Visualisation et analyse du transport intracellulaire d'organites et d'autres cargaisons dans les astrocytes

Résumé

Ici nous décrivons une méthode in vitro de live-imaging pour visualiser le transport intracellulaire des organelles et le trafic des protéines de membrane de plasma dans les astrocytes murines. Ce protocole présente également une méthodologie d'analyse d'image pour déterminer les itinéraires et la cinétique du transport de marchandises.

Résumé

Les astrocytes sont parmi les types de cellules les plus abondants dans le cerveau adulte, où ils jouent des rôles clés dans une multiplicité de fonctions. En tant qu'acteur central de l'homéostasie cérébrale, les astrocytes fournissent aux neurones des métabolites vitaux et tamponnent l'eau extracellulaire, les ions et le glutamate. Composante intégrale de la synapse tri-partite, les astrocytes sont également essentiels à la formation, à l'élagage, à l'entretien et à la modulation des synapses. Pour permettre ces fonctions hautement interactives, les astrocytes communiquent entre eux et avec d'autres cellules gliales, neurones, vascularisation du cerveau et environnement extracellulaire à travers une multitude de protéines membranaires spécialisées qui incluent des cellules molécules d'adhérence, d'aquaporines, de canaux ioniques, de transporteurs de neurotransmetteurs et de molécules de jonction d'écart. Pour soutenir ce flux dynamique, les astrocytes, comme les neurones, s'appuient sur un transport intracellulaire étroitement coordonné et efficace. Contrairement aux neurones, où le trafic intracellulaire a été largement délimité, le transport à base de microtubules dans les astrocytes a été moins étudié. Néanmoins, le trafic exo- et endocytic des protéines de membrane cellulaire et du transport intracellulaire d'organelle orchestre la biologie normale des astrocytes, et ces processus sont souvent affectés dans la maladie ou en réponse aux dommages. Ici, nous présentons un protocole simple à la culture de haute qualité astrocytes murine, à fluorescentétique des protéines astrocytiques et des organites d'intérêt, et d'enregistrer leur dynamique de transport intracellulaire en utilisant la microscopie confocale time-lapse. Nous démontrons également comment extraire et quantifier les paramètres de transport pertinents des films acquis à l'aide du logiciel d'analyse d'image disponible (c.-à-d. ImageJ/FIJI).

Introduction

Les astrocytes sont les cellules les plus abondantes dans le système nerveux central adulte, où ils exécutent des fonctions développementales et homéostatiques uniques¹. Les astrocytes modulent le développement synaptique par le contact direct avec les terminaux pré- et postsynaptiques dans le cadre de la synapse tri-partite, qui contient des récepteurs de neurotransmetteur, des transporteurs, et des molécules d'adhérence de cellules qui facilitent la formation de synapse et la communication neuronale-astrocyte². En outre, les astrocytes contrôlent activement la transmission synaptique et empêchent l'excitotoxicité neuro....

Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l'approbation de l'Université de Caroline du Nord au Chapel Hill Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissection de cerveau et culture des astrocytes primaires de souris

REMARQUE: Le protocole suivant a été adapté à partir de méthodes publiées, qui suit la procédure originale développée par McCarthy et deVellis^13,14,15. Les cultures cellulaires mixtes des astrocytes McCarthy/deVellis (MD) sont préparées à partir des cortices de souris postnatals de jour 2-4 (P2-P4....

Résultats

Le protocole pour établir les astrocytes mD primaires de souris décrits ci-dessus devrait produire des cultures reproductibles et de haute qualité. Bien que les cultures contiennent initialement un mélange d'astrocytes, de fibroblastes et d'autres cellules gliales, y compris les microglies et les oligodendrocytes (figure1Bi,Biv; pointes de flèches rouges), l'ajout d'AraC à la culture mixte entre DIV5-DIV7 minimise la prolifération de ces cellules contaminantes. Le traitement.......

Discussion

Ici, nous décrivons une approche expérimentale pour exprimer, visualiser, et suivre les organites fluorescents marqués et les protéines de membrane d'intérêt utilisant la microscopie vidéo time-lapse dans les astrocytes corticales corticaux primaires de souris de haute pureté de MD. Nous énoncions également une méthodologie de mesure de la dynamique des particules. La visualisation directe de la dynamique des protéines et des organites dans les astrocytes primaires fournit un outil puissant pour étudier la régulation du .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2,5 % Trypsine (10x)	Gibco	15090-046
Centrifugeuse de paillasse	Thermo Scientific	75-203-637	Centrifugeuse Sorvall ST8
Cell Culture Grade Water	Gen Clone	25-511
Microscope de culture cellulaire	Zeiss	WSN-AXIOVERT A1	Vert.A1 Lunette inversée, Microscope de culture tissulaire inversé avec capacités
fluorescentesCytosine Arabinoside	Sigma	C1768-100MG	(AraC) Dissoudre la poudre lyophilisée dans de l’eau stérile de qualité culture cellulaire pour former un stock de 10 mM, aliquote et congélation pour un stockage à long terme
DAPI	Sigma	D9542-5MG	Dissoudre la poudre lyophilisée dans de l’eau désionisée à une concentration maximale de 20 mg/ml, chauffer ou sonicate si nécessaire. Utilisation à 300 nM pour la contre-coloration.
Microscope de dissection	Zeiss		Stemi 305
Ciseaux de dissection	F.S.T	14558-09
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Sérum de bovin fœtal	Gemini	100-106	Inactivé par la chaleur
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Pince à épiler à pointe fine	F.S.T	11254-20	Style #5
Source lumineuse à fluorescence	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
GFAP	anticorps Signalisation cellulaire	3670S	GFAP (GA5) souris Anticorps monoclonal
Plats à fond en verre	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Plat 35 mm | N° 1.5 Recouvrement | Diamètre du verre de 14 mm |
Pince Graefe non	F.S.T	11054-10	Pince à iris Graefe à pointes incurvées
Colorant fluorescent vert qui colore les compartiments acides (endosomes tardifs et lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Vert DND 26. Pré-dissous dans du DMSOS dans une solution mère de 1 mM. Diluer jusqu’à la concentration de travail finale dans le milieu de culture ou le tampon de votre choix.
Solution saline équilibrée Hank’s (10x)	Gibco	14065-056	Sans magnésium ni calcium
Supports d’imagerie Life	Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Microscope confocal inversé	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Réactif Life Technologies	11514015	Plus Réactif
lipofection	Life Technologies	15338100	Réactif de lipofectamine LTX
Incubateur à agitation orbitale	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , incubateur à agitation orbitale avec contrôle de la température et de la vitesse
Solution de pénicilline/strépomycine (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphate salin tamponné (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromure	Sigma	P7405	Dissoudre dans un tampon Tris, pH 8,5, à 1 mg/mL. Congeler pour un stockage à long terme. Éviter les cycles de congélation et de décongélation
Milieu sérique réduit	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Flacons de culture tissulaire	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. Accès au col incliné à 100 %, capuchon filtrant ventilé hydrophobe de 0,22 um
Incubateur de culture tissulaire	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, incubateur de culture tissulaire avec contrôle de
la température, de l’humidité et du CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissous dans un litre dans l’eau avec 4.829 g Tris HCl pour faire 0,1 M tampon Tris, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissous dans un litre dans l’eau avec 8.402 g Base Tris pour faire 0,1 M tampon Tris, pH 8.5
Trypsine-EDTA (0.25 %), rouge de phénol	Gibco	25200072
Systèmes de filtration sous vide	Olympus Plastics	25-227	500 ml, membrane PES, 0,22 & micro ; m
Vannas ciseaux droits	Roboz	RS-5620

revêtue de