Caractérisation de sickling pendant la désoxygénation automatisée contrôlée avec l'ektacytométrie de gradient d'oxygène

Résumé

Ici, nous présentons l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, une méthode rapide et reproductible pour mesurer la déformation rouge de globule seux dans des échantillons des patients présentant la maladie de drépanocytose sous la déoxygénation et la réoxygénation contrôlées. Cette technique fournit un moyen d'étudier la drépanocytose des globules rouges et de surveiller l'efficacité du traitement des drépanocytoses.

Résumé

Dans la drépanocytose (SCD), une mutation ponctuelle unique dans le codage génétique de la bêta-globine provoque la production d'hémoglobine anormale S (HbS). Une fois désoxygéné, HbS peut polymériser, formant des tiges rigides d'hémoglobine, ayant pour résultat le faucillage des globules rouges (RBCs). Ces RBCs faucillés ont sensiblement réduit la déformabilité, causant la vaso-occlusion, qui mène à de nombreuses complications cliniques SCD-connexes, y compris la douleur, la course, et des dommages d'organe. La déformation de RBC est également réduite par la déshydratation de RBC, ce qui entraîne des globules rouges denses qui sont plus susceptibles de faucille. À ce jour, il n'existe pas un seul test de laboratoire largement disponible, rapide et reproductible capable de prédire la gravité de la maladie ou de surveiller directement les effets du traitement des nouvelles thérapies induisantes par l'hémoglobine non fœtale. Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour mesurer la déformation de RBC en fonction du pO₂ qui tient compte de la quantitation du comportement de faucillage dans les patients de SCD. L'ektacytométrie de gradient d'oxygène mesure la déformation de RBC, exprimée comme l'indice d'allongement (IE), en fonction du pO₂. Les RBC sont exposés à un stress de cisaillement fixe de 30 Pa au cours d'une série de désoxygénation et de réoxygénation. Six paramètres de lecture sont produits. Parmi ceux-ci, le point de faucille (PoS), défini comme le pO₂ à laquelle l'IE maximale (EI_max) montre une diminution de 5 %, et l'ie chômage minimum pendant la désoxygénation (EI_min) sont les plus instructifs, reflétant le pO₂ d'un patient individuel à laquelle la dilération commence et la déformation minimale des globules rouges d'un patient, respectivement. Le PoS est associé à l'affinité d'hémoglobine d'un patient individuel pour l'oxygène, tandis que le_min d'Ie montre une forte corrélation avec des niveaux foetaux d'hémoglobine. Nous concluons que l'ektacytométrie de gradient d'oxygène est une technique prometteuse pour surveiller le traitement des patients présentant SCD, comme biomarqueur pour des agents anti-sickling dans les essais cliniques et précliniques, et un outil important pour étudier le comportement de faucillement des RBCs de personnes atteintes de DSP et de drépanocytose.

Introduction

Dans SCD, une mutation de point simple a comme conséquence la production de HbS, qui peut polymériser sur la désoxygénation. La polymérisation hbS provoque la dilémissement des RBC et réduit la déformation de RBC. La combinaison de la dilencelle RBC et de l'adhésion de RBC à l'endothélium mène à diverses complications de DSC, y compris les crises vaso-occlusives (COV), les accidents vasculaires cérébraux, les dommages aux organes et l'anémie hémolytique chronique. Même dans des conditions normoxiques, la déformation de RBC est compromise dans les patients présentant SCD. La déformation est encore diminuée à de faibles concentrations d'oxygène. Les principaux acteurs qui déterminent la déformation à la normoxie sont les cellules denses, les cellules irréversiblement diléléminées (ISC), et les cellules déshydratées, qui ont toutes une diminution du rapport surface-volume^1,2,3.

L'ektacytométrie est une méthode établie pour mesurer la déformation de RBC, largement utilisée pour le diagnostic des anémies hémolytiques héréditaires, en particulier les membranopathies⁴. Il peut également être utilisé pour étudier l'hémoréologie^5,6,7,8,9. L'ektacytométrie de gradient osmotique, dans laquelle la déformation de RBC est mesurée pendant un changement continu dans l'osmolalité, a été employée pour étudier SCD pendant plus d'une décennie^10,11. Le pourcentage d'hémoglobine fœtale (HbF) est l'un des inhibiteurs les plus forts de la polymérisation HbS parce que ni HbF ni son tétramer hybride mixte (2 'S) ne peuvent entrer dans la phase¹²du polymère deoxyHbS. Des études récentes suggèrent que l'augmentation des niveaux de HbF chez les patients atteints de SCD conduit à un meilleur rapport surface-volume, améliorant ainsi l'état d'hydratation et donc la déformation chez les patients non transfusés¹¹.

La déformation de RBC a été étudiée dans le passé comme biomarqueur pour les complications de DSC, mais avec des résultats contradictoires. Dans les études effectuées transversalement et à un état stable, les individus avec des niveaux plus élevés de déformation RBC se sont avérés pour avoir une incidence plus élevée de l'ostéonécrose et plus de crises de douleur^13,14,15. Contrairement à ces résultats, par rapport aux valeurs d'état stables au cours d'un COV aigu, la déformation de RBC a été diminuée dans les études longitudinales chez les mêmes individus¹⁶. Cet écart peut être le résultat de l'étude de la déformation de RBC dans des conditions différentes (c.-à-d. pendant l'état stable par rapport au COV). Le pourcentage de cellules faucillées est élevé au début d'un COV et les cellules sont rapidement détruites au fur et à mesure que la crise progresse, ce qui peut expliquer la différence entre les données d'incidence transversale de l'état stable et les données longitudinales obtenues pendant le COV. Cependant, d'autres facteurs, comme l'adhésion des sous-populations de RBC à la surface endothéliale, peuvent également être importants dans l'occurrence des COV. Dans SCD, il est plus cliniquement pertinent de mesurer la déformation pendant la désoxygénation, parce que vaso-occlusion se produit typiquement dans les venules post-capillaires hypoxiques et pas dans le réseau microcapillary moins hypoxique^17. En outre, la présence d'ISC peut modifier la capacité d'un ektacytomètre à mesurer la déformation à la normoxie. La distorsion du modèle de diffraction est causée par les ISC, qui résulte du non-alignement pendant le flux^1,2,3.

Les approches alternatives pour étudier la pathophysiologie des COV comprennent des mesures de l'adhérence de RBC à une surface artificielle¹⁸, cytométrie de micro-flux d'impédance électrique à cellule unique¹⁹, modèles microfluidiques combinant des modèles quantitatifs mesures de la dilélitance cellulaire et le malaise avec la rhéologie à cellule unique²⁰, et la polymérisation induite par laser²¹. Bien que prometteuses, ces techniques sont coûteuses, à forte intensité de main-d'œuvre et nécessitent une formation approfondie de l'opérateur. En outre, les essais qui sont basés sur la morphologie n'ont pas la capacité d'étudier le comportement cellulaire, comme la déformation, en fonction d'un gradient d'oxygène.

Dans cette étude, nous décrivons un test fonctionnel rapide et reproductible exécuté avec un ektacytomètre. Il s'agit d'une mesure de l'ektacytométrie de prochaine génération qui mesure les différents aspects qualitatifs de la déformation de RBC exprimés en tant qu'IE pendant la désoxygénation (1 300 s) et la réoxygénation rapide (280 s). Ces intervalles de temps permettent la formation de polymères HbS, et donc l'occurrence de changements morphologiques, puis la récupération. La désoxygénation se produit en introduisant le gaz azoté, qui diminue lentement la tension d'oxygène dans l'échantillon de sang dans l'écart entre le bob et la tasse de l'ektacytomètre. La déformation de RBC est mesurée en permanence tandis que la tension d'oxygène est mesurée tous les 20 s au moyen d'un petit O_2-spotprésent dans la paroi de la tasse. Au cours de l'essai, environ 80 mesures pO₂ sont couplées à l'IE mesurée à ce moment-là. La pression d'oxygène descend en dessous de 20 mmHg pendant la désoxygénation, et la réoxygénation est facilitée par la diffusion passive de l'air ambiant. La configuration expérimentale du module d'ektacytomètre et de gradient d'oxygène est décrite dans la figure 1 et la figure 2. Le principe de l'ektacytométrie est basé sur la diffusion de la lumière induite par RBC à partir d'un faisceau laser. Il en résulte un modèle de diffraction elliptique lorsque le stress de cisaillement est appliqué en même temps (figure 1).

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique du Centre Médical Universitaire d'Utrecht (UMCU) et conformément à la Déclaration d'Helsinki. Les patients inscrits au Texas Children's Hematology Center (TCHC) ont été approuvés par la CISR locale et conformément à la Déclaration d'Helsinki.

1. Considérations générales

1. Commencez par effectuer une mesure d'essai pour réchauffer le bob et la tasse. Assurez-vous que la température du bob et de la tasse est de 37 oC. Ceci est important pour une bonne reproductibilité.
2. Veiller à ce que la solution visqueuse de polyvinylpyrrolidone (PVP) tombe dans les limites strictes de l'osmolarité (282 à 286 mOsm/kg), du pH (7,35 à 7,45) et de la viscosité (27,5 à 32,5 MPa) à température ambiante (22 oC).
   REMARQUE : Le PVP doit être utilisé à température ambiante. S'il est entreposé à une température plus basse, assurez-vous qu'il s'est réchauffé à la température ambiante avant de prendre des mesures.

2. Démarrage de l'ektacytomètre

1. Allumez l'ordinateur et l'ektacytomètre à partir de l'arrière. Démarrer le logiciel (Tableau des matériaux) sur l'ordinateur.
2. Assurez-vous que l'azote est disponible pour désoxygéner l'échantillon en ouvrant le cylindre d'azote.
3. Baisser le bob dans la tasse et assurez-vous que la tasse peut tourner librement. Nettoyez la tasse à l'intérieur et à l'extérieur avec un chiffon doux et de l'eau distillée, car les débris peuvent entraver les mesures de l'ie.
4. Lorsque le logiciel est en cours d'exécution, vérifiez le message suivant à l'écran:"Assurez-vous que la soupape de gaz est ouverte" et cliquez sur OK.
5. Assurez-vous que l'ektacytomètre démarre le processus d'auto-vérification pO₂ qui apparaîtra à l'écran. Sélectionnez Démarrer (entrez). En cas d'échec, réexécutez l'auto-vérification en cliquant sur La vérification du matériel pO₂ - France Auto-vérification.
   REMARQUE : Si l'auto-vérification échoue à nouveau, envisagez de remplacer le point O_2. L'O_2-spotest remplacé par pousser doucement l'endroit de l'intérieur de la tasse avec un bout du doigt. Un nouvel endroit est placé en poussant doucement l'endroit de l'extérieur dans la tasse.
6. Choisissez l'analyse pO₂ des différents tests énumérés sur la gauche. Choisissez Paramètres à droite de l'écran et assurez-vous qu'ils sont réglés selon les paramètres énumérés dans le tableau 1. Conservez les mêmes réglages pour chaque mesure.
7. Afin d'enregistrer ces paramètres, appuyez sur OK . OK.
   REMARQUE : Les paramètres privilégiés sont énumérés dans le tableau 1, mais peuvent être ajustés en fonction des préférences de l'utilisateur et des fins d'enquête. Par exemple, pour étudier plus en détail le comportement de faucille, la vitesse et la durée de désoxygénation peuvent être modifiées.

3. Collecte et préparation d'échantillons

REMARQUE : Pour la validation de la technique, l'acide tétraacétique d'éthylènediamine (EDTA) a traité le sang de 38 patients de SCD et 5 contrôles sains inclus au centre médical d'université Utrecht ou au centre d'hématologie des enfants du Texas, dans différentes études cliniques ( L'identifiant du Registre néerlandais des essais (NTR], NTR 6779 et NTR 6462), ainsi que les échantillons de sang des restes anonymisés de patients qui ont visité la clinique externe ou ont été hospitalisés ont été utilisés.

1. Recueillir des échantillons de sang par venipuncture (un minimum de 300 L/échantillon) dans un tube contenant DE l'EDTA. Assurez-vous que le sang a été stocké pendant au moins 30 min à 4 oC, mais pas plus de 24 h.
   REMARQUE : On peut également utiliser l'adénine de dextrose de phosphate de citrate (CPDA) ou l'héparine, mais l'influence de ces réactifs sur la préservation de l'échantillon en ce qui concerne l'ektacytométrie du gradient d'oxygène n'est pas bien connue.
2. Mélanger l'échantillon doucement par inversion pour homogénéiser. Ne secouez pas l'échantillon. Laisser l'échantillon se réchauffer à température ambiante sur un banc à rouleaux avant la mesure.
   REMARQUE : Un tube d'échantillon (9 à 10 ml) qui est stocké pendant plus de 1 h à 4 oC doit se réchauffer pendant 15 min. Lorsqu'il est entreposé pendant moins de 1 h à 4 oC, il doit se réchauffer pendant 10 min. Un tube d'échantillon (2 à 6 ml) qui est stocké pendant plus de 1 h à 4 oC doit se réchauffer pendant 10 min. Lorsqu'il est entreposé pendant moins de 1 h à 4 oC, il doit se réchauffer pendant 5 min.
3. Mesurez le nombre sanguin complet sur un analyseur d'hématologie. Pour ce faire, prenez 20 à 200 l de sang entier dans un tube contenant de l'EDTA. Placez l'aiguille d'aspiration dans le tube et appuyez sur le bouton derrière l'aiguille de l'analyseur d'hématologie pour commencer la mesure.
   REMARQUE : Dans la numération sanguine complète, le nombre de RBC est mesuré, ce qui est un facteur important pour normaliser les mesures d'ektacytométrie du gradient d'oxygène. Le nombre de RBC est calculé à partir de la diffusion vers l'avant et latérale par cytométrie d'écoulement. Le nombre normal de RBC dans les contrôles sains est de 3,7 à 5,0 x 10¹²/L pour les femmes et de 4,2 à 5,5 x 10¹²/L pour les hommes. Le nombre de RBC chez les patients atteints de MTS est généralement diminué. Certains analyseurs d'hématologie mesureront également pour cent les globules rouges denses (% DRBC) qui peuvent être d'une valeur supplémentaire dans l'interprétation des courbes individuelles d'ektacytométrie de gradient d'oxygène.
4. Normaliser l'échantillon de sang entier à un nombre de RBC de 200 x 10⁶ RBC dans 5 ml de PVP (200 x 10⁶ RBC/vial) en ajustant le volume d'échantillon qui sera ajouté. Si le nombre total de RBC est inférieur à 200 x 10⁶, le modèle de diffraction et l'ie-seconde seront touchés.
   1. Utilisez l'équation ci-dessous pour effectuer le comptage.
      4.0/xx (x 10¹²/L) x 50 'yy 'L sang entier/vial PVP
      où xx est le nombre calculé de RBC obtenu à partir de l'étape 3.3 et yy est la quantité de sang entier qui est nécessaire pour la mesure réelle. Selon la qualité de l'anémie et d'autres facteurs influençant le nombre de RBC, la quantité de sang entier requise est de 40 à 90 L.

4. Mesure d'ektacytométrie de gradient d'oxygène

1. Pipette le volume d'échantillon calculé (yy l de sang) en PVP pour obtenir un volume total de 5 ml. Préwet la pointe en rependant doucement le sang 3x. Utilisez une pointe de pipette avec une grande ouverture pour éviter un stress supplémentaire sur les RBC. Mélanger délicatement l'échantillon manuellement par inversion jusqu'à ce qu'il soit homogène.
   REMARQUE : Ouvrez le flacon PVP aussi peu que possible pour éviter le contact avec l'air.
2. Puiser lentement 2,0 ml du mélange sang/PVP dans une seringue de 3 ml sans l'aiguille. Poussez le piston pour enlever les bulles d'air visibles et la solution d'échantillon excessive jusqu'à ce que 1,5 à 1,8 ml soit laissé dans la seringue (selon le volume de la tasse).
3. Injectez le volume total de l'échantillon lentement et uniformément dans le bob à travers le connecteur. Assurez-vous que le niveau de l'échantillon est au-dessus du capteur d'oxygène (tache rose) et au-dessus du petit trou d'aspiration. Ne laissez aucune solution d'échantillon dans la seringue.
4. Cliquez sur Nouveau et remplissez l'identifiant de l'échantillon, les remarques, la date du don et la viscosité du PVP. Cliquez sur OK Aspirate. Après 60 s, la tasse tournera et aspirera l'échantillon pendant 15 s. Cliquez OK lorsque la rotation s'arrêtera. Fermez le couvercle de la machine. Cliquez sur Continuer Commencez dès maintenant,car l'ektacytométrie de gradient d'oxygène se fait avec un gain fixe. La mesure prendra environ 28 min.
5. Après la mesure, imprimez le rapport qui affiche la courbe et les paramètres qui sont automatiquement calculés par le logiciel. Assurez-vous que les données brutes sont automatiquement stockées dans le dossier désigné dans Paramètres. L'ie maximale (EI_max),l'ie minimum (EI_min),le pO₂à 95 % de l'IE (PoS) et la zone (zone sous la courbe) sont automatiquement calculés et ajoutés au rapport imprimé et aux données brutes.
6. Obtenir manuellement l'EIe en calculant la différence entre l'IE_max et l'IE_min. Calculez la récupération en pourcentage en prenant la différence d'eI moyenne avant la désoxygénation (pO₂ 100-120 mmHg) et les valeurs moyennes de l'IE pendant la réoxygénation à 100 à 120 mmHg.

5. Nettoyage de l'ektacytomètre

1. Retirez la seringue de l'échantillon et remplacez-la par une seringue remplie d'eau distillée ou d'eau déionisée.
2. Appuyez sur Clean, rincer lentement le connecteur pendant le rinçage. Assurez-vous de rincer dans les deux directions.
3. Retirez la seringue et soulevez le bob. Séchez le bob, la tasse et le connecteur à fond avec un chiffon doux.
4. Utilisez une grande seringue (10 à 50 ml) pour rincer le connecteur afin d'enlever toute l'eau restante dans les tubes et le bob. Bloquer l'anse/sortie inférieure du bob pour récupérer la pression dans les tubes, enlevant ainsi l'eau restante.
5. Baissez le bob dans la tasse. La machine est maintenant prête pour la prochaine mesure.

6. Arrêt de la machine

1. Assurez-vous que la machine est correctement rincée après la dernière mesure, comme décrit ci-dessus. Assurez-vous que les tubes appropriés se rapportent à la solution de nettoyage.
2. Fermez le logiciel, appuyez sur Fermer et appuyez sur Démarrer pour commencer le programme de nettoyage de fin de journée.
3. Après avoir terminé tout le programme de nettoyage, retirez la seringue et soulevez le bob. Rincer le connecteur avec une grosse seringue.
4. Vider la bouteille de déchets et sécher le bob et la tasse avec un chiffon doux. Rincer le connecteur afin d'enlever l'eau restante dans les tubes et le bob. Bloquer l'anse/sortie inférieure du bob pour récupérer la pression dans les tubes, enlevant ainsi toute eau restante.
5. Fermez le couvercle de la machine. Fermez le cylindre d'azote. Éteignez l'ordinateur et la machine.

Résultats

L'ektacytométrie de gradient d'oxygène peut être employée pour caractériser le comportement de faucille dans les patients présentant Le SCD. Dans cette étude, des échantillons de sang d'un total de 38 patients de SCD et de cinq contrôles sains ont été inclus. Dans les contrôles sains, le modèle de diffraction est circulaire au repos et elliptique à un stress de cisaillement plus élevé⁴. À partir du modèle de diffraction elliptique, l'indice d'allongement (IE) est calculé en fonction de la hauteur et de la largeur du modèle de diffraction. Dans l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, la désoxygénation lente et continue de l'échantillon par le gaz azoté est suivie d'une réoxygénation rapide par l'air ambiant. Dans ces conditions, on peut observer la dilatation de RBC sous la désoxygénation. Cela entraînera une distorsion du modèle de diffraction parce que les globules rouges faucillés ne s'aligneront pas correctement sous le stress de cisaillement appliqué. Par conséquent, ils semblent être moins déformables que les RBC en bonne santé(figure 2).

Figure 3A montre comment les CRC de faucille changent de forme lors de la désoxygénation, qui imite les conditions pendant l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, tandis que les RBCs de faucille de contrôle sans désoxygénation ne montrent aucun changement dans la forme. Ce processus entraîne une distorsion du modèle de diffraction pendant l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, et donc une diminution de l'IE. La figure 3B montre les différents modèles de diffraction à partir desquels différents paramètres sont générés.

Une courbe représentative obtenue par l'ektacytomètre est indiquée dans la figure 3C. Six paramètres reflètent différentes caractéristiques du comportement de faucillement des RBC : l'IE_max est l'IE maximale au début de la mesure avant la désoxygénation. Ce paramètre représente la position de base et reflète la déformabilité globale de la population totale de RBC à l'air ambiant. L'IE_min est l'IE minimale, ce qui représente une déformation minimale après la désoxygénation. Ce paramètre reflète les changements dans la forme et l'orientation des RBC (sickle) lors de la désoxygénation. La différence entre l'Ie_max et l'EI_min, qui indique combien de cellules peuvent dilocycité au cours d'une série de désoxygénation. 5% Point de Sickling (PoS_5%) est le pO₂ (mmHg) à laquelle une diminution de 5% de l'IE_max pendant la désoxygénation est mesurée. Cela représente la tension d'oxygène où le processus de faucille commence. La zone reflète la zone sous la courbe, qui est déterminée par un calcul intégral des mesures de l'IE et du pO₂ entre 100 mmHg et pO₂min (mmHg). C'est le résultat des paramètres précédemment décrits EI_max, EI_min, et PoS. La récupération représente la différence de l'IE au cours de la dernière partie de la réoxygénation par rapport à l'IE à la ligne de base. Les deux valeurs de l'IE sont mesurées à un pO₂ de 100 à 120 mmHg. Ce paramètre reflète la capacité des RBC qui faucille pendant la désoxygénation pour inverser la faucille pendant la réoxygénation²². Les paramètres des mesures en double avaient généralement un coefficient de variation (CV) (lt;5% (médiane de 1,83%). Dans le cas où un CV a été obtenu de 5 %, une troisième mesure a été effectuée. Les paramètres EI_max et Recovery sont les plus reproductibles avec les CV médians de l'iefixe;1%.

Les courbes représentatives des RBC des contrôles sains, des patients présentant des traits de HbS (HbS hétérozyygous), et d'un patient homozygote de SCD sont montrées dans la figure 4A. La courbe représentative du patient hbSC montre un rétablissement plus faible, ce qui pourrait indiquer un processus de faucille différent (figure 4B). Les courbes représentatives des patients atteints de HbSS traités par hydroxyurée (HU) et transfusionnel sont indiquées dans la figure 4C et la figure 4D. De toute évidence, il y a une grande différence entre les courbes représentatives des traits HS (cellules HbAS) et des RBC des patients atteints de HbSS traités par transfusion (composé d'un mélange de faucille homozygote (HbSS) et de cellules normales homozygotes (HbAA), Figure 4A ,D). Les différences évidentes dans les courbes du patient non traité de SCD et des patients HU et transfusion-traités accentuent l'utilité de cet assay (figure 4C,D). Les niveaux de HbF et de HbS se sont corrélés de façon significative avec l'IE_min et, dans une moindre mesure, avec le PoS (Figure 5AetD). Ceci indique que les paramètres de laboratoire qui sont importants dans l'évaluation du patient sont également reflétés dans l'ektacytométrie de gradient d'oxygène. Le nombre de cellules faucillées à la normoxie et le pourcentage de RBC denses (DRBC) influencent tous deux les valeurs eImax, car elles sont significativement corrélées (Figure 5E-F), ce qui indique que eImax reflète un autre facteur important dans le processus de faucille. Ces résultats montrent comment différentes caractéristiques telles que le %HbS, le %HbF, les cellules faucillées à la normoxie et les %DRBCinfluences influencent différents paramètres.

Figure 1. Configuration schématique de l'ektacytomètre. L'ektacytomètre utilise un système Couette pour appliquer le stress de cisaillement sur les cellules. Un cylindre extérieur de rotation (tasse) et un cylindre intérieur statique (bob) sont employés pour induire le stress de cisaillement par la création du flux laminaire à 37 oC. Entre le bob et la tasse il y a un petit écart dans lequel la suspension de sang est injectée. Un faisceau laser brille du bob à travers la suspension de sang et est dispersé par la présence de RBC. Le modèle de diffraction est projeté et analysé par une caméra. L'indice d'allongement (IE) est calculé avec la hauteur (a) et la largeur (b) du modèle de diffraction⁴. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Configuration schématique de l'ektacytomètre avec module d'ektacytométrie de gradient d'oxygène. Diagramme schématique du module qui montre la désoxygénation de la suspension sanguine lentement avec l'infusion de gaz azoté (N₂). La tension d'oxygène est mesurée par la quantité d'étanchéité du signal de luminophore envoyé de la fibre LED au O₂-spot. Lors de la désoxygénation, les RBC de faucille commenceront à faucille, leur déformation diminuera, et ils ne s'aligneront plus avec les RBCelli. Les RBC faucillés déformeront le motif de diffraction, changeant sa forme d'une ellipse à une forme rhomboide ou diamant-like. Ce changement dans la forme du modèle de diffraction entraîne une diminution de l'IE. Les mesures de pO₂ et d'IE ne sont pas effectuées à la même hauteur dans la tasse. Cela assure une meilleure discrimination entre les courbes de désoxygénation et de réoxygénation et, par conséquent, une meilleure interprétation de la courbe. Ce chiffre a été modifié à partir de Rab et al.²²S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Courbe d'ektacytométrie et modèles de diffraction de gradient d'oxygène représentatifs. (A) Lors de la désoxygénation dans des conditions similaires à l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, des RBC de faucille ont été fixés. Dans les CRC de faucille de contrôle, les mêmes conditions ont été employées, mais sans gaz azoté. Les RBC saucisons désoxygénés montrent un changement de forme contrairement aux RBCs de contrôle. (B) Lors de la désoxygénation et de l'effort de cisaillement (30 Pa), le modèle de diffraction change d'une ellipse à une rhomboide. (C) Courbe représentative de l'ektacytométrie de gradient d'oxygène. L'indice maximal d'allongement (EI_max) représente la position de référence et montre une déformabilité globale de la population totale de RBC. L'IE minimale (EI_min) représente une déformation minimale, qui est causée par le changement de forme et d'orientation des RBC lors de la désoxygénation. L'EEI (dEI, la différence d'eIe entre l'IE_max et l'iem) montre combien de cellules peuvent dilaure au cours d'une série de désoxygénation. Le point de faucille (PoS, pO₂ à 5% de diminution de l'IE) montre la tension d'oxygène lorsque les premiers RBC commencent à faucille. La zone sous la courbe (à partir de pO_2min '100 mmHg) est calculée dans la zone du paramètre. Cela résume L'IE_max, EI_min, et PoS. La capacité des cellules faucillées à se désamarrer pendant la réoxygénation est représentée dans le paramètre Récupération (pourcentage d'Ie_max atteint pendant la réoxygénation). Pour faciliter l'interprétation, tous les points de données ont été connectés dans chaque expérience individuelle par une ligne pour présenter graphiquement les résultats. Ce chiffre a été modifié à partir de Rab et al.²²S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. Les paramètres d'ektacytométrie de gradient d'oxygène sont corrélés avec le génotype et les régimes de traitement des patients atteints de MTS atteints de MTS. (A) Graphique représentatif des RBCdes des porteurs de HbS (caractère de HbS) et des contrôles sains en ce qui concerne les patients non traités de HbSS. (B) Graphique représentatif des RBC des patients présentant la maladie d'hémoglobine de SC (HbSC) en relation aux patients non traités de HbSS. (C) Graphique représentatif des RBCs des patients homozygous homozygous de SCD de traitement d'hydroxyurea (HBSS HU) en relation aux patients non traités de HbSS. (D) Graphique représentatif des RBCdes des patients de HbSS traités avec la transfusion sanguine (transfusion de HbSS) en ce qui concerne les patients non traités de HbSS. Ce chiffre a été modifié à partir de Rab et al.²²S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5

Discussion

Ici, nous décrivons l'ektacytométrie de gradient d'oxygène, une méthode qui peut être employée pour étudier le comportement de faucille des globules rouges des patients de SCD sous une gamme des concentrations d'oxygène(figure 4 et figure 5). Afin d'obtenir des résultats reproductibles, il est important d'identifier les facteurs qui influencent les résultats. Par exemple, la température a un impact important sur la déformation de RBC, principalement en raison de ses effets sur l'épaisseur de la solution visqueuse (PVP). Nous vous recommandons d'effectuer une mesure d'essai en début de journée pour chauffer complètement la machine à 37 oC. Cela permettra d'améliorer la reproductibilité des résultats. L'osmolarité de la solution visqueuse devrait être dans une plage étroite (282-286 mOsm/kg pour PVP), parce que l'osmolarité influence l'état d'hydratation, qui à son tour affecte la déformation RBC. Le pH et la viscosité du PVP devraient également être étroitement réglementés. Les différences de pH et de température peuvent influencer les courbes de façon spectaculaire²². En outre, l'eau restante dans la tasse, le bob, et les tubes, peut causer la lyse des RBCs, ayant de ce fait en conséquence des données incorrectes, parce que moins de RBC intacts présents dans la tasse seront mesurés.

Les paramètres pour effectuer l'ektacytométrie de gradient d'oxygène peuvent être ajustés pour répondre à des questions d'investigation spécifiques. Les paramètres privilégiés sont énumérés dans le tableau 1. Un temps de désoxygénation de 1.300 s a été choisi basé sur des observations montrant que l'extension de la désoxygénation n'a pas eu comme conséquence une_minute inférieure d'Ie pour la plupart des patients. En revanche, le raccourcissement du temps de désoxygénation entraverait la puissance discriminative de l'ektacytométrie de gradient d'oxygène. Le temps de réoxygénation a été fixé à 280 s en raison de la résolution rapide des polymères HbS pendant la réoxygénation, et la restauration concomitante de l'IE vers des valeurs mesurées avant la désoxygénation. Le stress de cisaillement a été réglé à 30 Pa, qui est analogue à l'ektacytométrie de gradient osmotique. L'abaissement de ce paramètre pourrait entraver la puissance discriminative. Le contrôle de la désoxygénation peut être utilisé si un ensemble de vitesse de désoxygénation est appliqué à chaque échantillon de patient. Dans nos arrangements préférés, cette option a été éteinte parce que le taux de désoxygénation est patient-spécifique dû à la courbe unique de dissociation d'hémoglobine. Par conséquent, l'allumage du contrôle de désoxygénation éliminerait cette caractéristique de l'assay. Cependant, cette caractéristique de l'ektacytométrie de gradient d'oxygène est toujours à l'étude.

Plusieurs facteurs bien connus influencent les paramètres d'ektacytométrie du gradient d'oxygène, à savoir le pH, la température et l'osmolarité. L'ektacytométrie, en particulier le PoS, est influencée par 2,3-diphosphoglycérisat (2,3-DPG)²². En outre, il existe une corrélation claire entre le %HbF et le_minde l'IE , et dans une moindre mesure PoS (Figure 5A-D). L'Ie_max est associée à des cellules faucille à la normoxie, ce qui peut expliquer l'observation que peu de temps après un COV, la déformation RBC à la normoxie (EI_max), est plus élevée. Ce dernier est causé par la destruction des cellules les plus faucillées, et donc moins de RBC sifformables pendant le COV^16. Comme le montre la figure 5F, les RBC plus denses en % (définis comme des RBC avec une concentration d'hémoglobine à 1,11 mg/mL) sont fortement corrélés avec un taux d'e-i_maxinférieur. Cela indique que les cellules denses sont un facteur important dans la déformation de RBC à la normoxie, semblable aux résultats précédemment rapportés¹.

La normalisation des échantillons est très importante pour obtenir des résultats reproductibles et pour distinguer les différents génotypes et traitements. Il est important de corriger le nombre de RBC, car le nombre de RBC influence l'intensité du modèle de diffraction. Si des nombres de RBC plus faibles sont présents dans l'écart entre le bob et la tasse, la courbe se déplacera vers le haut et vers la gauche. En outre, la courbe fluctue, ce qui entrave le calcul précis des paramètres, en particulier le PoS.

Une limitation de cette technique est que la valeur de l'IE représente une moyenne de toutes les cellules, y compris les différentes sous-populations. L'hétérogénéité des populations de RBC chez les patients atteints de SCD et son influence sur la mesure de l'ektacytométrie ont été étudiées de façon intensive. Il en est résulté une normalisation dans laquelle la taille du modèle de diffraction est ajustée à une valeur fixe au lieu d'être corrigée pour le compte^{RBC 23,24}. La question de savoir si ce mode de normalisation devrait également être appliqué aux mesures d'ektacytométrie du gradient d'oxygène est actuellement à l'étude.

Plusieurs techniques pour mesurer la déformation de RBC dans des conditions hypoxiques ont été développées basées sur une étape de désoxygénation qui a eu lieu en dehors de l'ektacytomètre^25,26,27. Dans ces conditions, des différences dans le comportement cellulaire n'ont pas été observées entre les patients présentant des traits de HbS et des contrôles sains sous le pH physiologique^25. L'ektacytométrie de gradient d'oxygène, cependant, montre clairement un PoS faible mais évident chez les individus avec des traits de HbS (Figure 4A). À ce jour, dans la pratique clinique courante, les seules méthodes alternatives pour mesurer la tendance des RBC d'un patient individuel à la faucille in vitro comprennent un essai de faucille basé sur la morphologie : les RBC sont incubés dans des conditions qui favorisent la polymérisation hbS, telles que faible tension d'oxygène ou faible pH. Un fixatif est ajouté après l'incubation et le pourcentage de cellules faucillées est compté manuellement ou numériquement à l'aide de la microscopie légère. Beaucoup d'essais pharmacologiques précliniques et de phase précoce emploient l'essai de faucillage pour produire une variable secondaire de résultat pour pouvoir prévoir l'efficacité clinique dans SCD^{28,29,30,31 ,32}. Cependant, il prend du temps, la variabilité est élevée et la sensibilité est faible, la technique n'est pas automatisée et, par conséquent, la main-d'œuvre intensive. De plus, les changements morphologiques dus à la faucille pourraient ne pas être corrélés avec les paramètres physiologiques, comme la déformation de RBC, parce qu'il s'agit d'un analyse statique en deux dimensions².

L'ektacytométrie de gradient d'oxygène fournit un essai fonctionnel de faucille qui est rapide et reproductible. Il s'agit d'un test in vitro qui ne tient pas compte de la surface endothéliale. Cependant, il fournit des aspects fonctionnels du comportement de drépanocytose et des caractéristiques de RBC, ce qui en fait une technique prometteuse pour les études de drépanocytose. Les applications futures de la technique incluent la surveillance de l'efficacité du traitement chez les patients atteints de MTS, servir de biomarqueur pour de nouvelles stratégies de traitement, l'étude du comportement décenséens, et la surveillance du chimérisme après la transplantation de cellules souches dans SCD.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ADVIA 120 Analyseur d’hématologie	Siemens	067-A004-14	Instrument
Cell-Dyn Sapphire Analyseur d’hématologie	Abbott	8H00-01	Instrument
Lorrca	RR Mécatronique	LORC109230 ou LORC109110	Instrument
Lorrca Version du logiciel V5.08	RR Mécatronique-Logiciel
Azote gazeux 4.8 ou 5.0	Local	-
O2-spot	RR Mécatronique	PO2S020153	Mesure de l’O2
Module de balayage d’oxygène (pO2scan)	RR Mécatronique	PO2S109000	Add-on
Oxy-ISO	RR Mécatronique	QRR 030905	Solution visqueuse
X-Clean	RR Mécatronique	QRR 010946	Solution de nettoyage Lorrca