiction de l’absorption intestinale composée et du métabolisme defoie 4.

Un MPS intégrant le modèle équivalent humain de l’intestin et du foie est un bon point de départ, considérant le rôle central de ces deux organes dans la biodisponibilité de drogue et l’expositionsystémique 13,14,15. APAP est un médicament attrayant pour l’étude d’un MPS sans équivalent rénal parce que sa métabolisation se fait principalement par lefoie 16,17.

Le 2-OC est un dispositif microfluidique à deux chambres adapté à la culture de deux tissus/organoïdes équivalents humains différents interconnectés par des microcanaux16. Afin d’imiter une administration orale/intraveineuse humaine in vitro d’un médicament et d’évaluer les effets de la conversation croisée entre l’intestin et les équivalents hépatiques sur la pharmacocinétique APAP, outre la fonctionnalité et la viabilité des organoïdes, trois assemblages MPS différents ont été réalisés : (1) un « Intestin 2-OC MPS » composé d’un équivalent intestinal basé dans un insert culturel contenant une coculture de cellules Caco-2 + HT-29, intégré dans le dispositif 2-OC ; (2) un « Liver 2-OC MPS » composé de sphéroïdes hépatiques faits d’HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells) intégré dans le dispositif 2-OC; et (3) un « Intestin/Foie 2-OC MPS » composé de l’équivalent intestinal dans un compartiment de dispositif communiquant avec l’équivalent hépatique dans l’autre par le flux médiatique par les canaux microfluidiques.

Tous les analyses ont été effectuées dans des conditions statiques (sans flux) et dynamiques (avec flux) en raison de l’impact des stimuli mécaniques (compression, étirement et cisaillement) sur la viabilité et les fonctionnalitéscellulaires 18,19,20. Le présent article décrit le protocole pour l’émulation orale/intraveineuse d’administration d’APAP et l’absorption/métabolisme respectif et les analyses toxicologiques dans le MPS 2-OC contenant l’intestin humain et les modèles équivalents de foie.

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Protocole

1. Production d’équivalents tissulaires pour la culture dans le 2-OC

  1. Production équivalente de barrière d’intestin grêle
    1. Maintenir les cellules Caco-2 et HT-29 à l’aide du milieu équivalent intestinal : DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline et de streptomycine, et 1 % d’acides aminés non essentiels, qui est nommé « DMEM S » dans ce manuscrit.
    2. Retirer le milieu, laver deux fois avec 1x DPBS et ajouter 8 mL de 0,25% trypsine/EDTA pour dissocier les cellules Caco-2 cultivées dans des flacons de culture cellulaire (175 cm2). Incuber pendant 5 min à 37 °C et arrêter la réaction en ajoutant au moins le double volume d’inhibiteur de la trypsine. Effectuez la même procédure pour les cellules HT-29, en ajustant les volumes de réaccente puisqu’une plus petite quantité de ces cellules est nécessaire et qu’elles sont maintenues dans des flacons plus petits (75 cm2).
    3. Centrifugeuse à 250 x g pendant 5 min, enlever le supernatant des deux tubes, et resuspendre les granulés cellulaires dans 10 mL de cellules DMEM S. Count, assurant une viabilité cellulaire supérieure à 80%. Intégrer aseptiquement des inserts de culture cellulaire dans une plaque de 24 puits précédemment remplie de 400 μL de DMEM S par puits dans le côté basolateral (qui représente la circulation sanguine humaine).
    4. Co-cultiver caco-2 et HT-29 cellules à un ratio de 9:121. Utilisez 2,25 x 105 Caco-2 et 2,5 x 104 cellules HT-29 à chaque équivalent intestinal dans un volume final de 200 μL de DMEM S. Ajustez les numéros et le volume des cellules en fonction du nombre souhaité d’organoïdes. Mélanger délicatement.
    5. Pipette 200 μL de solution cellulaire dans le côté apical de chaque insert (qui représente le côté lumen intestinal humain), ensemencement 250.000 cellules par insert. Co-cultiver les cellules dans les inserts pendant trois semaines22. Changez le milieu au moins trois fois par semaine, en l’aspirant des côtés apical et basolateral avec une pipette pasteur stérile, en prenant soin de ne pas endommager la barrière cellulaire intacte.
      REMARQUE: Procéder à l’aspiration sur le côté apical, afin de ne pas toucher la barrière cellulaire (aspirer en soutenant la pipette Pasteur sur le bord en plastique de l’insert cellulaire).
    6. Vérifiez la formation de monocouches étanches en mesurant le TEER (résistance électrique transepithelial) tous les trois jours à l’aide d’un voltmètre23,selon les instructions du fabricant.
      1. Effectuez un blanc, mesurant la résistance à travers un insert de culture cellulaire sans cellules, mais avec le même milieu cellulaire et à la même plaque cellulaire.
      2. Calculer la résistance des tissus en soustrayant la résistance vierge de la résistance équivalente aux tissus, et multiplier par la surface efficace de la membrane filtrante (0,6 cm2). Une bonne résistance de barrière d’intestin est dans une gamme de 150 à 400 Ω-cm2.
        REMARQUE : Après 21 jours, les cellules doivent être complètement différenciées et la barrière intestinale formée, de sorte que les équivalents intestinaux sont prêts à être intégrés dans mps.
  2. Production d’équivalents hépatiques
    1. Maintenir les cellules HepaRG à l’aide du milieu équivalent hépatique, qui est l’E moyen de William complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 5 μg/mL d’insuline humaine et 5 x 10-5 M d’hydrocortisone, et s’appelle « Williams E S » dans ce manuscrit. Renouveler les médias HepaRG tous les 2-3 jours et maintenir la culture cellulaire pendant deux semaines pour initier la différenciation dans les hépatocytes et les cholangiocytes.
    2. Après les deux premières semaines, ajouter 2% DMSO au milieu de HepaRG pendant deux semaines supplémentaires pour compléter la différenciation cellulaire24,25. Cultivez HHSTeC dans Stellate Cell Media (SteC CM), à l’aide de flacons de culture cellulaire recouverts de poly-L-lysine, changeant les médias tous les deux ou trois jours.
    3. Retirer le milieu, laver deux fois avec 1x DPBS et ajouter 8 mL de 0,05% trypsine/EDTA, pour dissocier les cellules HepaRG cultivées dans des flacons de culture cellulaire (175 cm2). Incuber de 5 à 10 min à 37 °C et arrêter la réaction en ajoutant au moins le double du volume d’inhibiteur de la trypsine. Effectuez la même chose pour HHSTeC, en adaptant le volume du reagent puisqu’une plus petite quantité de ces cellules sont nécessaires et qu’elles peuvent être maintenues dans des flacons plus petits (75 cm2).
    4. Centrifugeuse à la fois à 250 x g pendant 5 min, enlever le supernatant et resuspendre les granulés cellulaires dans Williams E S moyen. Comptez les cellules, assurant une viabilité cellulaire supérieure à 80%.
    5. Générer les sphéroïdes du foie combinant les cellules HepaRG et HHSTeC à un rapport de 24:1, respectivement, dans Williams E S moyen16. Ajouter 4,8 x 104 HépaRG différenciés et 0,2 x 104 HHSTeC pour composer chaque sphéroïde hépatique de 50 000 cellules, dans un volume de 80 μL. Ajuster le nombre et le volume des cellules en fonction du nombre souhaité de sphéroïdes. Mélanger délicatement.
    6. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 80 μL de la piscine cellulaire combinée dans chaque puits de 384 microplaques sphéroïdes, dont la géométrie du fond rond est bien inférieure.
      REMARQUE : Après quatre jours, des sphéroïdes d’environ 300 μm se forment.
    7. À l’aide de pointes à alésage large, transférer les sphéroïdes hépatiques dans des plaques de puits ultra-à faible fixation 6, ce qui permet le comptage « un par un » requis.

2. Intégration d’équivalents intestinaux et hépatiques dans un MPS 2-OC

  1. Assemblage intestin 2-OC MPS pour l’analyse d’absorption
    1. Pipette 500 μL de DMEM S dans le compartiment plus grand de 2-OC et 300 μL dans le plus petit. Aspirer le média basolateral et apical de chaque équivalent de barrière intestinale dans les 24 plaques de puits. À l’aide de forceps stériles, intégrer un insert par circuit 2-OC, spécifiquement dans le compartiment plus grand. Appliquer 200 μL du milieu de l’intestin sur le côté apical.
      REMARQUE : Évitez la formation de bulles lors de l’intégration des organoïdes dans le MPS.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
  2. Assemblage de MPS de foie 2-OC pour l’essai de métabolisme
    1. Pipette 650 μL de Williams E S dans le grand compartiment et 350 μL dans le compartiment plus petit, qui recevra les sphéroïdes. Dans les plaques de puits ultra-à faible fixation, comptez les sphéroïdes à l’aide de pointes à alésage large. Chaque équivalent hépatique est composé de vingt sphéroïdes26. Intégrer vingt équivalents hépatiques par circuit, à l’aide de pointes à alésage large, ce qui permet le transfert d’organoïdes seulement, dans le compartiment plus petit d’un 2-OC.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
  3. Assemblage intestin/foie 2-OC MPS pour l’absorption et l’analyse du métabolisme
    1. Combiner les deux supports (intestin et foie) dans une proportion de 1:4, ce qui signifie 200 μL de DMEM S dans le côté apical de l’intestin et 800 μL de Williams E S dans le côté basolateral. Intégrer l’intestin et les équivalents hépatiques, simultanément, dans le 2-OC.
    2. Connectez le MPS à l’unité de commande, qui doit être reliée à un approvisionnement en air pressurisé. Définissez les paramètres : une pression d’environ 300 ± et une fréquence de pompage de 0,3 Hz. Démarrez le débit 24 h avant l’administration de la substance d’essai. Le lendemain, effectuez le traitement APAP.
      REMARQUE : Pour toutes les expériences, effectuez chaque point de temps en triplicate, ce qui signifie trois circuits séparés de 2 OC (c.-à-d. 1 et 1/2 dispositifs 2-OC). Le volume total de chaque circuit de 2 OC est de 1 mL.

3. Préparation à l’acétaminophène (APAP)

  1. Préparer la solution de stock APAP, en dissolvant apap dans l’éthanol absolu. Le jour de l’expérience, diluer l’APAP dans le milieu respectif (solution APAP), à une concentration de 12 μM pour « administration orale » et de 2 μM pour « administration intraveineuse ».
  2. Assurez-vous que la concentration finale d’éthanol dans la solution de contrôle et de traitement des véhicules est de 0,5 % pour les deux administrations. Pour le contrôle positif (APAP de 100 mM), la concentration d’éthanol est de 2%.

4. Tester l’administration de substances et l’échantillonnage des médias

  1. Administration « orale » de l’APAP et échantillonnage des médias
    1. Aspirer le milieu basolateral et apical de chaque équivalent de barrière intestinale dans le 2-OC. Pipette 500 μL du milieu de culture approprié dans le grand compartiment du côté basolateral organoïde et 300 μL dans le petit compartiment.
    2. Vérifiez les bulles et procédez avec le traitement équivalent de barrière intestinale avec la substance d’essai dans le côté apical, imitant l’administration orale. Émuler l’administration « orale » de l’APAP en ajoutant 200 μL d’une solution APAP de 12 μM du côté apical des inserts de culture intestinale, qui représente le « côté lumen » intestinal (figure 1B). Connectez le MPS à l’unité de contrôle.
    3. Recueillir le volume total à partir de côtés apical et basolateral aux points de temps suivants: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, et 24 h15,27. Effectuez toutes les expériences en triplicate, dans des conditions statiques et dynamiques, et recueillez chaque échantillon, de chaque triplicate, dans un microtube séparé. Analyser les échantillons à l’aide de HPLC/UV.
      REMARQUE : Séparez les échantillons apical et basolateral.
  2. Administration « intraveineuse » de l’APAP et échantillonnage des médias
    1. Émulez la voie « intraveineuse » en administrant la solution APAP de 2 μM directement dans le compartiment hépatique. Aspirez tout le contenu moyen 2-OC. Pipette 650 μL de Williams E S contenant la substance d’essai dans le grand compartiment et 350 μL du même média dans le compartiment plus petit qui contient les 20 sphéroïdes. Recueillir tous les volumes aux points de temps suivants: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h, et 24 h27,28.
    2. Effectuez toutes les expériences en triplicate, dans des conditions statiques et dynamiques. Recueillir chaque échantillon, de chaque triplicate, dans un microtube séparé. Analyser les échantillons à l’aide de HPLC/UV.

5. Instrumentation et conditions chromagraphiques

  1. Analyse HPLC
    1. Définissez tous les paramètres pertinents pour l’analyse HPLC selon le tableau 1.
    2. Filtrer la phase mobile à travers un filtre membranaire de 0,45 μm sous vide. Filtrer les échantillons à travers un filtre à seringues PVDF de 0,22 μm de taille pore (diamètre 13 mm) et les conserver dans un flacon. Démarrez la mesure.
  2. Solutions de stock, normes d’étalonnage et échantillons de contrôle de la qualité (QC)
    1. Préparez 10 mM de solutions de stock APAP dans le tampon d’acétate d’ammonium (100 mM, pH 6,8) et diluez davantage avec les supports de culture cellulaire DMEM S et Williams E S dilués avec tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) pour atteindre les solutions de travail allant de 0,25 à 100,00 μM.
    2. Inclure un ensemble d’échantillons d’étalonnage en triplicate ainsi que des échantillons de contrôle de la qualité à quatre niveaux en triplicate. Préparez ces normes par dilution en série.
    3. Créer des courbes d’étalonnage des zones de pointe apap par rapport aux concentrations standard nominales APAP. Déterminez la régression linéaire adaptée à chaque courbe d’étalonnage. Évaluer la qualité de l’ajustement de divers modèles d’étalonnage par inspection visuelle, coefficient de corrélation, précision et valeurs de précision intra-et inter-run.
    4. Injecter des échantillons vierges de DMEM S et Williams E S médias dilués dans tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/ v) en sextuplicate. Préparer des triplicates d’échantillons de contrôle de la qualité dans les supports DMEM S et Williams E S dilués avec tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) pour les concentrations apap de 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 et 90,00 μM.
    5. Assurez-vous que les échantillons de contrôle de la qualité sont préparés à partir d’une nouvelle solution de stock, différente de celle utilisée pour générer une courbe standard. Utilisez des échantillons de contrôle de la qualité pour étudier les variations intra-et inter-run.
  3. Procédures de validation
    1. Effectuer la validation de la méthode bioanalytique suivant les procédures précédemmentsignalées 29,30. Effectuez les séries chromagraphiques à cinq ou six reprises distinctes, compte tenu des médias de culture cellulaire Williams E S et DMEM S, respectivement.
    2. Assurez-vous que les points d’étalonnage allant de 0,25 à 100,00 μM d’APAP, dans les médias de culture cellulaire DMEM S ou Williams E S dilués dans le tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v), sont tracés en fonction des zones de pointe de l’APAP (axe y) par rapport aux concentrations nominales respectives (axe x). Comparez les pentes de ces courbes d’étalonnage standard avec les pentes de courbe d’étalonnage préparées en tampon d’acétate d’ammonium. Assurez-vous que toutes les courbes d’étalonnage ont une valeur de corrélation d’au moins 0,998.
    3. Déterminez la précision et la précision (intra et inter-run) de l’analyte dans la matrice de substitution à l’aide de répliques à quatre niveaux différents LLOQ, contrôle faible, moyen et de haute qualité sur cinq ou six jours différents. Effectuez des mesures de précision et de précision intra-run le même jour dans les médias de culture cellulaire DMEM S ou Williams E S dilués dans un tampon d’acétate d’ammonium (1:1, v/v) contenant des concentrations de 0,50, 4,50, 45,00 et 90,00 μM APAP (n = 3).
    4. Évaluer chaque ensemble d’échantillons de contrôle de la qualité contenant les concentrations d’APAP à partir de courbes d’étalonnage récemment obtenues. Testez la sélectivité des essais par le degré de séparation du composé d’intérêt et d’autres pics chromatographiques possibles causés par les composants interférants.
  4. Limite inférieure de quantification (LLOQ) et limite de détection (LOD)
    1. Déterminer la limite inférieure de quantification (LLOQ) en fonction de l’écart type de la réponse et de l’approche en pente. Calculer à l’aide de la formule 10α/S, où la α est l’écart type de y-intercept et S est la pente de la ligne droite obtenue en traçant les courbes d’étalonnage29,30. Estimer la limite de détection (LOD) en tenant compte 3,3 fois l’écart type du blanc, divisé par la pente de la courbe d’étalonnage29,30.

6. Équivalents tissulaires viabilité/fonctionnalité

  1. Mtt
    1. Effectuez un test MTT pour évaluer la viabilité organoïde dans tous les points de temps de l’essai MPS. Comme le contrôle négatif, utiliser les médias cellulaires plus véhicule. Comme le contrôle positif, traiter les organoïdes avec 100 mM APAP et 1% NaOH dilué dans le milieu cellulaire.
    2. Transférer les 20 sphéroïdes de chaque réplique pour les puits individuels dans une plaque de puits 96, et les inserts de culture cellulaire, contenant les équivalents intestinaux, à 24 plaques cellulaires bien, plaçant un équivalent intestin par puits. Lavez les équivalents tissulaires trois fois avec 1x DPBS.
    3. Ajouter 300 μL d’une solution MTT de 1 mg/mL, diluée dans le milieu cellulaire respectif, par puits. Incuber les plaques pendant 3 h dans des conditions de culture cellulaire standard.
    4. Retirez soigneusement la solution MTT de chaque puits par pipetting. Extraire le mtt formazan de l’intestin et des équivalents hépatiques à l’aide de 200 μL d’isopropanol par puits pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Scellez le couvercle pour éviter l’évaporation.
    5. Transférer 200 μL de chaque supernatant au puits pré-identifié respectif dans une plaque d’essai de 96 micro puits. Utilisez l’isopropanol comme blanc.
    6. Lire l’absorption formazan dans un lecteur de plaques à 570 nm. Calculer la capacité relative des cellules à réduire le MTT (%) en utilisant la densité optique moyenne de chaque point de temps, par rapport au contrôle négatif, considéré comme 100% viabilité cellulaire.
  2. Cytochimie/Histologie
    1. Fixer l’intestin et les équivalents hépatiques, pendant 25 min à température ambiante, en utilisant 4% (w/ v) paraformaldéhyde dans 0,1 M phosphate-saline tampon, pH 7,4. Lavez les organoïdes 5 fois dans le tampon PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Tacher l’intestin et les équivalents hépatiques avec la tétraméthylrhodamine isothiocyanate-phalloidin ou Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 dans PBS31.
    2. Transférez-les au milieu de congélation oct pendant quelques minutes pour les acclimater à rt avant de les transférer à l’azote liquide jusqu’à ce que la congélation complète. Effectuer des cryosections de sphéroïdes hépatiques d’environ 10-12 μm d’épaisseur, à l’aide d’un cryostat.
    3. Monter les sections de tissus dans le milieu de montage avec DAPI. Examinez-les par microscopie de fluorescence confoccale.
    4. Congeler les organoïdes après fixation pour effectuer la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine selon les protocoles établis. Montez les diapositives avec le milieu de montage après avoir tranché le tissu tel que décrit ci-dessus et prenez des images histologiques à l’aide d’un microscope optique.
  3. Analyse de contenu élevé
    1. Coloration mitochondrique et nucléaire des cellules
      1. Reconstituer la poudre lyophilisée dans DMSO pour faire une solution de stock de coloration mitochondriale de 1 mM (p. ex., MitoTracker Deep Red FM). Conserver la solution de stock aliquoted à -20 °C à l’abri de la lumière. Diluer la solution de stock de coloration mitochondriale de 1 mM à la concentration finale (200 nM) dans le milieu de culture tissulaire préchauré (37 °C) sans sérum.
      2. Retirez les supports de culture cellulaire. Ajouter la solution de coloration mitochondriale pour couvrir complètement l’échantillon et incuber les cellules pendant 15-45 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.
      3. Retirez soigneusement la solution de travail de coloration mitochondriale et remplacez-la par un fixatif de paraformaldéhyde de 2 à 4 % dans le PBS pendant 15 minutes à température ambiante.
      4. Rincer délicatement les cellules fixes avec du PBS pendant 5 minutes. Répétez le processus de lavage deux fois.
      5. Préparer une solution de 10 mg/mL (16,23 M) de stock de colorant acide nucléique en dissolvant 100 mg de colorant Hoechst 33342 dans 10 mL d’eau ultrapure.
        REMARQUE : La solution de stock doit être aliquoted et stockée protégée de la lumière à -20 °C.
      6. Préparez une solution de travail de coloration de l’acide nucléique de 0,2 à 2,0 μg/mL dans PBS et incubez les cellules fixées avec une solution de travail de coloration de l’acide nucléique pendant 10 minutes à température ambiante.
      7. Retirer la solution de travail de coloration de l’acide nucléique et rincer les cellules doucement avec PBS pendant 5 minutes trois fois. Les cellules doivent être conservées en PBS à 4 °C, à l’abri de la lumière.
    2. Analyse des taches mitochondriales et nucléaires
      1. Analyser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence avec des ensembles de filtres appropriés à la tache d’acide nucléique (νEx/νEm : 361/497 nm) et à la tache mitochondriale (νEx/νEm : 644/665 nm). Trouver des cellules par l’acide nucléique tache positive et quantifier le nombre de cellules. Quantifier l’intensité de fluorescence des taches mitochondriales dans les mitochondries.
  4. Mesures morphométriques (calculs sphéroïdes) dans ImageJ
    1. Export High Content Analysis (HCA) images comme *.flex fichiers à partir du logiciel Columbus. Importer .flex fichiers comme une échelle grise dans ImageJ en utilisant Bio-Formats plugin32: Fichier > Importation > Bio-Formats.
    2. Dans la fenêtre Options d’importation, sélectionnez visualisation Hyperstack et activez les canaux split sous Split en fenêtres séparées. Cette option permettra l’accès à tous les fichiers d’un canal particulier (p. ex., DAPI, mitotracker, etc.). Ne sélectionnez pas Utilisez la pile virtuelle sous gestion de mémoire.
      REMARQUE : Il est préférable d’utiliser le canal DAPI comme « poussière » dans les images, car le milieu de culture est réduit en longueur d’onde UV (p. ex., 405 nm).
    3. Ajuster la taille des pixels (Analyser > Set Scale) si elle n’a pas été chargée en fonction des valeurs intégrées dans le fichier .flex. Appliquez un filtre Gaussian Blur pour éliminer l’excès de bruit et éviter les irrégularités dans le contour de la forme. Processus > Filtres > Gaussian Blur. Une valeur élevée de Sigma (rayon) entre 2,0 et 3,0 est idéale pour la plupart des cas. Si la pile a plusieurs images, appliquez-les à toutes (sélectionnez Oui dans la fenêtre Stack de processus).
    4. Générer une image binaire pour séparer l’arrière-plan et les organoïdes (objets) à l’aide d’un seuil. Cliquez sur l’image > Ajuster > Seuil. Utilisez le masque rouge pour ajuster les valeurs en fonction de l’intensité de l’image, pour s’adapter à la forme organoïde, en gardant la morphologie intacte. Désactiver fond sombre si l’image a un fond blanc. Cliquez sur Appliquer.
    5. Dans la fenêtre Convertir la pile en fenêtre binaire, choisissez la méthode Threshold. Habituellement, par défaut ou triangle sont préférés dans ce genre de traitement d’image. Gardez l’arrière-plan comme sombre. Sélectionnez Calculer le seuil pour chaque image s’il y a plusieurs images dans la pile.
    6. Sélectionnez Processus > Binaire > Remplir les trous. En option, retirez les trous de l’arrière-plan. Dans Process > Binary > Options, sélectionnez fond noir et exécuter fill holes à nouveau. Désactiver l’option d’arrière-plan noir avant de passer à l’étape suivante.
    7. Objets séparés. Pour les organoïdes, la méthode du bassin versant est un bon choix. Cliquez sur Processus > Binaire > Watershed. Exécutez l’analyse de forme.
      1. Sélectionnez Analyser > Définir les mesures. Plusieurs options sont disponibles (détails dans https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Pour les organoïdes, sélectionnezZone , Valeur grise moyenne, Valeur grise min & max et descripteurs de forme. En option, sélectionnez l’étiquette Display pour identifier les objets dans l’image et la notation scientifique. Cliquez sur OK.
      2. Sélectionnez Analyse > Analyser les particules. Choisissez les limites de taille et de circularité. Gardez 0-infini et 0.00-1.00, respectivement pour mesurer tous les objets dans l’image. Dans Afficher, choisissez les contours de sorte que les objets seront identifiés. Activer les résultats d’affichage aux résultats de sortie; Exclure sur les bords pour exclure les objets touchant les bordures; Inclure des trous de sorte que les trous intérieurs éventuels dans les objets sont considérés comme faisant partie de la forme principale.
    8. Répétez l’analyse de forme pour chaque pile d’images et les résultats seront annexés dans une seule table. Tableau des résultats d’exportation dans file > Save As... comme virgule valeurs séparées (.csv) fichier.
  5. PCR en temps réel
    1. Extraire l’ARN des équivalents tissulaires à l’aide d’une solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidine, suivant les instructions du fabricant.
    2. Effectuez la synthèse cDNA par transcription inverse de 1 à 2 μg d’ARN total.
    3. Amplifiez toutes les cibles à l’aide d’amorces spécifiques aux gènes (tableau 5) pour effectuer un PCR quantitatif en temps réel. Chaque qRT-PCR contient 30 ng d’ARN transcrit inversé et 100 nM de chaque amorce.
    4. Suivez les conditions PCR : 50 °C pendant 3 minutes (1 cycle); 95 °C pendant 5 minutes (1 cycle); 95 °C pendant 30 secondes, 59 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant 45 secondes (35 à 40 cycles).
  6. Analyse CYP
    1. Suivez la section 2.2 pour l’assemblage foie 2-OC. Les groupes expérimentaux sont le contrôle sans cellule, les traitements APAP 2 μM pour 12 h, 24 h et le contrôle du véhicule. Suivez les sections 3.3 et 4.2 pour la préparation et le traitement apap 2 μM.
      REMARQUE : Pour s’assurer que tous les échantillons seront prêts en même temps pour l’analyse du CYP, commencez le traitement de 12 h 12 heures après le début du traitement de 24 h. Traitez le contrôle sans cellule de l’activité CYP avec une solution éthanol à 0,5 %, ainsi que le contrôle du véhicule.
    2. Décongeler la solution de bouillon de substrat luminogène de 3 mM à température ambiante et faire une dilution de 1/1000 dans William’s E S. Protégez-vous de la lumière.
    3. Recueillir les sphéroïdes et transférer chaque groupe expérimental dans un puits d’une plaque de 96 puits. Retirer le milieu, laver deux fois avec 100 μL de 1x DPBS et ajouter 80 μL de solution de substrat de 3 μM par puits. Gardez le contrôle sans cellule dans le milieu E S de William. Enregistrez un puits sans sphéroïdes ni solution de substrat pour un contrôle de fond. Incuber pendant 30-60 min à 37 °C avec 5% de CO2,protégé de la lumière.
    4. Équilibrate lyophilisé Luciferin Detection Reagent (LDR) à l’aide du tampon de reconstitution avec esterase. Mélanger en tourbillonnant ou en inversant. Conservez le volume approprié à température ambiante jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : Le LDR reconstitué peut être stocké à température ambiante pendant 24 heures ou à 4 °C pendant 1 semaine sans perte d’activité. Pour un stockage à long terme, conserver à -20 °C.
    5. Transférer 25 μL de supernatant intact des sphéroïdes dans trois puits différents d’une microplaque blanche opaque de 96 puits, après incubation. Ajouter 25 μL de LDR par puits et homogénéiser.
    6. Incuber la plaque blanche à température ambiante pendant 20 minutes. Lisez la luminescence sur un luminomètre. N’utilisez pas de fluoromètre.
    7. Calculez les signaux nets en soustrayant les valeurs de luminescence de fond (contrôle sans cellule) des valeurs d’essai traitées par composé et non traitées (contrôle du véhicule). Calculer le pourcentage de variation de l’activité CYP3A4 en divisant les valeurs nettes traitées par les valeurs nettes non traitées et en multipliant par 100.
  7. Ballonnement occidental
    1. Transférer les sphéroïdes hépatiques sur un microtube identifié de 1,5 mL. Retirer le milieu et laver deux fois avec 100 μL de 1x DPBS.
    2. Lysate les sphéroïdes du foie dans 100 μL de lyse cellulaire RIPA tampon à 4 °C pendant 20 min. Centrifugeuse pendant 15 min, 4 °C et 11 000 rpm. Transférez le supernatant à un autre microtube identifié de 1,5 mL.
    3. Quantifier la quantité de protéines obtenue par la méthode Bradford. Chargez entre 10 et 50 μg de protéines du lysate de cellules quantifiées par puits d’un gel polyacrylamide gradient 3-15% et effectuez un SDS-PAGE.
    4. Transférez la protéine chargée du gel à une membrane PVDF de 0,22 μm à travers l’équipement du système semi-sec. Utilisez une solution de transfert de 50 mM Tris-HCl et 192 mM de glycine. Définissez les paramètres de l’équipement en fonction du nombre de gels à transférer (1 à 2 à la fois).
    5. Bloquer les interactions non spécifiques sur la membrane PVDF avec une solution de lait écrémé de 3 à 5 % dans le tampon TBS-T : Saline à tampon tris (50 mM tris pH 7,6, chlorure de sodium de 150 mM) complétée par 0,1 % de Tween 20. Gardez la membrane sous une secousse doucement constante pendant 1 heure à température ambiante.
    6. Laver avec le TBS-T sous une secousse doucement constante pendant 3-5 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    7. Diluer l’albumine et les anticorps primaires de vinculine à 1:1000 et 1:2000 respectivement sur TBS-T. Incuber la membrane avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C, sous des secousses doucement constantes.
      REMARQUE : Suivez toujours les instructions du fabricant pour diluer les anticorps.
    8. Retirez l’anticorps primaire et la membrane de lavage 3 fois (étape 6.7.6). Diluer l’anti-souris ECL anticorps secondaire IgG à 1:5000 sur TBS-T. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire sous une secousse doucement constante pendant 2 heures à température ambiante.
    9. Retirer l’anticorps secondaire et laver la membrane (étape 6.7.6). Effectuez la détection des protéines à l’aide du substrat de blotting occidental ECL. Exposer les films autoradiographiques pendant 30 s à 30 min. Effectuez la détection d’immunoblotting en triplicate.

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Résultats

Pour effectuer les tests PK APAP dans le MPS 2-OC, la première étape consiste à fabriquer l’intestin humain et les équivalents hépatiques (organoïdes). Ils sont intégrés dans le dispositif microfluidique 2-OC (Figure 1A) 24 h avant le début de l’essai PK APAP. Le lendemain, le support est modifié, et le modèle est exposé à l’APAP. La figure 1 illustre l’intestin et les équivalents hépatiques placés à l’intérieur du dispositif 2-OC (figure 1B...

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Discussion

L’évaluation précise et fiable des propriétés pharmacologiques des nouveaux médicaments d’investigation est essentielle pour réduire le risque dans les étapes de développement suivantes. Le MPS est une technologie relativement nouvelle, qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Notre groupe progresse dans l’évaluation des propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques principalement nécessaires à l’optimisation du plomb. Nous avons travaillé avec le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Christie Guguen-Guillouzo, le Dr Philippe Gripon de l’Unité 522 INSERM et le Dr Christian Trepo de l’Unité 271 INSERM pour l’utilisation du matériel biologique (cellules Hepa RG) et pour nous avoir mis à notre disposition afin d’effectuer la recherche universitaire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235Sans calcium, sans magnésium
2-OCTissUse GmbHPuce à deux organes
Microplaque sphéroïde 384 puitsCorning3830Noir/Clair, Fond rond, Attachement ultra-faible
4 % ParaformaldéhydeUtiliser pour fixer la cellule
AcétaminophèneSigma AldrichA7085Utilisation pour les dosages MPS
AcétonitrileTediaUtilisé pour réaliser la HPLC
Alexa Fluor 647 PhalloïdineThermo Fisher Expérience confocale scientifique
Acétate d’ammoniumSigma AldrichUtilisé pour réaliser la HPLC
Cellules Caco-2Sigma Aldrich86010202
Cacodylate Tampon
Flaconsde culture cellulaireSarstedt
Microscope confocal à fluorescenceLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Ajouter des suppléments : 10 % de sérum bovin fœtal, 100 unités par mL de pénicilline, 100 & micro ; g/mL de streptomycine et 1 % d’acides aminés non essentiels
DMSOSigma AldrichD4540Ajouter 2 % au milieu HepaRG
ÉthanolSynthé Sérum
fœtal bovinThermo Fisher Scientific12657029
Moyen de congélation OCTTissue-TekTissue-Tek® ; O.C.T.&négoce ; Le composé est une formulation de glycols et de résines hydrosolubles, fournissant une matrice d’échantillon pratique pour le sectionnement du cryostat à des températures de -10° ; C et inférieurs.
Hématoxyline et Cellules Eosin
HepaRGBiopredic InternationalHPR101Cellules indifférenciées
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cellules et tous les suppléments de culture
Hoechst 33342HCA expériences
HT-29 cellulesSigma Aldrich85061109
Insuline humaineInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky' s fixateur
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 colonne de garde SSPhenomenexUtilisé pour effectuer un microscope HPLC
LeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µ ; m inserts de taille de poresMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 mètreMerckMERS00002Utilisé pour la mesure TEER
MitoTracker Deep RedHCA expériences
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systèmeAgilent Technologies
ChambreNeubauerComptage de cellules
Operetta Système d’imagerie à haut contenuPerkin ElmerUtilisé pour effectuer le dosage HCA
P450-Glo CYP3A4 avec Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15070063Culture cellulaire
PermountThermo Fisher Scientific
Histology PrimersRT-qPCR
Membrane PVDFBioRad
PVDF Filtre0.22 &mu ; m taille
des pores Colonne Luna C18 en phase inversePhenomenexUtilisé pour effectuer un agitateur HPLC
(IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Utilisé pour les sphéroïdes afin d’améliorer le dosage MTT
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Ajouter des suppléments STeC CM
SuperScriptIITM Transcriptase inverseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
Réactif TRizol TMThermo Fisher ScientificTrizol est une solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidine.
Solution trypsine/EDTAThermo Fisher ScientificR001100
Plaques à fixation ultra-basseCorningCLS3471-24EA6 puits
Vectashield plus support
DAPI Blanc Opaque 96 puitsMicroplaque PerkinHelmer
Embouts à alésage
large Williams EPan BiotechP04-29510Ajouter des suppléments : 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 unités par ml de pénicilline, 100 & micro ; g/mL de streptomycine et 5 & micro ; g/mL d’insuline humaine
à seringue de montage

Références

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