Article de méthode

Visualiser la morphologie de l'astrocyte à l'aide de lucifer Yellow Iontophoresis

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DOI :

10.3791/60225

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14 septembre 2019

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1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.

Résumé

Les astrocytes sont des composants essentiels des circuits neuronaux. Ils carirent l'ensemble du système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans une variété de fonctions, qui comprennent le dégagement des neurotransmetteurs, la régulation des ions, la modulation synaptique, le soutien métabolique aux neurones, et la régulation du flux sanguin. Les astrocytes sont des cellules complexes qui ont un soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus fins qui contactent divers éléments cellulaires dans le neuropil. Afin d'évaluer la morphologie des astrocytes, il est nécessaire d'avoir une méthode fiable et reproductible pour visualiser leur structure. Nous rapportons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis intracellulaire des astrocytes utilisant le colorant jaune fluorescent de Lucifer (LY) dans le tissu de cerveau légèrement fixé des souris adultes. Cette méthode a plusieurs caractéristiques qui sont utiles pour caractériser la morphologie des astrocytes. Il permet la reconstruction tridimensionnelle des astrocytes individuels, ce qui est utile pour effectuer des analyses morphologiques sur différents aspects de leur structure. L'immunohistochimie avec l'iontophoresis de LY peut également être employée pour comprendre l'interaction des astrocytes avec différents composants du système nerveux et pour évaluer l'expression des protéines dans les astrocytes étiquetés. Ce protocole peut être mis en œuvre dans une variété de modèles murins de troubles du SNC pour examiner rigoureusement la morphologie des astrocytes avec microscopie légère. LY iontophoresis fournit une approche expérimentale pour évaluer la structure des astrocytes, en particulier dans le contexte de blessures ou de maladies où ces cellules sont proposées pour subir des changements morphologiques importants.

Introduction

Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Ils jouent des rôles dans l'homéostasie ionique, la régulation du flux sanguin, la formation de synapse ainsi que l'élimination, et l'élimination des neurotransmetteurs1. La large gamme de fonctions d'astrocyte se reflète dans leur structure morphologique complexe2,3. Les astrocytes contiennent plusieurs branches primaires et secondaires qui se divisent en milliers de branches et de folioles plus fines qui interagissent directement avec les synapses, les dendrites, les axones, les vaisseaux sanguins et d'autres cellules gliales. La morphologie des astrocytes varie selon les régions du cerveau, ce qui peut indiquer leur capacité à remplir leurs fonctions de façon différentielle dans les circuits neuronaux4. En outre, les astrocytes sont connus pour modifier leur morphologie au cours du développement, pendant les conditions physiologiques, et dans les états de maladie multiples3,5,6.

Une méthode cohérente et reproductible est nécessaire pour résoudre avec précision la complexité de la morphologie des astrocytes. Traditionnellement, l'immunohistochimie a été utilisée pour visualiser les astrocytes avec l'utilisation de marqueurs de protéines enrichis d'astrocytes ou d'astrocytes. Cependant, ces méthodes révèlent le modèle d'expression des protéines plutôt que la structure de l'astrocyte. Les marqueurs couramment utilisés, tels que la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la protéine de liaison du calcium S100 (S100), ne s'expriment pas dans l'ensemble du volume cellulaire et ne résolvent donc pas la morphologie complète7. Les approches génétiques pour exprimer les protéines fluorescentes de façon omniprésente dans les astrocytes (injections virales ou lignes transgéniques de reporter de souris) peuvent identifier les branches plus fines et le territoire global. Cependant, il est difficile de différencier les astrocytes individuels, et les analyses peuvent être biaisées par la population d'astrocytes ciblée par le promoteur spécifique8. La microscopie électronique de section série a été employée pour indiquer une image détaillée des interactions des processus d'astrocyte avec des synapses. En raison des milliers de processus d'astrocyte s'entrelaçant des synapses, il n'est actuellement pas possible de reconstruire une cellule entière avec cette technique9, bien que cela devrait changer avec l'utilisation d'approches d'apprentissage automatique pour l'analyse des données.

Dans ce rapport, nous nous concentrons sur une procédure pour caractériser les astrocytes de souris utilisant l'iontophoresis intracellulaire avec le colorant jaune de Lucifer (LY), utilisant le radiatum de strate de CA1 comme exemple. La méthode est basée sur des travaux passés pionniers par Eric Bushong et Mark Ellisman10,11. Les astrocytes des tranches de cerveau légèrement fixes sont identifiés par leur forme distinctive de soma et remplis de LY. Les cellules sont ensuite représentées avec une microscopie confocale. Nous démontrons comment l'iontophoresis de LY peut être employé pour reconstruire les astrocytes individuels et effectuer des analyses morphologiques détaillées de leurs processus et territoire. En outre, cette méthode peut être appliquée en conjonction avec l'immunohistochimie pour identifier les relations spatiales et les interactions entre les astrocytes et les neurones, d'autres cellules gliales, et la vascularisation du cerveau. Nous considérons l'iontophoresis de LY comme un outil très approprié pour analyser la morphologie dans différentes régions du cerveau et modèles de souris des conditions saines ou de la maladie7,12,13.

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Protocole

Les expériences sur les animaux dans cette étude ont été effectuées conformément au National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Comité de recherche sur les animaux du chancelier à l'Université de Californie à Los Angeles. Des souris adultes (6 à 8 semaines) de sexe mixte ont été utilisées dans toutes les expériences.

1. Préparation de la solution

  1. Solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
    1. Préparer une solution ACSF fraîche (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mM NaHCO3, 11 mM D-glucose, 1,25 mM Na2HPO4, et 2 mM CaCl2) avant chaque expérience. Ajouter MgCl2 et CaCl2 dans la dernière étape. Dissoudre les composants dans de l'eau déionisée de haute qualité.
    2. Incuber la solution ACSF à 35 oC dans un bain d'eau et une bulle avec 95 % o2/ 5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes avant l'expérience.
    3. Ajouter 2 % d'hydrochlorure de lidocaïne pour atteindre une concentration finale de 0,02 % en ACSF (en 100 ml).
  2. Solution fixative
    1. Utilisez 10% de phosphate tamponné par formaline.
  3. Solution de teinture LY
    1. Préparer 1,5% LY solution de colorant en dissolvant LY CH sel de dilithium ou LY CH sel de dipotassium dans 5 mM KCl. Vortex à fond. Un volume de 1 ml est suffisant pour plusieurs expériences.
    2. Centrifugeuse pendant 10 min à 16 800 x g. Ensuite, filtrez le supernatant à l'emporte-sa vie avec un filtre à seringues de 0,2 m dans un nouveau tube. Les Aliquots peuvent être conservés à 4 oC jusqu'à 3 mois.
      REMARQUE: Il est essentiel de centrifuger et de filtrer la solution de colorant pour empêcher l'agrégation des particules de colorant, qui peuvent obstruer l'électrode.

2. Perfusion transcarique de souris et dissection de cerveau

  1. Préparation de l'équipement et de la souris pour perfusion transcardique
    REMARQUE:     Les souris C57/BL6 de l'un ou l'autre sexe peuvent être utilisées. Il a été empiriquement observé que pour que la méthode fonctionne de manière fiable, il est important que les souris ne soient pas plus âgées que 3 mois (6 à 8 semaines est idéale). Le protocole de perfusion est décrit ci-dessous. Une référence supplémentaire est fournie pour plus de détails14.
    1. Tubes de perfusion clairs avec la solution ACSF pour éliminer les bulles d'air dans la ligne. Mettre en place des outils chirurgicals par ordre d'utilisation (pinces, ciseaux courbés, émoussés, ciseaux à l'iris).
    2. Anesthésiez profondément la souris en la plaçant dans une chambre d'induction isoflurane, après avoir ajouté 2 à 3 ml d'isoflurane à la chambre. Laisser entrer en vigueur l'anesthésique d'une mi-temps. Assurez-vous que la respiration ne s'arrête pas.
    3. Test pour le réflexe de pincement des orteils. Procédez lorsque la souris ne réagit pas au stimulus de la douleur et que le réflexe est absent. Fixez l'animal en position de supine avec la tête placée dans le cône respiratoire avec un approvisionnement de 5% d'isoflurane en oxygène et les membres et la queue scotchés à l'intérieur d'une hotte de fumée chimique.
  2. Perfusion transcardique
    1. À l'aide d'une pince à épiler, soulever la peau sous la cage thoracique. Faire une incision de 5 à 6 cm avec les ciseaux courbés et émoussés à travers la peau pour exposer la cavité abdominale. Couper vers le haut à travers la paroi abdominale jusqu'à ce que le foie et le diaphragme soient visibles.
    2. Éloignez doucement le foie du diagramme. À l'aide de ciseaux à l'iris, faire une incision latérale de 3 à 4 cm dans le diaphragme.
    3. Couper à travers la cage thoracique le long des deux côtés du corps pour exposer la cavité thoracique. Veillez à ne pas endommager le cœur et éviter les poumons. Soulevez le sternum pour exposer le cœur.
    4. Une fois que le cœur est visible, injecter 0,05 ml de solution héparine de sodium (1 000 USP par mL) dans le ventricule gauche comme anticoagulant. Ensuite, insérez soigneusement l'aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Assurez-vous que l'aiguille reste dans le ventricule et ne perce pas à travers d'autres chambres cardiaques. Faire une petite incision dans l'atrium droit avec des ciseaux d'iris.
    5. Perfiliser avec la solution ACSF à un taux d'environ 10 ml/min jusqu'à ce que le liquide existant le corps soit dégagé du sang (1-2 min).
    6. Passez de la solution ACSF à la solution fixative sans introduire de bulles d'air. Perfuser d'une solution fixative pendant 10 min à 10 x 20 ml/min.
      MISE EN GARDE: Veillez à ce qu'aucune solution fixative ne s'écoule du nez. Ceci indique que l'aiguille a atteint le ventricule droit et le fixatif se déplace aux poumons plutôt que par le circuit systémique au reste du corps.
  3. Dissection du cerveau
    1. Retirez la tête de la souris avec des ciseaux et disséquez soigneusement le cerveau de la souris du crâne. Placer dans une solution fixative pendant 1,5 h à température ambiante pendant une courte période de post-fixation.
      REMARQUE: Une bonne perfusion est nécessaire pour réussir l'iontophoresis LY. Le cerveau doit être de couleur blanche et absent du sang dans la vascularisation du cerveau. Le corps et les membres doivent sembler raides.

3. Préparation de tranche

  1. Préparation des tranches hippocampal
    1. Laver le cerveau avec 0,1 M de phosphate tamponné saline (PBS) à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, séchez le cerveau avec du papier filtre et retirez l'ampoule olfactive et le cervelet avec une lame de rasoir pointue.
    2. Montez le cerveau sur le plateau de vibratome à l'aide de colle cyanoacrylate et remplissez le plateau avec PBS à température ambiante. Couper les sections coronales hippocampales d'une épaisseur de 110 m.
      REMARQUE: Ajuster le réglage du vibratome pour s'assurer que les tranches ont la même épaisseur et même la surface. Pour cette expérience, un réglage de vitesse de 4,5 et un réglage de fréquence de 8 ont été utilisés, qui sont des paramètres arbitraires sur l'instrument (Tableau des matériaux). Les utilisateurs peuvent avoir besoin d'expérimenter avec les paramètres sur d'autres appareils.
    3. Recueillir les sections du plateau et les placer dans un plat de PBS sur la glace.

4. Préparation à l'électrode

  1. Préparer une électrode pointue avec une résistance appropriée.
    1. Utilisez une électrode en verre borosilicate à baril unique avec filament (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Tirez une électrode sur un puller micropipette (Table of Materials). Les électrodes idéales remplies de 1,5 % de LY en 5 mM KCl doivent avoir une résistance de 200 M ' lorsqu'elles sont placées dans un bain de PBS.
      REMARQUE: Le réglage du tireur varie en fonction de l'appareil (type de machine utilisée et filament du tire-lasseur). Un réglage de chaleur plus élevé donne généralement des conseils plus longs et plus fins. Pour le puller micropipette utilisé dans cette expérience, les réglages étaient : chaleur : 317, traction : 90, vitesse : 70, et retard : 70. Un filament de type creux a été utilisé.
    2. Rangez les électrodes dans un contenant fermé pour empêcher la poussière d'entrer dans la pointe. Maintenez les électrodes élevées du bas de la boîte pour empêcher la pointe de se briser.
  2. Remplissez l'électrode avec la solution de colorant LY.
    1. Placez une électrode en position verticale avec la pointe orientée vers le bas. Pipette 1/2 l de solution LY à l'arrière de l'électrode et attendre 5 à 10 min pour que la solution se déplace vers la pointe par action capillaire.
    2. Fixer doucement l'électrode remplie dans le support d'électrode relié à un manipulateur.
      REMARQUE: Le fil argenté du porte-électrodes doit être en contact avec le LY à l'intérieur de l'électrode. Ajuster le volume de la solution LY si nécessaire, en fonction de la longueur du fil.

5. Remplissage des astrocytes avec iontophoresis

  1. Testez l'électrode.
    1. Placer délicatement une tranche de cerveau dans un plat en verre rempli de 0,1 M PBS à température ambiante. Maintenez la tranche en place avec une harpe en platine avec des cordes en nylon.
    2. Assurez-vous que l'électrode est connectée à une source de tension et placez l'électrode du sol dans le bain contenant la tranche de cerveau.
    3. Déplacer l'objectif vers la région du cerveau d'intérêt.
    4. Abaissez l'électrode dans la solution. Sous le champ lumineux, déplacez-le vers le centre du champ de vision et examinez-le attentivement avec la lentille d'immersion d'eau 40x pour s'assurer qu'il semble clair et sans débris ou bulles. S'il y a quelque chose obstruant la pointe de l'électrode, remplacez-la par une nouvelle.
      REMARQUE: Le colmatage est une préoccupation pour l'électrode de 200 M. Avec la centrifugation et la filtration de la solution de colorant avant chaque expérience, cela ne devrait pas être un problème fréquent. Cependant, parce que la pointe de l'électrode est petite, le tissu peut parfois se coincer dans l'ouverture. Les auteurs n'ont pas trouvé un moyen d'empêcher cela, mais il peut être facilement traitée en utilisant simplement une nouvelle électrode.
    5. Observez la pointe de l'électrode sous le microscope à balayage laser confocal avec le laser de 488 nm. Ensuite, testez l'éjection de colorant en allumant le stimulateur à 12 V. Notez un grand nuage de colorant fluorescent autour de la pointe de l'électrode pendant que le stimulateur est allumé. Si aucun colorant ou peu est éjecté lors de la stimulation de tension, remplacez l'électrode.
    6. Sous le champ lumineux, abaissez lentement l'électrode vers la tranche s'arrêtant juste au-dessus de la surface.
  2. Remplissez l'astrocyte d'iontophoresis.
    1. Identifiez les astrocytes à 40 à 50 m sous la surface de la tranche avec le contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC). Recherchez des cellules avec des somatas allongés et ovales d'environ 10 m de diamètre. Une fois qu'un astrocyte est choisi, déplacez-le au centre du champ de vision.
      REMARQUE: Une bonne cellule pour l'iontophoresis a des frontières claires et définies autour d'elle. Ne choisissez pas les cellules trop près de la surface de la tranche parce qu'elles ne peuvent pas être complètement remplies. Il faut un peu de pratique sur quelques jours pour être en mesure d'identifier systématiquement les astrocytes pour le remplissage des colorants. Selon la zone du cerveau utilisée pour l'expérience, le nombre d'astrocytes peut varier. Cela peut affecter le temps nécessaire pour identifier un astrocyte avant le remplissage.
    2. Baissez lentement la pointe de l'électrode dans la tranche, naviguant à travers le tissu, jusqu'à ce qu'elle soit sur le même plan que le corps cellulaire.
      REMARQUE: Déplacez l'électrode lentement pour éviter d'endommager le tissu.
    3. Une fois que le corps cellulaire de l'astrocyte est clairement visible et décrit, avancez lentement et doucement l'électrode vers l'avant. Déplacer l'électrode jusqu'à ce que la pointe empale le soma de la cellule. Déplacez la mise au point de l'objectif lentement vers le haut et vers le bas pour noter si l'électrode est à l'intérieur du soma.
      REMARQUE: La pointe de l'électrode doit être à l'intérieur du corps cellulaire, et une petite indentation sur le soma doit être observée. Ne déplacez pas l'électrode plus loin pour éviter la pointe qui traverse la cellule.
    4. Une fois que la pointe de l'électrode est à l'intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à 0,5 v et éjecterez continuellement le courant dans la cellule. À l'aide du microscope confocal, regardez le remplissage de la cellule. Augmentez le zoom numérique pour voir les détails de la cellule et assurez-vous que la pointe de l'électrode est visible à l'intérieur de la cellule.
      REMARQUE: Abaissez la tension s'il semble que le colorant s'échappe de la cellule ou remplit d'autres cellules dans le voisinage. S'il semble que le colorant fuit encore hors de la cellule, tirez l'électrode lentement et trouvez une autre cellule. Il est important que le colorant ne fuit pas pour avoir un rapport signal/arrière élevé dans l'image finale.
    5. Attendez environ 15 min jusqu'à ce que les branches et les processus plus fins semblent définis, éteignez la tension et retirez doucement la pointe de l'électrode de la cellule.
  3. Image de la cellule remplie.
    REMARQUE :     L'imagerie peut être réalisée immédiatement après le remplissage ou après la coloration avec immunohistochimie. Un objectif avec une ouverture numérique plus élevée (NA) se traduit par une meilleure résolution.
    1. Attendez que la cellule revienne à la forme originale avant l'imagerie (15 à 20 min) avec objectif 40x. Pour imager la cellule, ajustez le réglage sur le confocal pour vous assurer que les branches et les processus plus fins semblent définis.
    2. Configurez une pile z d'une taille d'étape de 0,3 m. Pendant l'imagerie, déplacez l'objectif jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de signal de la cellule et définir que le haut. Ensuite, déplacez l'objectif vers le bas (en se concentrant à travers la cellule) jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de signal, définir que le fond.
    3. Une fois l'imagerie terminée, vérifiez l'éjection de l'électrode. Si un grand nuage de colorant apparaît, il peut être utilisé pour la tranche suivante. Sinon, remplacez-le par une nouvelle électrode.
      REMARQUE: Le remplissage de teinture d'un seul astrocyte et l'imagerie prend environ 45 min à 1 h. Pour cette expérience spécifique, il a été possible d'obtenir environ 3 à 6 cellules par souris. Si nécessaire, plusieurs cellules peuvent être étiquetées sur la même tranche. Cependant, pour distinguer les astrocytes individuels, assurez-vous de garder une distance d'environ 200 m entre les cellules.

6. Staining with Immunohistochemistry (facultatif)

  1. Une fois l'imagerie terminée, placez immédiatement la tranche dans 10 % de formaline sur la glace pour préserver l'immunohistochimie. Gardez les tranches de cerveau dans l'obscurité et conservez-les toute la nuit à 4 oC.
  2. Laver les sections cérébrales 3x en 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic (c.-à-d., Triton X 100) pendant 5 min chacun. Ensuite, incuber dans une solution de blocage de 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionique et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h à température ambiante avec une agitation douce.
  3. Incuber les sections avec de l'agitation dans les anticorps primaires dilués dans 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic et 5% NGS pendant 2 jours à 4 oC.
    REMARQUE: En raison de l'épaisseur des tranches de cerveau, la période d'incubation des anticorps primaires doit être prolongée pour une meilleure pénétration et la concentration d'anticorps peut être augmentée. Dans cette expérience, une dilution de 1:500 a été employée pour l'anticorps anti GFAP et une dilution 1:500 a été employée pour l'anticorps anti aquaporin-4.
  4. Laver les sections 3x en 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic pendant 10 min chacune, puis couver avec des anticorps secondaires dilués dans 0,1 M PBS avec 0,5% de surfactant nonionic et 10% NGS pour 6 h à température ambiante.
    REMARQUE: Ne choisissez pas un anticorps secondaire excité par 488 nm, qui est la longueur d'onde utilisée pour visualiser le colorant LY. Dans cette expérience, une dilution de 1:1 000 a été utilisée pour Alexa Fluor 546 chèvre anti-poulet IgG (H-L) et Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H-L).
  5. Rincer les sections 3x en 0,1 M PBS pendant 10 min chacune. Ensuite, montez les sections sur des lames de microscope en verre dans des supports de montage adaptés à la fluorescence. Scellez les glissières. Cellules d'image à une taille d'étape de 0.3 'm.

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Résultats

Les données rapportées dans cette étude proviennent de cellules de 7 à 12 cellules de 4 souris dans chaque expérience. Les données moyennes sont communiquées dans les panneaux de chiffres, le cas échéant.

Pour évaluer la morphologie des astrocytes, nous avons effectué une iontophoresis intracellulaire à l'aide de colorant LY pour remplir les astrocytes dans le radiatum de la strate CA1, qui est résumé à la figure 1. La figure 2 représente un astro...

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Discussion

La méthode décrite dans cet article décrit une manière de visualiser la morphologie d'astrocyte utilisant l'iontophoresis intracellulaire du colorant de LY dans les tranches légèrement fixes de cerveau. Il y a plusieurs facteurs critiques mis en évidence dans ce protocole qui contribuent à l'iontophoresis réussi de LY et à la reconstruction morphologique des cellules. Un facteur est la qualité et la reproductibilité des images, qui est déterminée en grande partie par l'âge de la souris et le résultat de la perfusion. Dan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient Mme Soto, le Dr Yu et le Dr Octeau pour leurs conseils ainsi que leurs commentaires sur le texte. Ce travail est soutenu par NS060677.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Phosphate de formol tamponné à 10 %FisherSF 100-20Une alternative identique peut être utilisée
Filtres à seringue Acrodisc avec membrane SuporPall4692Une alternative identique peut être utilisée
Ag/AgCl granulés moulusWPIEP2Une alternative similaire peut être utilisée
Alexa Fluor 546 chèvre anti-poulet IgG (H+L)Thermo ScientificA-11040Une alternative similaire peut être utilisée
Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)Thermo ScientificA27040Une alternative similaire peut être utilisée
Anticorps anti-aquaporine-4Novus BiologicalsNBP1-87679Une alternative similaire peut être utilisée
Anticorps anti GFAPAbcamab4674Une alternative similaire peut être utilisée
Pipettes en verre borosilicaté avec filamentWorld precision instruments1B150F-4
C57BL/6NTacsouris Taconic StockB6Une alternative similaire peut être utilisée
Chlorurede calcium Sigma21108Une alternative identique peut être utilisée
Microscope confocal à balayage laserOlympusFV1000MPEUne alternative similaire peut être utilisée
D-glucoseSigmaG7528Un une alternative peut être utilisée
Phosphate disodiqueSigma255793Une alternative identique peut être utilisée
Extracteur d’électrodes - Modèle P-97SutterP-97Une alternative similaire peut être utilisée
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Une alternative identique peut être utilisée
Héparine sodique injectable (1 000 USP par mL)Sagent Pharmaceuticals400-10Une alternative identique peut être utilisée :
Imaris software (Version 7.6.5)Bitplane Inc.Une alternative similaire peut être utilisée
IsofluoraneHenry Schein Santé animale29404Une alternative identique peut être utilisée
Chlorhydrate de lidocaïne injectable (2 %)Clipper1050035Une alternative identique peut être utilisée
Lucifer Yellow CH dilithiumsalt SigmaL0259
Lucifer Yellow CH dipotassium saltSigmaL0144
Chlorurede magnésium SigmaM8266Une alternative identique peut être utilisée
Couvercle de microscope en verreThermo Scientific24X60-1Une alternative identique peut être utilisée
Lames de microscopeFisher12-544-2Une alternative identique peut être utilisée
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000Une alternative identique peut être utilisée
Objectif (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWUne alternative similaire peut être utilisée
Objectif (60x)OlympusPlanAPO 60XUne alternative similaire peut être utilisée
Pastilles PBS, 100 mLVWRVWRVE404Une alternative identique peut être utilisée
Micromanipulateur à pipette - Modèle ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200Une alternative similaire peut être
utilisé Chlorurede potassium SigmaP3911Une alternative identique peut être utilisée
Bicarbonatede sodium SigmaS5761Une alternative identique peut être utilisée
Chlorure de sodiumSigmaS5886Une alternative identique peut être utilisée
Stimulateur- Modèle Omnical 2010Instruments de précision mondiauxOmnical 2010Une alternative similaire peut être utilisée
Triton X 100SigmaT8787Une alternative identique peut être utilisée
Vibratome- Modèle #3000Pelco100-SUne alternative similaire peut être utilisée

Références

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